李 潔，周園園，趙 樂(lè)，李 旭

西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1婦產(chǎn)科 2轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心陜西省腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710061

卵巢癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，死亡率居于婦科腫瘤首位[1]，腫瘤細(xì)胞的持續(xù)存活與轉(zhuǎn)移是造成卵巢癌患者死亡及預(yù)后不良的重要原因。微小RNA(microRNAs，miRs)是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，廣泛存在于真核生物中。近年研究表明，miRs參與了腫瘤轉(zhuǎn)移的調(diào)控過(guò)程，如miR-200、miR-34等已經(jīng)被證實(shí)可以抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transformation，EMT)的發(fā)生從而抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[2]。Zhang等[3]研究顯示，miR-145在卵巢癌中呈現(xiàn)低表達(dá)，可以調(diào)控卵巢癌細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究評(píng)估了miR-145對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，探討了其作用分子機(jī)制，以期為遏制卵巢癌發(fā)生發(fā)展提供新的研究思路。

材料和方法

細(xì)胞培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，人卵巢癌細(xì)胞株3AO購(gòu)自山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期凍存。用含10%胎牛血清、1000 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，用胰酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-145 mimic(zeb-2 siRNA)與control mimic(control siRNA)購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司。采用羅氏公司的X-treme GENE siRNA轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，在超凈工作臺(tái)內(nèi)避光操作。將細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于6孔板中，24 h后細(xì)胞融合度達(dá)30%～40%。配制轉(zhuǎn)染試劑混合液：A(每孔)：轉(zhuǎn)染試劑5 μl+無(wú)血清無(wú)雙抗RPMI 1640 100 μl。B(每孔)：miR-145mimic(zeb-2 siRNA)或control mimic(control siRNA)7.5 μl(20 μmol/L)+無(wú)血清無(wú)雙抗RPMI 1640 100 μl。室溫靜置5 min后混合A、B兩種試劑，離心后室溫靜置20 min為C液。棄去細(xì)胞原培養(yǎng)液，加入C液200 μl及含10%血清的RPMI 1640培養(yǎng)基1.3 ml，即miR-145 mimic(zeb-2 siRNA)與control mimic(control siRNA)終濃度為100nmol/l。輕晃混勻后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染48 h后提取mRNA，轉(zhuǎn)染72 h后提取蛋白，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

RNA提取每孔細(xì)胞加1 ml TRizol試劑，室溫靜置5 min；加入0.2 ml氯仿，充分劇烈振蕩后于室溫靜置2～3 min，室溫離心15 min；離心后樣品分層，取上清加入0.5 ml異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10 min后，室溫離心10 min后棄去上清；向沉淀中加入1 ml乙醇，輕輕混勻。室溫離心5 min后棄上清；將RNA樣品晾干(不要徹底干燥)，加入適量DEPC水溶解。

qRT-PCR采用美國(guó)Thermo公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒行進(jìn)RNA反轉(zhuǎn)錄。將引物干粉稀釋成10 μmol/L的工作濃度，以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，按下述體系配制qRT-PCR反應(yīng)液：SYBY Green 10 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，cDNA模板2.0 μl，ddH2O 7.2 μl；反應(yīng)條件：95℃ 30s；95℃ 5s，60℃ 30s，72℃ 30s，40個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)未加模板的陰性對(duì)照組，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算RQ值，比較每組之間的基因表達(dá)差異。

Western blot檢測(cè)卵巢癌細(xì)胞接種于6孔板中，24 h貼壁后各組進(jìn)行處理，48 h后提取蛋白。棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)清洗貼壁細(xì)胞3次后加入放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液，置于冰上裂解30 min，輕晃使其充分裂解，12 000 r/min(r=13.5 cm)離心30 min，收集上清即為細(xì)胞總蛋白。采用二喹啉甲酸(bicinchoni-nicacid，BCA)比色法試劑盒測(cè)定細(xì)胞總蛋白質(zhì)的濃度。在蛋白樣品中加入聚丙烯酰氨凝膠電泳上樣緩沖液，沸煮5 min使其充分變性。蛋白上樣，行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)法將樣品轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜上，于5%的脫脂奶粉TBST緩沖液室溫下脫色搖床上封閉1 h。加入1∶300兔抗人zeb-2單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)或1∶500小鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)，4℃孵育過(guò)夜；加入1∶2000 辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體(美國(guó)Pierce公司)或1∶2000 辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗鼠抗體(美國(guó)Pierce公司)，室溫孵育1 h。電化學(xué)發(fā)光法(electro-chemiluminescence，ECL)顯影。

