付紅艷，王義勇，張科東，周鳳

肺癌已成為多數(shù)國家惡性腫瘤死亡的首要原因，非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）是肺癌的一種常見類型［1］，發(fā)病隱匿，多數(shù)患者診療時已屬于晚期，無手術(shù)治療指征［2］。因此尋找非小細(xì)胞肺癌相關(guān)的分子標(biāo)志，以便預(yù)測腫瘤進(jìn)展情況，進(jìn)而早期診斷、早期治療對于改善患者預(yù)后尤為重要［3］。黏蛋白1（MUC1）是一種主要分布于器官上皮細(xì)胞近管腔或腺腔面的跨膜糖蛋白，可介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附［4］。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中MUC1的表達(dá)與乳腺癌的分化程度及臨床分期存在相關(guān)性［5］。但是關(guān)于MUC1表達(dá)在NSCLC中的研究較少。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法及免疫組織化學(xué)染色法檢測NSCLC患者血清及癌組織中MUC1蛋白的表達(dá)，分析其表達(dá)水平與NSCLC臨床特征的關(guān)系，進(jìn)一步明確其在NSCLC患者臨床早期診斷及治療中的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年12月—2018年12月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院普胸外科和呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的119例患者為研究對象。根據(jù)病理類型分為肺鱗癌組34例，其中男29例，女5例，高分化5例，低中分化29例，Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期16例；肺腺癌組65例，其中男38例，女27例，高分化15例，低中分化50例，Ⅰ～Ⅱ期35例，Ⅲ～Ⅳ期30例；非肺癌組20例，其中男10例，女10例，肺炎性假瘤5例，肺良性結(jié)節(jié)4例，肺結(jié)核3例，肺硬化性血管瘤2例，干燥綜合征2例，良性腫瘤4例，此類患者均高度懷疑肺部惡性腫瘤，經(jīng)術(shù)中病理檢查排除。所有患者入院后空腹采集外周靜脈血后分離血清，手術(shù)時或支氣管鏡檢查時切除肺癌組織和正常肺組織，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。病理分化程度按照WHO病理分化標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期按照國際第八版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 所有納入患者均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為NSCLC和肺部良性病變，排除存在氣道炎癥的肺部疾病如肺炎、哮喘、慢性阻塞性肺疾病等，排除心、肝、腎等器官功能衰竭患者，排除既往其他類型腫瘤病史患者。所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書，研究方案獲得醫(yī)院倫理道德委員會批準(zhǔn)（倫理編號：2018-288）。

1.3主要試劑 MUC1兔抗人單克隆抗體購自美國Affinity公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自美國Abbkine公司；人MUC1酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒購自上海寶曼生物科技有限公司，酶標(biāo)儀（型號ELx800）購自BIO-TEK公司，電子顯微鏡購自日本Olympus公司，低溫離心機(jī)購自德國Sigma公司。

1.4方法

1.4.1ELISA檢測各組血清MUC1蛋白水平 將收集到的血清標(biāo)本嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。將標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本孔加入待測樣本血清10μL，再加血清稀釋液40μL；標(biāo)準(zhǔn)孔及樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的MUC1抗體100μL，封閉后37℃恒溫箱溫育60 min后洗滌5次。每孔繼續(xù)加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15 min。每孔加入終止液50μL，10 min后，用酶標(biāo)儀測定各孔在450 nm波長下的光密度（OD）值。

1.4.2HE染色 將收集的肺組織標(biāo)本經(jīng)二甲苯固定、石蠟包埋，并進(jìn)行連續(xù)切片，厚度為3μm，切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ各脫蠟10 min后，依次放入100%、95%、85%、70%乙醇各5 min，經(jīng)蒸餾水沖洗后轉(zhuǎn)入蘇木素染液染色1～2 min，用分化液分化數(shù)秒后流水沖洗2 s，返藍(lán)液返藍(lán)數(shù)秒至細(xì)胞核呈藍(lán)色后流水沖洗10 min，繼而入伊紅染色液10 min，再次流水沖洗后，依次放入70%、85%、95%、100%乙醇各5 min脫水后經(jīng)二甲苯透明2次，每次約5 min，最后經(jīng)中性樹膠封固，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

