景 瓊，吳金平，王光亞

(慶陽(yáng)市人民醫(yī)院 a.泌尿外科，b.血液科，甘肅 慶陽(yáng) 745000)

膀胱癌是我國(guó)發(fā)病率和死亡率較高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，多見(jiàn)于男性群體，具有惡化程度高、早期確診率較低、預(yù)后差、易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等特點(diǎn)[1]。目前，雖然關(guān)于膀胱癌預(yù)后相關(guān)標(biāo)志物和危險(xiǎn)因素的研究較多[2]，但臨床上仍以Sylvester等[3]于2006年提出的膀胱腫瘤危險(xiǎn)因素評(píng)分表格作為預(yù)后的判斷標(biāo)準(zhǔn)。該方法在群組水平預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)及進(jìn)展的準(zhǔn)確性較高，但對(duì)于相同群組患者仍缺乏個(gè)體化、特異性的預(yù)測(cè)指標(biāo)。近年來(lái)，細(xì)胞免疫學(xué)治療越來(lái)越被臨床接受，尤其是程序性細(xì)胞死亡受體-1(programmed cell death receptor-1，PD-1)/程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)通路與免疫逃逸機(jī)制關(guān)系的研究逐漸成為腫瘤免疫學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)[4]。PD-1/PD-L1是免疫反應(yīng)中極其重要的協(xié)同共刺激分子，在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。因此，眾多學(xué)者認(rèn)為PD-1/PD-L1通路是逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸和恢復(fù)抗癌免疫應(yīng)答治療的重要靶點(diǎn)[5-7]。與其他很多信號(hào)通路相同，PD-1/PD-L1通路也受表觀遺傳調(diào)控，而微RNAs(microRNAs，miRNAs)是表觀遺傳調(diào)控的重要分子，在很多疾病中具有早期診斷和預(yù)后評(píng)估的潛力[8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在急性髓細(xì)胞白血病患者骨髓標(biāo)本中呈低表達(dá)，而PD-L1呈高表達(dá)，推測(cè)兩者可能具有靶向調(diào)控關(guān)系[9]。本研究主要通過(guò)檢測(cè)miR-34a、PD-1、PD-L1在膀胱癌組織中的表達(dá)及其與預(yù)后的相關(guān)性，為篩選復(fù)發(fā)高?；颊咛峁撛诘念A(yù)測(cè)分子。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2012年7月至2014年6月慶陽(yáng)市人民醫(yī)院泌尿外科收治的86例膀胱癌患者的存檔病理蠟塊作為研究對(duì)象，患者均經(jīng)病理科主任醫(yī)師復(fù)檢確定。其中，男59例、女27例，年齡18～82歲，平均(60.18±13.64)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①行膀胱癌切除術(shù)且切緣未見(jiàn)癌細(xì)胞浸潤(rùn)；②術(shù)前未行放療、化療及其他輔助治療者；③有完整的臨床病理及術(shù)后隨訪(fǎng)資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①行姑息性切除術(shù)者；②合并其他惡性腫瘤、心腦血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病、急慢性感染者；③長(zhǎng)期服用免疫抑制劑或免疫增強(qiáng)劑者。本研究經(jīng)慶陽(yáng)市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署了知情同意書(shū)。

1.2方法

1.2.1切片制作 自慶陽(yáng)市人民醫(yī)院病理科調(diào)取符合上述納入和排除標(biāo)準(zhǔn)患者的膀胱組織病理蠟塊，采用冰凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司，CM1950型)進(jìn)行組織切片(約4 μm)。

1.2.2RNA提取及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)miR-34a 采用TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596-026)提取組織總RNA。采用SuperScript RT Kit(日本TAKARA公司，批號(hào)：RR047A)逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA。利用SYBR Green PCR master Mix試劑盒(日本TAKARA公司，批號(hào)：RR420A)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。miR-34a引物序列設(shè)計(jì)如下：上游引物，5′-GCAGATCTGGGGTGATTCATCG-3′；下游引物，5′-GCATCGATGTGCATGCTTGT-3′。冰浴中配制20 μL 聚合酶鏈反應(yīng)體系，1個(gè)循環(huán)(95 ℃預(yù)變性30 s)，36個(gè)循環(huán)(95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸10 s)，建立聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增曲線(xiàn)和溶解曲線(xiàn)。以小分子U6作為內(nèi)參，讀取Ct值，以2-ΔΔCt表示miR-34a相對(duì)表達(dá)量。miR-34a的表達(dá)參照樊茹佳等[10]的方法進(jìn)行分類(lèi)，miR-34a≥中位值視為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。

