王 佳，毛 妮，謝 希，李 姝，陳進(jìn)偉

中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，長(zhǎng)沙 410011

類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性侵蝕性關(guān)節(jié)炎為主要特征的高致殘性自身免疫性疾病，目前治療藥物主要包括非甾體抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)和緩解病情抗風(fēng)濕藥(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)，后者又可分為傳統(tǒng)合成DMARDs、生物DMARDs和靶向合成DMARDs。臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)，雖然經(jīng)過(guò)正規(guī)早期聯(lián)合多種DMARDs藥物治療，仍有部分RA患者療效不佳；或者隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，藥物療效逐漸減弱，患者對(duì)治療藥物無(wú)反應(yīng)或低反應(yīng)。這些現(xiàn)象的發(fā)生被認(rèn)為與多藥耐藥的形成有關(guān)。多藥耐藥是細(xì)胞在接觸一種藥物后，不但對(duì)該藥物耐受，而且對(duì)其他多種結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不相關(guān)的藥物耐受的現(xiàn)象[1-2]。這種現(xiàn)象普遍存在于腫瘤性和炎癥性疾病中，最近愈來(lái)愈多的證據(jù)顯示多藥耐藥是RA及系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病治療失敗的主要原因。

多藥耐藥的一個(gè)重要機(jī)制是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的藥物排出增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低。而由多藥耐藥基因-1(multidrug resistance gene-1，MDR1)所編碼的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)是其中最重要的一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能夠阻止藥物流入，促進(jìn)藥物排出，使得細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)性降低，產(chǎn)生耐藥。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，難治性RA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)中P-gp表達(dá)水平顯著增高，且P-gp的表達(dá)水平與RA患者的氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)治療持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)[3]。本研究將通過(guò)生物轉(zhuǎn)基因方法，在體外利用腺病毒將MDR1基因轉(zhuǎn)染到RA患者FLS中，構(gòu)建高表達(dá)MDR1的FLS，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證MDR1基因表達(dá)水平與RA耐藥的關(guān)系，以及P-gp外排MTX的功能。

材料和方法

樣本來(lái)源2011年8月至2012年7月在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院住院并行關(guān)節(jié)置換術(shù)的RA患者5例，其中，男2例，女3例，年齡分別為44、54、58、60、66歲，病程分別為60、72、84、144、180個(gè)月，收集5例RA患者的關(guān)節(jié)滑膜組織。本研究經(jīng)中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。本研究RA的診斷參照1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的RA分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[4]。

材料Ad-EGFP-MDR1重組腺病毒粗提液[5]由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所惠贈(zèng)，Ad-EGFP空病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因提供；鼠抗人CD68單抗、鼠抗人Vmientin單抗、兔抗人P-gp抗體購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司，小鼠抗人β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗小鼠二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司；MTX、羅丹明123購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，RevertAidTMH Minus First Strand cDNA Synthesis Kit、Deoxyribonuclease Ⅰ(DNase Ⅰ)、RiboLockTMRibonuclease Inhibitor、RevertAidTMH Minus Reverse Transcriptase、PageRuler Prestained Protein Ladder購(gòu)自加拿大Fermentas公司，SYBR GreenPCR Master Mix和SYBR GreenPCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)ABI公司，Adeno-XTMVirus Purification Kit購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，Trizol Reagent購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

RA FLS的原代培養(yǎng)及鑒定無(wú)菌條件下分離RA滑膜組織，并剪碎至1 mm3大小后，用2～3倍體積比的Ⅰ型膠原酶消化液及少量0.25%胰蛋白酶/EDTA溶液避光消化4 h，經(jīng)200目細(xì)胞過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾后300×g離心5 min，棄上清，加入適量PBS吹打混勻后300×g離心5 min，棄上清，加入15%的完全培養(yǎng)基混勻，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)覆蓋至培養(yǎng)瓶底面80%～90%后傳代。取細(xì)胞培養(yǎng)物將其制成細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，并接種至12孔培養(yǎng)板孔內(nèi)，密度為2×104個(gè)/ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，使之長(zhǎng)成單層細(xì)胞后，采用HE染色法觀(guān)察其形態(tài)呈梭形或柱狀，細(xì)胞核呈卵圓形位于細(xì)胞中央，核仁明顯；免疫組織化學(xué)方法觀(guān)察波形蛋白(Vimentin)染色陽(yáng)性，CD68染色陰性，即為RA FLS。繼續(xù)傳代直至第3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