1.4.3免疫組織化學(xué)染色 將肺組織切片經(jīng)二甲苯脫蠟、濃度梯度乙醇至蒸餾水水化，再經(jīng)3%甲醇雙氧水室溫孵育20 min消除內(nèi)源性酶，高壓修復(fù)之后放入PBS洗3次，每次5 min，滴加MUC1兔抗人一抗（1∶50），次日再次放入PBS洗3次，每次5 min，切片上滴加二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗，37℃避光20 min后，放入PBS洗3次，每次5 min，滴加DAB染液顯色5～10 s，水洗終止顯色，最后經(jīng)蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片、顯微鏡下隨機(jī)讀取5個高倍視野對陽性細(xì)胞比例和染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量測定。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：0分（未著色），1分（橘黃色），2分（棕黃色），3分（黃褐色）。陽性細(xì)胞所占比例評分標(biāo)準(zhǔn)：0分（＜5%），1分（5%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（＞75%）。2種評分相加總分＜2分為陰性，≥2分為陽性。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 19.0軟件對采集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，計數(shù)資料均以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。受試者工作特征（ROC）曲線用于分析血清MUC1蛋白對不同類型NSCLC診斷價值，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.13組患者血清MUC1蛋白表達(dá)水平比較 肺鱗癌組、肺腺癌組、非肺癌組血清中MUC1蛋白的表達(dá)水平分別為（35.70±9.17）U/mL、（37.08±10.24）U/mL、（26.83±2.93）U/mL，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.775，均P＜0.05）；肺鱗癌組、肺腺癌組血清MUC1蛋白表達(dá)水平均高于非肺癌組，而肺鱗癌組、肺腺癌組血清MUC1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2血清MUC1蛋白對不同類型NSCLC的診斷效能分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清MUC1蛋白診斷肺鱗癌的ROC曲線下面積（AUC）為0.774（95%CI：0.651～0.896），以MUC1蛋白＞33.23 U/mL為陽性臨界值，其診斷敏感度為52.94%，特異度為100%，見圖1A。血清MUC1蛋白診斷肺腺癌的AUC為0.785（95%CI：0.690～0.880），以MUC1蛋白＞31.31 U/mL為臨界值，其診斷敏感度為61.54%，特異度為95%，見圖1B。

Fig.1 ROC curve of serum MUC1 protein in diagnosis of different types of NSCLC圖1 血清MUC1蛋白診斷不同類型NSCLC的ROC曲線

2.3不同類型NSCLC癌組織病理表現(xiàn) HE染色結(jié)果顯示，肺鱗癌細(xì)胞多呈巢狀分布，中央分布環(huán)狀紅染的角化物，見圖2A；肺腺癌細(xì)胞多呈小條索狀排列，形成腺管樣結(jié)構(gòu)，見圖2B。

Fig.2 Different types of NSCLC cancer tissue under HE staining(×200)圖2 不同類型NSCLC癌組織經(jīng)HE染色（×200）

2.4MUC1蛋白在不同類型NSCLC組織中的表達(dá)情況 MUC1蛋白主要在胞質(zhì)及胞膜中表達(dá)，陽性顆粒呈棕黃色或黃褐色分布，見圖3。肺鱗癌組癌組織中MUC1蛋白陽性率為64.71%（22/34），肺腺癌組癌組織中MUC1蛋白陽性率為73.85%（48/65），非肺癌組肺組織中MUC1蛋白陽性率為5%（1/20），肺鱗癌及肺腺癌組癌組織中MUC1蛋白的陽性表達(dá)率均高于非肺癌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2分別為18.36、29.69，均P＜0.017），而肺鱗癌組、肺腺癌組癌組織中MUC1蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.90，P＞0.05）。

Fig.3 Expression of MUC1 protein in different types of NSCLC cancer tissues(×400)圖3 MUC1蛋白在不同類型NSCLC癌組織中的表達(dá)（×400）

2.5MUC1蛋白表達(dá)與不同類型NSCLC臨床特征的關(guān)系 肺鱗癌組中不同性別、年齡、分化程度、TNM分期分組患者血清及癌組織MUC1蛋白陽性表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。肺腺癌組中-低組織分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組患者血清及癌組織的MUC1蛋白陽性表達(dá)率分別高于高組織分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組（P＜0.05）；而不同性別、年齡分組患者血清及癌組織MUC1蛋白陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