Transwell小室實(shí)驗(yàn)消化細(xì)胞后，用無(wú)血清無(wú)雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基反復(fù)洗滌細(xì)胞3次，重懸細(xì)胞后計(jì)數(shù)，再用無(wú)血清無(wú)雙抗RPMI 1640培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞密度達(dá)2×106/ml以上。將Transwell小室(侵襲實(shí)驗(yàn)中小室需有基質(zhì)膠)放入24孔板內(nèi)，每個(gè)Transwell小室上室中懸空加入100 μl細(xì)胞懸液含細(xì)胞1×105個(gè)(侵襲實(shí)驗(yàn)5×105個(gè))。在Transwell小室的下室中加入500 μl含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育20或24 h。用鑷子取出小室，移至另一含有500 μl 1×PBS的孔內(nèi)浸泡2～3 min，取出小室，用棉簽逐個(gè)小心擦去微孔膜上層細(xì)胞，如此用PBS洗3次。每孔甲醛500 μl，將小室移入，于4℃固定30 min，PBS洗3次。現(xiàn)配結(jié)晶紫，每孔500 μl，將小室放入，室溫染色30 min，PBS洗滌1次，稍晾干。倒置顯微鏡下觀察，隨機(jī)拍攝5個(gè)視野的細(xì)胞圖片，計(jì)數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)為證明miR-145特異作用于zeb-2 3’UTR區(qū)域，構(gòu)建含有zeb-2 mRNA的3’UTR(WT)及其3’UTR突變體(MUT)的雙熒光報(bào)告基因系統(tǒng)。方法是針對(duì)zeb-2 3’UTR預(yù)測(cè)結(jié)合miR-145區(qū)域，設(shè)計(jì)PCR引物，將PCR產(chǎn)物連在骨架質(zhì)粒pMIR REPORT Luciferase中，導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后搖菌，進(jìn)行克隆篩選后送北京華大公司基因測(cè)序，結(jié)果經(jīng)比對(duì)正確后再搖菌小提得到目的質(zhì)粒。在SKOV3及3AO細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-145 mimic、WT及pRL-TK(內(nèi)參質(zhì)粒)，轉(zhuǎn)miR-145 mimic control、WT及pRL-TK(內(nèi)參質(zhì)粒)作為對(duì)照，24 h后使用檢測(cè)試劑盒讀取螢火蟲(chóng)信號(hào)和海腎熒光信號(hào)，以海腎信號(hào)/螢火蟲(chóng)信號(hào)相對(duì)熒光值用作比較。對(duì)確認(rèn)有效的zeb-2 3’UTR區(qū)域，利用重疊PCR原理設(shè)計(jì)引物制造結(jié)合區(qū)域點(diǎn)突變，余過(guò)程如上。經(jīng)華大基因測(cè)序明確miR-145結(jié)合區(qū)域點(diǎn)突變后，提取得到MUT質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染驗(yàn)證是否miR-145還能結(jié)合并調(diào)控?zé)晒庑盘?hào)的表達(dá)。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)；組間構(gòu)成比比較采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

過(guò)表達(dá)miR-145抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力在SKOV3和3AO細(xì)胞中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-145 mimic過(guò)表達(dá)miR-145，48 h后采用qRT-PCR檢測(cè)miR-145的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，miR-145 mimic處理后，SKOV3(t=28.869，P=0.000)和3AO細(xì)胞(t=23.413，P=0.000)中的miR-145表達(dá)水平均明顯上升。采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲能力，結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-145后，SKOV3(t=10.752，P=0.000；t=5.617，P=0.005)及3AO細(xì)胞(t=10.111，P=0.001；t=21.746，P=0.000)的遷移及增殖能力均明顯下降(圖1)。

A.miR-145表達(dá)水平；B.遷移(HE，×200)；C.侵襲(HE，×200)
A.miR-145 expression；B.migration(HE，×200)；C.invasion(HE，×200)
圖1過(guò)表達(dá)miR-145抑制卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲能力
Fig1Overexpression of miR-145 inhibited the migration and invasion capabilities of ovarian cancer cells

zeb-2為miR-145的靶基因采用TargetScan(release 5.1，http：//www.targetscan.org/)軟件預(yù)測(cè)出zeb-2為miR-145的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染miR-145 mimic和WT 3’UTR表達(dá)載體細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性明顯低于共轉(zhuǎn)染mimic control和WT 3’UTR表達(dá)載體的細(xì)胞(SKOV3：t=4.572，P=0.010；3AO：t=3.528，P=0.024)，共轉(zhuǎn)染miR-145mimc和MUT 3’UTR表達(dá)載體細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染mimic control和MUT 3’UTR表達(dá)載體細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(SKOV3：t=0.227，P=0.831；3AO：t=0.040，P=0.970)(圖2)。

miR-145抑制zeb-2的蛋白表達(dá)水平過(guò)表達(dá)miR-145 48 h后，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，SKOV3(t=1.490，P=0.211)和3AO細(xì)胞(t=0.114，P=0.914)中zeb-2 mRNA表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。過(guò)表達(dá)miR-145 72 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照相比，SKOV3細(xì)胞(t=3.769，P=0.020)及3AO細(xì)胞(t=4.452，P=0.011)中zeb-2蛋白的表達(dá)水平明顯下降(圖3)。