重組腺病毒感染RA FLS將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RA FLS分別制成細(xì)胞懸液，取相同體積吹打混勻后，將其接種于6孔板中，密度為(3～5)×103個(gè)/ml，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使其融合率達(dá)到30%～50%。用已純化的滴度為109PFU/ml的重組腺病毒Ad-EGFP-MDR1以感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=100感染細(xì)胞。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，用陰性病毒同樣以MOI=100感染細(xì)胞。72 h后收集兩組細(xì)胞。

Real-time PCR檢測(cè)MDR1基因的表達(dá)待重組腺病毒及陰性病毒感染的兩組RA FLS生長(zhǎng)至完全融合后，取出6孔板置于冰上，清洗后每孔加入1 ml Trizol裂解，細(xì)胞脫壁后加入0.2倍體積的氯仿，震蕩15 s后于4℃ 12 000×g離心15 min，將水樣層移至Ep管中，并加入0.5倍體積的異丙醇，混勻低溫靜置15 min，于4℃ 12 000×g離心10 min，棄上層懸液，加入1 ml 75%乙醇洗滌，4℃ 7500×g離心5 min后棄上清，適度干燥RNA沉淀后，加入適量無(wú)RNase的水，使RNA完全溶解，于4℃ 900×g離心20 s。檢測(cè)RNA純度和濃度，鑒定其質(zhì)量。將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，Real-time PCR法檢測(cè)MDR1 mRNA表達(dá)變化。PCR反應(yīng)程序：95℃，10 min；95℃，15 s；60℃，1 min；共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)中設(shè)置陰性平行對(duì)照組，共重復(fù)3次。采用Delta-delta Ct法來(lái)分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量[6]。PCR引物：(1)MDR1：正向：CCGTGGCAA-ACTGGTACTTT；反向：GACGCCAACATAGACCACCT；長(zhǎng)度188 bp。(2)β-actin：正向：GTGGACATCCGCAAAGAC；反向：AAAGGGTGTAACGCAACTA；長(zhǎng)度106 bp。

Western-blot法檢測(cè)P-gp的表達(dá)待重組腺病毒及陰性病毒感染的兩組RA FLS生長(zhǎng)至完全融合后，取出6孔板置于冰上，清洗后每孔加入200 μl的裂解液，冰上裂解20 min，將裂解后產(chǎn)物于4℃ 12 000×g離心10 min，將上清液分裝至Ep管，20 μl/管，每管加入5 μl 5×loading buffer，于99.9℃ 變性10 min得到總蛋白。用BCA法測(cè)定樣本蛋白濃度。取20 μl總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離目標(biāo)蛋白。P-gp 300 mA恒流120 min，β-actin 300 mA恒流90 min，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜。采用5% BSA室溫封閉60 min。將一抗用含5% BSA的TBST溶液按照1∶2000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。之后用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min。將二抗用TBST按照1∶2000稀釋?zhuān)覝叵路跤?0 min后，用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次，每次10 min。采用ECL化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行顯像和圖像采集。利用軟件進(jìn)行吸光度分析，根據(jù)所得目的蛋白與內(nèi)參β-actin的吸光度比值進(jìn)行分析。

羅丹明123實(shí)驗(yàn)收集各組細(xì)胞1×106，重懸于含10 μg/ml羅丹明的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 min后，300×g離心5 min，棄上清，洗滌備用。取部分細(xì)胞中加入1 ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，60 min后熒光顯微鏡下觀(guān)察；另一部分細(xì)胞重懸于1ml預(yù)冷的PBS中，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Rh123熒光強(qiáng)度(λ=488 nm、λ=525 nm)，測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞內(nèi)Rh123熒光強(qiáng)度，分析時(shí)設(shè)門(mén)以除去細(xì)胞脆片和細(xì)胞團(tuán)塊對(duì)測(cè)定的干擾[7-8]。