1.2.3免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)PD-1和PD-L1 將組織切片逐步進(jìn)行二甲苯脫蠟和梯度酒精水化，檸檬酸緩沖液進(jìn)行組織抗原修復(fù)，冷卻后滴加過(guò)氧化氫消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；隨后滴加PD-1一抗(1∶200稀釋?zhuān)绹?guó)Abcam公司)或PD-L1一抗(1∶50稀釋?zhuān)绹?guó)Abcam公司)和二抗(北京中杉金橋生物科技有限公司)。二氨基聯(lián)苯胺(二氨基聯(lián)苯胺試劑盒，日本Takara公司)染色，脫水，中性樹(shù)膠封片。免疫組織化學(xué)結(jié)果判定參照張宋安等[11]的標(biāo)準(zhǔn)，將染色后的病理切片置于400倍視鏡下，PD-1和PD-L1定位于胞膜上，隨機(jī)選擇10個(gè)視野，觀察細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)情況，計(jì)算出被染色陽(yáng)性細(xì)胞的百分比。陽(yáng)性率為0(0分)，陽(yáng)性率≤25%(1分)，陽(yáng)性率為26%～50%(2分)，陽(yáng)性率為51%～75%(3分)，陽(yáng)性率>75%(4分)。同時(shí)觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度：陰性(0分)，弱染色(1分)，中度染色(2分)，強(qiáng)染色(3分)。染色指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞率×染色強(qiáng)度，根據(jù)總分?jǐn)?shù)將切片分為1～4級(jí)：0～1分(1級(jí))，2～3分(2級(jí))，4～6分(3級(jí))，7～12分(4級(jí))。其中，1級(jí)和2級(jí)為陰性表達(dá)，2級(jí)和3級(jí)為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3隨訪(fǎng) 建議患者術(shù)后1～3個(gè)月，每個(gè)月復(fù)查1次；4～12個(gè)月，每3個(gè)月復(fù)查1次；13～41個(gè)月，每6個(gè)月復(fù)查1次。本研究的主要研究終點(diǎn)為無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間，即自手術(shù)之日起至第1次出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、死亡或隨訪(fǎng)終止的時(shí)間。

2 結(jié) 果

2.1膀胱癌組織中miR-34a、PD-1和PD-L1的表達(dá)情況 經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)，膀胱癌組織中miR-34a的表達(dá)量為1.34±0.37，中位值為1.201，其中43例患者的miR-34a<1.201為低表達(dá)，43例患者的miR-34a≥1.201為高表達(dá)。經(jīng)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)，有55例(63.95%)膀胱癌患者腫瘤組織中的PD-1呈陽(yáng)性表達(dá)，45例(52.33%)膀胱癌患者腫瘤組織中的PD-L1呈陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖1和2。

1a：陰性表達(dá)；1b：陽(yáng)性表達(dá)；PD-1：程序性細(xì)胞死亡受體1

2a：陰性表達(dá)；2b：陽(yáng)性表達(dá)；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡配體1

圖2 PD-L1在膀胱組織的表達(dá)(S-P法，400×)

2.2miR-34a、PD-1、PD-L1在膀胱癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。不同年齡、腫瘤直徑、病理分級(jí)的miR-34a低表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNM分期T2～T3期患者miR-34a的低表達(dá)率高于Tis～T1期患者，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者miR-34a的低表達(dá)率高于未轉(zhuǎn)移者(P<0.01)；不同年齡、腫瘤直徑的PD-1陽(yáng)性表達(dá)率比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，TNM分期T2～T3期患者PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率高于Tis～T1期，高級(jí)別腫瘤患者PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率高于低級(jí)別腫瘤患者，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PD-1的陽(yáng)性表達(dá)率高于未轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)；不同年齡、病理分級(jí)PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，腫瘤直徑≥2 cm患者 PD-L1的陽(yáng)性表達(dá)率高于腫瘤直徑<2 cm患者，TNM分期T2～T3期的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率高于Tis～T1期患者，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率高于未轉(zhuǎn)移者(P<0.05)。

表1 miR-34a、PD-1、PD-L1在膀胱癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 [例(%)]

miR-34a：微RNA34a；PD-1：程序性細(xì)胞死亡受體1；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡配體1

2.3膀胱癌組織中miR-34a的表達(dá)量與PD-1、PD-L1 的關(guān)系 經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)性分析，miR-34a低表達(dá)組的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率高于miR-34a高表達(dá)組(r=-0.121，P=0.267)；但miR-34a的表達(dá)與PD-1無(wú)關(guān)(r=-0.303，P=0.005)。見(jiàn)表2。

表2 膀胱癌組織中miR-34a的表達(dá)量與PD-1、PD-L1的關(guān)系 (例)

miR-34a：微RNA34a；PD-1：程序性細(xì)胞死亡受體1；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡配體1

