梁 杰，吳慧敏

（1.張家口市宣化區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河北 張家口 075000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，河北 保定 071001）

抗生素是一種以低濃度影響其他生物各項性能的化學(xué)物質(zhì)，是細菌或其他微生物的代謝產(chǎn)物，也可人工合成?？股啬軌蛞种萍毦L并殺死細菌，因此被廣泛應(yīng)用于各方面。在飼料中添加抗生素可以抑制腸道內(nèi)病原體的繁殖生長，也可以預(yù)防和減少疾病的發(fā)生[1]。但過多添加抗生素會讓細菌產(chǎn)生抗性。現(xiàn)如今，濫用抗生素的問題已經(jīng)嚴(yán)重影響并制約畜牧行業(yè)的發(fā)展。畜禽對疾病的抵抗力大幅降低，致病菌的耐藥性則不斷增強，如果疾病復(fù)發(fā)只能使用級別更高、更大劑量的抗生素，如此形成惡性循環(huán)，對畜禽的健康以及畜舍周圍的環(huán)境造成惡劣的影響。而奇異變形桿菌是人獸共患的病原體，近幾年來臨床上出現(xiàn)許多耐藥菌株并且其耐藥性也逐漸增加，使臨床治療的任務(wù)變的更加艱巨[2]。由于國內(nèi)與國際上對于添加抗生素的要求愈發(fā)嚴(yán)格及大眾認(rèn)識的日益提高，使得抗生素替代品的研究與開發(fā)越來越受到科研人員的重視。研究表明，許多中草藥提取物對抑制奇異變形桿菌生長都有較好的效果[3]。

綠原酸是一種縮酚酸，由奎尼酸與咖啡酸形成，是植物體有氧呼吸的天然產(chǎn)物，具有生物活性[4-5]。其在高等雙子葉植物和蕨類植物中普遍存在，尤其是金銀花、杜仲等中草藥中含量較高。在對原材料不造成有害作用的情況下，對多種腐敗菌都有一定的抑制效果，除此之外還有抗病毒、抗氧化等重要作用[6]。這讓綠原酸成為了備受關(guān)注的防腐添加劑的替代品。

三羥基黃酮是傳統(tǒng)中藥黃芩的主要成分，主要存在于唇形科植物黃芩的根、紫葳科植物木蝴蝶的種子、莖皮中[7]。近十幾年來，許多研究和文獻都說明三羥基黃酮具有顯著的抑菌效果，以及抗氧化、抗輻射等多種作用，同時可以調(diào)節(jié)某些疾病，使得黃酮類化合物越來越受到學(xué)者們的青睞，被認(rèn)為是抗生素替代品的最佳候選者之一。

關(guān)于三羥基黃酮和綠原酸在動物飼料添加方面的研究很少，因此，本試驗研究綠原酸和三羥基黃酮的抑菌效果和最佳的抑菌濃度，篩選合適的抗生素替代品。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗菌種

奇異變形桿菌（CMCCB 49005）凍干菌粉，購于北納微生物細胞管理中心。

1.1.2 試驗材料

綠原酸、三羥基黃銅：市售。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

水浴恒溫振蕩器（DSHG-300A）；可見分光光度計（722 型）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9240MBE）；生化培養(yǎng)箱（SPX-250B-Z 型）；潔凈工作臺（SWCJ-1B）；螺旋振蕩器（QL-861）；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-50KBS）；酶標(biāo)儀（ELx800）；分析天平（BS210S）；數(shù)顯游標(biāo)卡尺；玻璃培養(yǎng)皿；微波爐；冰箱；96孔板。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗準(zhǔn)備

在使用潔凈工作臺時提前開啟紫外燈30 min進行滅菌，進入工作臺前需戴一次性口罩和一次性手套，進入后使用75%酒精棉球進行手部消毒。試驗材料需進行高壓滅菌后使用。為盡量減少試驗的誤差，所有操作均在工作臺中完成。

1.2.2 平板培養(yǎng)基及斜面培養(yǎng)基的制備

平板培養(yǎng)基：待上述配置好且已經(jīng)過滅菌后的固體培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃后，在潔凈操作臺中分別倒入一次性培養(yǎng)皿中，15～20 mL 即可，然后水平放置。

斜面培養(yǎng)基：將上述備用的培養(yǎng)基分別倒入試管中，塞入松緊適宜的棉塞。試管規(guī)格為15×150 mm，其容量為5 mL，倒入培養(yǎng)基的體積約為試管的1/4。將分裝好的試管進行滅菌，結(jié)束后等溫度降至50 ℃時取出。將試管頂端置于高度為1 cm 的物體上，試管內(nèi)的液體會自然傾斜，凝固之后就制成斜面培養(yǎng)基，低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 菌種的活化

在潔凈工作臺中，使用75%酒精棉球?qū)龈删N管外壁進行擦洗消毒，稍干。使用酒精燈將菌種管的上端加熱，用滴管吸取少許液體培養(yǎng)基，滴到菌種管上端加熱處，使得管壁淬火而破裂。在凍干管中加入液體培養(yǎng)基0.5 mL，用移液槍吹吸混勻后全部吸出再注入到液體培養(yǎng)基，搖勻。分別吸取菌混懸液200 μL 于兩平板培養(yǎng)基表面，均勻涂至有阻力感即可。將平板放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，溫度設(shè)為37 ℃。