MTT法檢測(cè)MDR1高表達(dá)RA FLS對(duì)MTX的耐藥性將兩組細(xì)胞分別接種在96孔板，100 μl/孔(約1×104)，置37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。按照最佳感染濃度加入適量病毒感染48 h后，分別用等量的0.5、1、5、10、50 μmol/L MTX干預(yù)細(xì)胞，使終體積維持在200 μl/孔，每個(gè)濃度設(shè)5～8個(gè)孔，并設(shè)置陰性病毒對(duì)照組、陰性對(duì)照組(不用藥物干預(yù))及空白對(duì)照組(只加細(xì)胞培養(yǎng)液)，在37℃、5% CO2空氣及100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h。之后每孔加20 μl 1× MTT，在37℃孵育4 h，吸出上清液，每孔加150 μl DMSO，室溫下用平板搖床搖10 min。比色，計(jì)算各組藥物濃度下細(xì)胞抑制率，利用SPSS求出每組細(xì)胞對(duì)各藥物的IC50值及耐藥指數(shù)(resistance index，RI)，RI=耐藥細(xì)胞IC50/對(duì)照組細(xì)胞IC50。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍，結(jié)果取均值。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，兩樣本均數(shù)的比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

Ad-EGFP-MDR1重組腺病毒感染RA FLSAd-EGFP-MDR1重組腺病毒以MOI=100 pfu/cell，72 h感染細(xì)胞時(shí)效率最高，可見(jiàn)約有90%細(xì)胞表達(dá)綠色熒光，而此時(shí)陰性病毒對(duì)照組RA FLS未見(jiàn)熒光表達(dá)。MDR1過(guò)表達(dá)組RA FLS與陰性病毒對(duì)照組RA FLS相比，Ad-EGFP-MDR1重組腺病毒感染后細(xì)胞胞漿顆粒增多、細(xì)胞體積變大、生長(zhǎng)速度變慢(圖1)。Ad-EGFP-MDR1重組腺病毒感染后的RA FLS即為MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS。

MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS的MDR1的表達(dá)情況Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，MDR1過(guò)表達(dá)組RA FLS中MDR1 mRNA表達(dá)水平為1.4325±0.3924，明顯高于陰性病毒對(duì)照組的0.0650±0.0070(t=6.035，P=0.004)。

RA：類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；FLS：成纖維樣滑膜細(xì)胞；MDR1：多藥耐藥基因-1
RA：rheumatoid arthritis；FLS：fibroblast-like synoviocytes；MDR1：multidrug resistance gene-1
A．光鏡下陰性病毒組RA FLS；B．熒光顯微鏡下陰性病毒組RA FLS；C．光鏡下MDR1過(guò)表達(dá)組RA FLS；D．熒光顯微鏡MDR1過(guò)表達(dá)組RA FLS
A．negative virus control group RA FLS under light microscope；B.negative virus control group RA FLS under fluorescence microscope；C.MDR1 over-expressed group RA FLS under light microscope；D．MDR1 over-expressed group RA FLS under fluorescence microscope
圖1MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS(×200)
Fig1MDR1 over-expressed RA FLS(×200)

MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS P-gp蛋白的表達(dá)情況Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，MDR1過(guò)表達(dá)組RA FLS中P-gp蛋白表達(dá)明顯高于陰性病毒對(duì)照組(1.8667±0.2857比0.9367±0.0551；t=5.536，P=0.005)(圖2)。

MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS中P-gp功能的檢測(cè)熒光顯微鏡下可見(jiàn)MDR1過(guò)表達(dá)組RA FLS中羅丹明123染料的表達(dá)較陰性病毒對(duì)照組減少(圖3)，MDR1過(guò)表達(dá)組RA FLS中相對(duì)熒光強(qiáng)度明顯弱于陰性病毒對(duì)照組(979.43±196.81比1680.06±147.04；t=-4.940，P=0.008)。

MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS對(duì)MTX的耐藥性隨著MTX的濃度逐漸升高，MDR1過(guò)表達(dá)組(F=6.181，P=0.089)和陰性病毒對(duì)照組(F=9.868，P=0.052)的RA FLS存活率均逐漸下降，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在相同MTX濃度下，MDR1過(guò)表達(dá)組的RA FLS存活率均明顯高于陰性病毒對(duì)照組(P均<0.05)(表1)。陰性病毒對(duì)照組細(xì)胞MTX的IC50為15.72 μmol/L，而MDR1/RA滑膜細(xì)胞對(duì)MTX的IC50為587.35 μmol/L，MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS對(duì)MTX的耐藥指數(shù)為37.36。

1、2、3:陰性病毒對(duì)照組;4、5、6:MDR1過(guò)表達(dá)組;Mr:相對(duì)分子質(zhì)量
1,2,3:negative virus control group;4,5,6:MDR1 over-expressed group;Mr:relative molecular mass
圖2MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS的P-糖蛋白的表達(dá)情況
Fig2Expression of P-glycoprotein in MDR1 over-expressed RA FLS

A.陰性病毒對(duì)照組；B.MDR1過(guò)表達(dá)組
A.negative virus control group；B.MDR1 over-expressed group
圖3MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS中羅丹明123染料的表達(dá)情況(×100)
Fig3Expression of rhodamine 123 in MDR1 over-expressed RA FLS(×100)

表1 不同濃度MTX下MDR1過(guò)表達(dá)組和陰性病毒對(duì)照組的細(xì)胞存活率比較Table 1 Comparison of cell viability of MDR1 over-expressed group and negative virus control group at different concentrations of MTX

MTX：氨甲蝶呤；MDR1：多藥耐藥基因-1
MTX：methotrexate；MDR1：multidrug resistance gene-1

討 論

多藥耐藥是普遍存在于腫瘤性疾病、炎癥性疾病以及部分自身免疫性疾病中的現(xiàn)象，其中以腫瘤性疾病的研究最為深入。在腫瘤多藥耐藥的研究中，不少研究者利用建立腫瘤多藥耐藥的細(xì)胞模型作為研究基礎(chǔ)。起初建立腫瘤多藥耐藥細(xì)胞模型的普遍方法主要是體外利用抗腫瘤藥物小劑量反復(fù)刺激誘導(dǎo)法，這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于模擬了臨床上腫瘤化療中耐藥現(xiàn)象產(chǎn)生的病理過(guò)程，但是因?yàn)樗幬镎T導(dǎo)的時(shí)間較長(zhǎng)，期間影響因素較多，而且涉及的耐藥機(jī)制較為繁雜，不利于單個(gè)機(jī)制的研究。相對(duì)來(lái)說(shuō)，目前所采用的耐藥基因轉(zhuǎn)染的方法建立細(xì)胞模型則具有方法簡(jiǎn)單、多藥耐藥機(jī)制明確且穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[9]。此外研究表明，在RA的致病過(guò)程中，F(xiàn)LS相對(duì)于免疫細(xì)胞起著更加重要作用。在缺少RA患者血液以及T、B細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞影響的狀態(tài)下，RA FLS依然可以形成血管翳樣結(jié)構(gòu)，侵蝕破壞正常的關(guān)節(jié)軟骨。而且FLS也有著和腫瘤細(xì)胞類(lèi)似的侵蝕性的生長(zhǎng)特性[10]?；谏鲜鲈颍狙芯吭隗w外利用重組腺病毒Ad-EGFP-MDR1感染RA患者FLS，轉(zhuǎn)染MDR1基因，使其在FLS中高表達(dá)，為進(jìn)一步研究RA中MDR1所介導(dǎo)的多藥耐藥機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。

