李 丹，劉榮森

(1.解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853； 2.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔科，北京 100853)

糖尿病是由遺傳和生活飲食因素共同作用而導(dǎo)致的一種慢性全身性代謝性綜合征，其可引起胰島素介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)減低，嚴(yán)重危害人類健康，已引起世界各國的高度重視。牙周病與糖尿病聯(lián)系密切,牙周炎為糖尿病的“第六大并發(fā)癥”[1]。牙周炎與胰島素抵抗密切相關(guān)，機(jī)體的免疫炎癥反應(yīng)更易導(dǎo)致胰島素抵抗，因此，牙周炎或牙周感染可增加糖尿病并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)。與血糖正常者相比，糖尿病患者發(fā)生牙周病的可能性更大，病情更重、累及范圍更廣，且血糖控制不良者牙周炎較血糖控制良好者更嚴(yán)重[2]。菌斑微生物與牙周炎的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，通過鑒別齦下菌群的種屬構(gòu)成可以了解微生物，特別是致病微生物對牙周病炎癥反應(yīng)的作用。16S rDNA測序是通過檢測原核生物中編碼核糖體小亞基rRNA中的高變區(qū)DNA序列的差異性，區(qū)分微生物種屬，可分析臨床樣本中致病菌或細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)多樣性的一種方法。本研究采用16S rDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)對2型糖尿病合并牙周炎患者齦下菌斑微生物群落進(jìn)行分析，探究不同糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)水平與2型糖尿病合并牙周炎患者齦下菌斑微生物的相關(guān)性，從微生物學(xué)角度探討2型糖尿病與慢性牙周炎的相互作用機(jī)制，為牙周炎伴2型糖尿病患者的診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月至2018年4月解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心口腔科和內(nèi)分泌科收治的66例2型糖尿病合并牙周炎患者為研究對象，依據(jù)HbA1c水平不同分為三組：慢性牙周炎+HbA1c6.0%～6.9%為試驗(yàn)1組，慢性牙周炎+HbA1c7.0%～8.9%為試驗(yàn)2組，慢性牙周炎+HbA1c≥9.0%為試驗(yàn)3組，各22例。試驗(yàn)1組男12例、女10例，年齡35～56歲，平均(36.2±1.9)歲；體質(zhì)指數(shù)19～23 kg/m2，平均(22.1±2.3) kg/m2。試驗(yàn)2組男11例、女11例，年齡36～56歲，平均(36.1±2.0)歲；體質(zhì)指數(shù)17～23 kg/m2，平均(21.2±1.5)kg/m2。試驗(yàn)3組男11例、女11例，年齡35～55歲，平均(37.4±1.9)歲；體質(zhì)指數(shù)19～24 kg/m2，平均(22.8±2.9) kg/m2。選擇同期僅有牙周炎而血糖正常22例患者作為對照組，其中男12例、女10例，年齡35～57歲，平均(37.1±2.2)歲；體質(zhì)指數(shù)18～24 kg/m2，平均(22.1±2.4) kg/m2。4組患者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究獲得解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署了知情同意書。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn) ①慢性牙周炎合并2型糖尿的診斷[1]：牙周炎符合慢性牙周炎診斷。全口余留牙數(shù)大于20顆，至少2個(gè)位點(diǎn)牙齦指數(shù)≥2,探診深度(probing depth，PD)≥5 mm，出血指數(shù)(bleeding index，BI)≥2,臨床附著喪失(clinical attachment loss，CAL)≥3 mm。2型糖尿病和血糖控制水平：符合2型糖尿診斷[2]。2型糖尿病史5～10年，無嚴(yán)重糖尿病急性并發(fā)癥，用藥規(guī)律，血糖控制水平穩(wěn)定，即3個(gè)月觀察期間，HbA1c保持相對穩(wěn)定控制水平。②慢性牙周炎血糖正常的診斷：無糖尿病病史，HbA1c≤6%，空腹血糖3.9～6.1 mmol/L，餐后2 h血糖≤7.8 mmol/L。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn) 6個(gè)月內(nèi)有牙周系統(tǒng)治療史；口腔內(nèi)有急性炎癥；侵襲性牙周炎；患有除2型糖尿病外的其他系統(tǒng)性疾?。挥形鼰熓?；3個(gè)月內(nèi)服用抗生素；飲食和運(yùn)動(dòng)習(xí)慣有改變；近6個(gè)月經(jīng)歷外科手術(shù)或創(chuàng)傷；妊娠期、哺乳期女性。