敲低zeb-2抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力轉(zhuǎn)染zeb-2 siRNA 72 h后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，SKOV3(t=4.660，P=0.010)和3AO細(xì)胞(t=4.594，P=0.010)中的zeb-2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)；Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示，SKOV3(t=18.655，P=0.000；t=18.026，P=0.000)及3AO(t=5.500，P=0.005；t=8.780，P=0.001)細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯下降(圖4)。

圖2miR-145靶向抑制zeb-2
Fig2miR-145 directly targeted zeb-2 in ovarian cancer cells

A.mRNA水平；B.蛋白水平
A.mRNA level；B.protein level
圖3miR-145抑制zeb-2的蛋白水平表達(dá)
Fig3miR-145 inhibited zeb-2 expression at protein level

討 論

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是致死率最高的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致EOC患者不良預(yù)后的重要原因之一。因此，深入了解卵巢癌轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制，明確其進(jìn)程中的關(guān)鍵分子可能為卵巢癌的精準(zhǔn)治療提供新的靶點(diǎn)。本研究結(jié)果表明，miR-145可以抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲，提示miR-145可成為卵巢癌治療的靶分子。

A.zeb-2蛋白水平；B.遷移(HE，×200)；C.侵襲(HE，×200)
A.zeb-2 protein level；B.migration(HE，×200)；C.invasion(HE，×200)
圖4敲低zeb-2抑制卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲能力
Fig4Down-regulation of zeb-2 decreased the migration and invasion capabilities of ovarian cancer cells

miRs是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，廣泛存在于真核生物中。用于編碼 miRs的基因進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，在RNA聚合酶Ⅱ或Ⅲ催化下可生成具有發(fā)夾樣莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)miRs(primary miRNA)，然后在Drosha和DGCR8剪切下形成miRs前體，miRs前體最后在轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5的作用下轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞質(zhì)，在Dicer和TRBP的作用下形成成熟的miRs。miRs廣泛存在于真核生物中，能夠與其相應(yīng)靶基因mRNA 的3’端非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合，降解mRNA，抑制其翻譯[4]。miRs與腫瘤關(guān)系密切，充當(dāng)癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用[5-8]。miR-145是新發(fā)現(xiàn)的一種miR，在多種腫瘤中顯著低表達(dá)。miR-145在不同腫瘤中調(diào)控的基因不同，發(fā)揮抑癌作用的分子機(jī)制也不盡相同。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-145 通過(guò)下調(diào)接觸黏附蛋白 J、肌成束蛋白1和黏蛋白1抑制乳腺癌細(xì)胞遷移[9]。在小鼠小腸腫瘤細(xì)胞模型中，miR-145可通過(guò)抑制 ERK5/c-Myc 和 p68/p72/β-catenin 信號(hào)通路來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[10]。Wang 等[11]研究顯示，miR-145 可下調(diào) Rhotekin 蛋白(RTKN)，抑制 Rho的GTP結(jié)合活性，抑制細(xì)胞增殖。Tian 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，miR-145能夠下調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1，抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，進(jìn)而抑制腫瘤血管形成；同時(shí)，P53 能影響miR-145的表達(dá)。在其他多種腫瘤中，miR-145分別通過(guò)調(diào)控c-Myc[13]、表皮生長(zhǎng)因子受體[14]、胰島素樣生長(zhǎng)因子[15]、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子1[16]等多個(gè)靶基因來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡及侵襲。因此，miR-145在多種腫瘤中均可發(fā)揮抑癌作用，并可能與預(yù)后相關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)，miR-145可抑制卵巢細(xì)胞的遷移和侵襲，并預(yù)測(cè)和證實(shí)了zeb-2是miR-145的靶基因。zeb-2被認(rèn)為是EMT中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)子之一，EMT是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的關(guān)鍵起始步驟，因此zeb-2在腫瘤中發(fā)揮癌基因作用，抑制zeb-2的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，與本研究結(jié)果一致。miR-145可以作用于zeb-2的3’非翻譯區(qū)，影響其表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用，與在其他腫瘤中得到的結(jié)論一致。

綜上，本研究顯示，miR-145可通過(guò)直接靶向zeb-2抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲，該結(jié)果為進(jìn)一步研究卵巢癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程提供參考，將有助于尋找新的靶向于卵巢癌治療的候選分子。本課題組今后將進(jìn)一步研究miR-145在卵巢癌中的作用，為卵巢癌的臨床診療提供新的思路。