2.4miR-34a、PD-1、PD-L1在膀胱癌組織中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 隨訪(fǎng)截止時(shí)間為2018年10月，隨訪(fǎng)7～41個(gè)月，平均隨訪(fǎng)(32.4±7.5)個(gè)月。61例患者隨訪(fǎng)期間未出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，無(wú)進(jìn)展生存率為70.93%。其中，miR-34a低表達(dá)患者3年無(wú)進(jìn)展生存率為55.81%(24/43)，PD-1陽(yáng)性表達(dá)患者為61.82%(34/55)，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)患者為57.78%(26/45)，經(jīng)Log-rank法分析，不同miR-34a、PD-1、PD-L1表達(dá)患者3年無(wú)進(jìn)展生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討 論

雖然我國(guó)膀胱癌的發(fā)病率稍低于西方國(guó)家，但據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，近年來(lái)膀胱癌在我國(guó)尤其是男性群體中的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)[12]。膀胱癌起病隱匿，部分患者確診時(shí)可能已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且術(shù)后轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率較高也是手術(shù)失敗和5年生存率較低的重要原因[13]。因此，監(jiān)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移具有重要的臨床意義。但單純依靠腫瘤分期、病理學(xué)分級(jí)、腫瘤大小、淋巴結(jié)浸潤(rùn)等對(duì)膀胱癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性有待提高[14]。

隨著腫瘤免疫學(xué)研究的深入，免疫逃逸被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的主要機(jī)制之一。組織局部微環(huán)境中的免疫細(xì)胞尤其是腫瘤抗原特異性T細(xì)胞在協(xié)同刺激分子的調(diào)控下活性降低或凋亡是造成腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的主要機(jī)制[15]。其中，PD-1/PD-L1通路是調(diào)控腫瘤免疫逃逸的重要通路之一，其通過(guò)抑制腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子(腫瘤壞死因子-α、γ干擾素、白細(xì)胞介素-2等)的分泌抑制腫瘤特異性T細(xì)胞的功能[16]。研究顯示，PD-L1在胃癌、食管癌、宮頸癌等腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，是患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[17-18]；PD-L1表達(dá)上調(diào)，與腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞表面的PD-1受體結(jié)合，抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的活化和增殖，從而促使腫瘤免疫逃逸的發(fā)生[19]。另外，miR-34a 對(duì)PD-1/PD-L1信號(hào)通路具有重要的調(diào)控作用。Wang等[20]研究證實(shí)，與癌旁正常組織相比，腦膠質(zhì)瘤組織中的miR-34a呈低表達(dá)，而PD-L1呈高表達(dá)，經(jīng)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)兩者具有靶向調(diào)控關(guān)系。此外，另有學(xué)者通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞miR-34a的表達(dá)量可靶向抑制PD-L1的表達(dá)，進(jìn)而抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促使其凋亡[21]。但目前關(guān)于膀胱癌與PD-1/PD-L1通路關(guān)系的研究尚少，本研究結(jié)果顯示PD-1和PD-L1蛋白在膀胱癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.95%、52.33%，且與患者腫瘤直徑、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而miR-34a與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明miR-34a和PD-1/PD-L1通路均參與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程。在本研究中，miR-34a與PD-L1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；但與PD-1的表達(dá)量無(wú)關(guān)，與Wang等[20]的研究結(jié)果基本一致，說(shuō)明miR-34a與PD-L1存在靶向調(diào)控關(guān)系，但具體作用機(jī)制需進(jìn)一步研究證實(shí)。此外本研究結(jié)果顯示，miR-34a低表達(dá)、PD-1或PD-L1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的患者3年無(wú)進(jìn)展生存率相對(duì)較低，提示膀胱癌組織中miR-34a、PD-1、PD-L1表達(dá)水平可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。miR-34a表達(dá)水平降低、PD-1 和(或)PD-L1表達(dá)水平升高預(yù)示患者預(yù)后較差，無(wú)進(jìn)展生存率較低，對(duì)于這部分患者應(yīng)給予術(shù)后輔助治療及密切隨訪(fǎng)，這對(duì)早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移、提高患者生存率具有重要意義。

miR-34a：微RNA-34a；PD-1：程序性細(xì)胞死亡受體1；PD-L1：程序性細(xì)胞死亡配體1

圖3不同miR-34a、PD-1、PD-L1表達(dá)患者的3年無(wú)進(jìn)展生存曲線(xiàn)

綜上所述，腫瘤組織中miR-34a低表達(dá)和PD-1、PD-L1蛋白高表達(dá)與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)，有望成為膀胱癌早期診斷、臨床病理分期分級(jí)判斷及預(yù)后評(píng)估的輔助指標(biāo)，以提前篩選出復(fù)發(fā)高危人群，術(shù)后給予適當(dāng)?shù)妮o助放化療，從而有助于降低復(fù)發(fā)率、延長(zhǎng)患者生存期。