目前MDR1/P-gp與RA多藥耐藥的研究較少且進(jìn)展緩慢，多數(shù)研究都只是基于臨床研究發(fā)現(xiàn)了兩者的相關(guān)性。例如，1996年Maillefert等[11]檢測(cè)了RA患者外周血淋巴細(xì)胞中P-gp的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)耐藥的RA患者外周血淋巴細(xì)胞P-gp的表達(dá)高于治療有效組，而激素治療患者P-gp的水平明顯比DMARDs治療的患者高，并且外周血淋巴細(xì)胞中P-gp水平較高的患者如果早期就給予激素治療會(huì)增加DMARDs耐藥的風(fēng)險(xiǎn)。另有研究顯示，在使用3種甚至更多的二線(xiàn)藥物治療的RA患者FLS中MDR1也呈高表達(dá)[12]。隨后，本課題組以往研究也發(fā)現(xiàn)相對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎患者，RA患者FLS中P-gp的表達(dá)水平明顯增高，且與MTX的治療時(shí)間成正線(xiàn)性相關(guān)[3]。本研究基于前期的研究結(jié)果，不僅驗(yàn)證了MDR1基因的高表達(dá)可以影響P-gp呈高表達(dá)，而且從功能的探究入手，通過(guò)P-gp的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)P-gp能夠在RA FLS中發(fā)揮其外排功能，導(dǎo)致耐藥的產(chǎn)生。

P-gp是ATP結(jié)合盒(ATP binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族成員，需要ATP作為能量來(lái)源介導(dǎo)藥物外排。P-gp可識(shí)別和轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)和藥理作用不相關(guān)的中性正電荷的疏水性化合物，其作用底物除抗腫瘤藥物(如新堿類(lèi)和蒽環(huán)類(lèi)藥物)和抗生素類(lèi)藥物(如紅霉素和放線(xiàn)菌素)外，還包括免疫性疾病的常用藥物，如糖皮質(zhì)激素和金制劑[13]。然而，P-gp是否是引起RA經(jīng)典治療藥物MTX外排，導(dǎo)致其耐藥的主要原因，目前仍存在爭(zhēng)議。有觀(guān)點(diǎn)認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)MTX耐藥的主要機(jī)制是還原葉酸載體介導(dǎo)的MTX攝取障礙而不是P-gp介導(dǎo)的外排，因?yàn)镻-gp優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)親水性有機(jī)化合物，而并非如MTX這種二價(jià)陰離子化合物[14]。另一方面有研究顯示表達(dá)P-gp的基因MDR1的某些基因型確實(shí)與MTX的療效相關(guān)[15-17]，但是，因?yàn)橐陨线@幾組研究數(shù)據(jù)均來(lái)自于使用小劑量MTX治療的RA患者，并不能說(shuō)明是否P-gp對(duì)于不同藥物濃度的MTX作用程度不同。而本研究通過(guò)使用不同濃度的MTX刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)MTX各個(gè)濃度下MDR1過(guò)表達(dá)RA FLS的生存率均高于陰性對(duì)照組，而且其對(duì)MTX的耐藥性提高了37.36倍，這說(shuō)明MDR1介導(dǎo)的MTX外排也是MTX耐藥的重要原因。

綜上，本研究在體外構(gòu)建高表達(dá)MDR1基因RA FLS的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)MDR1基因高表達(dá)可通過(guò)上調(diào)其編碼蛋白P-gp的表達(dá)水平，增強(qiáng)其外排功能，從而降低RA FLS對(duì)RA治療錨定藥物MTX的反應(yīng)性，引起對(duì)MTX的耐藥。然而，臨床中RA的治療是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的過(guò)程，常常是多種機(jī)制的藥物聯(lián)合使用。而本研究中的細(xì)胞模型只是瞬時(shí)高表達(dá)MDR1基因，那么是否可以建立穩(wěn)定表達(dá)MDR1基因的細(xì)胞模型，并以此作為基礎(chǔ)探討MDR1介導(dǎo)的多藥耐藥的分子機(jī)制，將有待于今后進(jìn)一步的研究。