1.2.4 菌種的傳代

采用劃線法把初次活化后的菌種通過接種環(huán)接種到平板上，倒置放于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，連續(xù)培養(yǎng)2～3 代。選擇培養(yǎng)基上長勢較好的菌落，接種在斜面上，低溫保存。

1.2.5 混懸液的制備

菌種活化后，用接種環(huán)挑取適量菌種于200 mL液體培養(yǎng)基中，在120 r·min-1，37 ℃條件下放入水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)約3 h。制成600 nm處OD值是0.1～0.2，濃度約為105cfu·mL-1的菌混懸液備用。

1.2.6 供液試液的配置

營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基（NA）：準(zhǔn)確稱取固體培養(yǎng)基9.9 g 置于錐形瓶中，倒入蒸餾水300 mL，攪拌至固體溶解后，使用微波爐加熱，煮沸，然后放入121 ℃的滅菌鍋內(nèi)進行滅菌，20 min 后取出備用。

營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基（NB）：準(zhǔn)確稱取液體培養(yǎng)基5.4 g 于錐形瓶，倒入300 mL 蒸餾水，攪拌且完全溶解后開始滅菌，步驟同上。

稱取三羥基黃酮、綠原酸各4 g，分別溶于乙醇、丙酮中，得到200 mg·mL-1的藥液，再用相應(yīng)的溶劑對上述溶液按一定梯度進行稀釋，每種藥液得到100、50、10、5、1、0.5 和0.1 mg·mL-17個濃度梯度的供試藥液?？瞻讓φ諡楦髯韵鄳?yīng)的溶劑。

1.2.7 抑菌活性的測定

待已滅菌的NA培養(yǎng)基溫度降至約50 ℃，加入體積與1%的培養(yǎng)基相同的試驗菌，充分混勻，40 ℃時倒入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿約30 mL，放入冰箱4 ℃保藏1 h，待其凝固，得到指示菌培養(yǎng)平板。凝固后，用鑷子夾取已滅過菌的牛津杯，在酒精燈上加熱至微熱后，垂直放置在制備好的平板上，每個平板放3個即可。等待5～10 min，使牛津杯冷卻，依次在牛津杯中加入不同濃度的藥液40 μL。每個濃度分別做3 個重復(fù)，在恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃條件下培養(yǎng)18 h，有明顯抑菌圈的測量其大小，并計算直徑的平均值。直徑越大表明藥液對細菌的抑制效果越好。

1.2.8 最低抑菌濃度的測定（微量肉湯稀釋法）

向96孔板的各個孔中加入NB液體培養(yǎng)基（第1孔160 μL，第11 孔100 μL，其余各孔為90 μL），使用微量肉湯稀釋法，在第1 孔至第10 孔加入已配制好的供試藥液，11、12 孔不加藥液作為空白對照（配制藥液濃度為5 mg·mL-1，用移液槍吸取40 μL藥液加入第1孔中，吹吸混勻，再吸出90 μL加入第2孔中。按同樣的方法，依次在前1個孔混勻后，吸取90 μL 加到后1 個孔中，直到第10 孔。在第1孔和第10孔混勻后，分別吸取20和90 μL丟棄，使各孔體積分別為90 μL）。而后，在第1～10孔及12 孔中加入濃度為106cfu·mL-1的奇異變形桿菌菌液，第11 孔中不加，此時每個孔中的菌的濃度為105cfu·mL-1。每種藥物設(shè)3 個重復(fù)，并做一組避免藥物顏色干擾的對照，方法同前幾組相同，只是用生理鹽水代替菌液，以保證體積相同。各孔加好后體積均為100 μL，隨后將96 孔板放入恒溫培養(yǎng)箱，37 ℃條件下培養(yǎng)22 h。然后，用酶標(biāo)儀測定各孔的OD值，波長設(shè)定為630 nm，與對照組進行比較，計算在不同的濃度下細菌生長的百分?jǐn)?shù)，再換算為細菌生長的抑制率，當(dāng)細菌生長的百分?jǐn)?shù)＜20%時，此濃度即為藥液的最低抑菌濃度。細菌生長百分?jǐn)?shù)和細菌生長抑制率計算公式見式1～2。

細菌生長百分?jǐn)?shù)=（某濃度含藥孔吸光度的OD值-藥物顏色對照孔OD 值的平均值-無菌孔OD 值的平均值）/（無藥細菌生長對照孔OD 值的平均值-無菌孔OD值的平均值） （1）