Tab.1 The relationship between the expression of MUC1 protein and the clinical characteristics of lung squamous cell carcinoma表1 MUC1蛋白表達(dá)與肺鱗癌臨床特征的關(guān)系 例（%）

3 討論

我國每年新增約65.3萬例肺癌患者，其中NSCLC患者占到了80%以上［6］。自靶向藥物出現(xiàn)以來，NSCLC的治療取得了一定的進(jìn)展［7］，但由于臨床中早期預(yù)測、診斷NSCLC的手段有限，導(dǎo)致NSCLC患者遠(yuǎn)期生存改善并不明顯。MUC1是分布于機(jī)體各種上皮表面的高度糖基化的糖蛋白，可介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞黏附功能等［8］。Ma等［9］研究發(fā)現(xiàn)，MUC1的高表達(dá)與唾液腺腺泡細(xì)胞癌組織學(xué)類型、病變部位、頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示與唾液腺腺泡細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。Jing等［5］研究發(fā)現(xiàn)，MUC1的過度表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后不良相關(guān)，并與MUC1啟動子甲基化狀態(tài)有關(guān)，提示可能是乳腺癌的潛在預(yù)后因素和治療靶點(diǎn)。Li等［10］研究發(fā)現(xiàn)MUC1高表達(dá)與結(jié)直腸癌壞死、分期、浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后不良和生存結(jié)局。這些研究表明MUC1在腺上皮來源的腫瘤中存在高表達(dá)，且與不同腺上皮來源腫瘤的預(yù)后存在相關(guān)性，提示MUC1在NSCLC中可能存在高表達(dá)，且與其惡性程度及不良預(yù)后可能存在一定相關(guān)性。本研究中，ELISA和免疫組化染色結(jié)果顯示肺腺癌組患者血清及癌組織中MUC1蛋白的表達(dá)水平均高于非肺癌組。肺腺癌組內(nèi)中-低組織分化、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期組患者血清及癌組織MUC1蛋白陽性表達(dá)率高于高組織分化、TNM分期Ⅰ～Ⅱ期組，提示MUC1蛋白在腺上皮來源的肺腺癌進(jìn)展中起到一定作用，高水平的MUC1蛋白表達(dá)可能提示肺腺癌惡性程度及預(yù)后不良，與上述研究結(jié)果基本一致。肺鱗癌組患者血清及癌組織中MUC1蛋白的表達(dá)水平同樣高于非肺癌組，但肺鱗癌組患者血清及癌組織的MUC1蛋白陽性表達(dá)率與不同分化程度、TNM分期無明顯關(guān)系，提示MUC1蛋白在鱗狀上皮來源的肺鱗癌中也存在一定的表達(dá)，但無法預(yù)測肺鱗癌惡性程度及預(yù)后不良。

Tab.2 The relationship between expression of MUC1 protein and clinical characteristics of lung adenocarcinoma表2 MUC1蛋白表達(dá)與肺腺癌臨床特征的關(guān)系 例（%）

本研究中采用ROC曲線分析血清MUC1蛋白對不同類型NSCLC診斷價值，發(fā)現(xiàn)MUC1蛋白診斷肺鱗癌、肺腺癌具有中等診斷效率（AUC分別為0.774、0.785），提示血清中MUC1蛋白表達(dá)水平的高低可能成為NSCLC的非侵入性生物標(biāo)志物，可用于NSCLC早期檢測，但MUC1蛋白診斷肺鱗癌的敏感度低于60%，而其診斷肺腺癌敏感度大于60%，可能原因為MUC1蛋白在腺上皮來源的腫瘤中存在更高表達(dá)，而肺鱗癌為鱗狀上皮來源的腫瘤，同時與檢測樣本中鱗癌數(shù)目較少可能也有一定關(guān)系。

綜上所述，NSCLC患者血清及癌組織中MUC1蛋白呈高表達(dá)，高水平的MUC1蛋白表達(dá)提示肺腺癌惡性程度及預(yù)后不良，可用于預(yù)測肺腺癌早期臨床診斷，但對肺鱗癌惡性程度及預(yù)后不良預(yù)測意義有限。本研究的局限性在于只檢測了MUC1蛋白在NSCLC血清及癌組織中表達(dá)異常，不足以完全解釋MUC1與NSCLC發(fā)生發(fā)展及侵犯、轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，有待于今后在細(xì)胞、基因水平進(jìn)行更深層次的研究。