細菌生長抑制率=1-細菌生長百分?jǐn)?shù) （2）

2 試驗結(jié)果

2.1 三羥基黃酮對奇異變形桿菌的抑菌效果

三羥基黃酮對奇異變形桿菌的抑菌效果見表1。

表1 三羥基黃酮對奇異變形桿菌的抑菌效果

由表1可知，三羥基黃酮對奇異變形桿菌的抑制效果在試驗濃度200 mg·mL-1時達到最佳，抑菌圈的直徑約23.53 mm，在試驗濃度為0.1 mg·mL-1時效果最弱，抑菌圈直徑約13.36 mm。在濃度為200、100、50 以及20 mg·mL-1時，抑菌圈直徑均＞20 mm，屬極度敏感；濃度為10、5 mg·mL-1時，抑菌圈直徑＞15 mm，屬高度敏感；濃度為0.5、0.1 mg·mL-1時，抑菌圈直徑＞10 mm，屬中度敏感。

2.2 綠原酸對奇異變形桿菌的抑菌效果

綠原酸對奇異變形桿菌的抑菌效果見表2。

表2 綠原酸對奇異變形桿菌的抑菌效果

由表2可知，綠原酸對奇異變形桿菌生長的抑制效果隨著試驗濃度增加而加強，到200 mg·mL-1時抑菌圈的直徑為16.74 mm。在濃度為200、100、50 mg·mL-1時，抑菌圈直徑均＞15 mm，屬高度敏感；其余濃度抑菌圈的直徑均＞10 mm，屬中度敏感。

2.3 兩種藥液對奇異變形桿菌的最低抑菌濃度

綠原酸溶液和三羥基黃酮溶液對奇異變形桿菌的MIC的測定見表3～4。

表3 綠原酸溶液對奇異變形桿菌的MIC的測定

表4 三羥基黃酮溶液對奇異變形桿菌的MIC的測定

由表3 和表4 可知，綠原酸對奇異變形桿菌最低的抑菌濃度為0.2 mg·mL-1，三羥基黃酮對奇異變形桿菌最低的抑菌濃度為0.125 mg·mL-1。

3 討 論

研究表明，綠原酸是具有生物抑菌作用的天然防腐劑，也是一些傳統(tǒng)中藥的有效抗菌成分之一。周志娥等認(rèn)為，綠原酸的分子極性較強，對大分子物質(zhì)的親和力較高，可結(jié)合于細菌膜表面并使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，增大細胞膜的選擇透過性，破壞細胞完整性，導(dǎo)致細菌體內(nèi)核苷酸、酶等物質(zhì)部分外泄，從而影響蛋白質(zhì)的合成[8]。陳明光等研究認(rèn)為金銀花的主要成分為綠原酸[9]。謝新芳等利用金銀花不同溶劑提取物對奇異變形桿菌做了抑菌實驗，乙醇提取物的最低抑菌濃度為15.6 mg·mL-1，藥液濃度為62.5 mg·mL-1時抑菌圈直徑＞20 mm，水提取物的最低抑菌濃度為31.25 mg·mL-1，藥液濃度在31.3 mg·mL-1出現(xiàn)抑菌圈[10]。上述研究結(jié)果均表明，綠原酸對奇異變形桿菌具有抑制作用。本試驗中最低抑菌濃度為0.2 mg·mL-1，藥液濃度在0.1 mg·mL-1時有抑菌效果，與上述文獻的研究結(jié)論一致，但數(shù)據(jù)相差較大，原因可能為本試驗所用綠原酸純度為45%，不含其他物質(zhì)，而謝新芳等用的是提取液，可能含有其他抑菌類物質(zhì)。

三羥基黃酮作為黃芩的重要組成成分之一，抑菌活性良好。許云華等認(rèn)為，三羥基黃酮的抑菌機理主要由其化學(xué)結(jié)構(gòu)決定，黃酮芳環(huán)上羥基的位置和個數(shù)影響了三羥基黃酮的抑菌活性[11]。黃芩作為抗菌藥物應(yīng)用范圍較廣，且對部分病毒有防治作用。張洺嘉等研究結(jié)果證明，黃芩素對細胞膜的形成具有較強的抑制作用[12]。Basile 等研究結(jié)果顯示，黃酮類化合物對奇異變形桿菌最低的抑菌濃度是0.016 mg·mL-1[13]。趙香汝等采用紙片擴散法測定了多種中藥對奇異變形桿菌及其他細菌的抑制效果，其中黃芩對奇異變形桿菌的抑菌圈為8 mm，最低抑菌濃度為7.8 mg·mL-1[14]。而本研究結(jié)果顯示，藥液濃度為0.1 mg·mL-1時有抑菌效果，抑菌圈的直徑為13.36 mm，最低抑菌濃度為0.125 mg·mL-1，與上述文獻的研究結(jié)果相似。

4 結(jié) 論

綠原酸對奇異變形桿菌有較好的抑菌效果。在本試驗濃度梯度中，濃度為200 mg·mL-1時效果最好，抑菌圈的直徑為16.74 mm，并且最低抑菌濃度為0.2 mg·mL-1。三羥基黃酮對奇異變形桿菌有較好的抑菌效果。在本試驗濃度梯度中，濃度為200 mg·mL-1時效果最好，抑菌圈的直徑為23.53 mm，并且最低抑菌濃度為0.125 mg·mL-1。