1.2.3脫落和剔除標(biāo)準(zhǔn) 自動(dòng)退出，不能完成觀察者。HbA1c不能保持相對穩(wěn)定控制者。

1.3方法

1.3.1口腔檢查及血糖檢測 對受試者進(jìn)行系統(tǒng)問診、全面口腔檢查及血糖檢測，完成口腔狀況篩查和糖尿病篩查?？谇粻顩r篩查主要包括對口腔狀況進(jìn)行全面檢查，使用Florida探針系統(tǒng)對牙周狀況進(jìn)行詳細(xì)記錄。糖尿病篩查主要包括系統(tǒng)問診，當(dāng)日靜脈血中空腹血糖及HbA1c水平。所有操作均由2名醫(yī)師完成。

1.3.2治療過程及樣品采集 ①檢查并記錄牙周臨床指標(biāo)：使用Florida牙周探針檢查并記錄所有研究對象6顆指數(shù)牙16、11、26、36、31、46(如果指數(shù)牙缺失以該區(qū)段其他牙代替)，每顆牙檢查6個(gè)位點(diǎn)近頰、正中、遠(yuǎn)頰、近舌、正中、遠(yuǎn)舌)的者PD、BI、CAL。②齦下菌斑樣本采集：選擇受檢者的6顆指數(shù)牙的頰側(cè)為取樣位點(diǎn)收取集合菌斑。具體方法：取樣位點(diǎn)隔濕后,去除齦上菌斑并用氣槍吹干牙面,使用無菌Gracey刮治器從牙周袋最底部刮取齦下菌斑,置于1.5 mL的磷酸鹽緩沖液管中,-20 ℃保存?zhèn)錂z。

1.3.3致病菌的檢測 酚氯仿法提取菌斑DNA，應(yīng)用以16S rRNA為基礎(chǔ)的聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測菌斑中牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis，Pg)、伴放線放線桿菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,Aa)、具核梭桿菌(Fusobactrriumnocleatum,Fn)、福塞坦菌(Tannerella forsythia，Tf)、中間型普里沃菌(Prevotella intermedia，Pi)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola,Td)的陽性率；1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，運(yùn)用電泳凝膠成像分析軟件(Fluorchem V2.0)分析各電泳條帶的平均灰度值，計(jì)算細(xì)菌的相對含量。

本研究采用6種國際參考標(biāo)準(zhǔn)菌株為陽性對照，一種菌株為陰性對照。其目的是檢測通用引物的通用性和特異引物的特異性。7種菌株分別為Pg(ATCC33277)、Tf(ATCC 43037)、Td(ATCC 33520)、Aa(ATCC 4371 8)、Pi(ATCC25611)、變形鏈球菌ATCC 27607(DNA模板由中國醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供)。

2 結(jié) 果

4組患者中，試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組各有1例退出試驗(yàn)。

2.14組患者PD、CAL、BI比較 4組PD、AL、BI比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

組別例數(shù)PD(mm)BICAL(mm)對照組223.10±2.321.98±2.023.99±1.22試驗(yàn)1組223.07±1.321.78±1.123.87±1.02試驗(yàn)2組213.09±1.421.89±1.433.43±2.12試驗(yàn)3組213.00±1.321.67±2.103.55±1.33F值0.9910.4970.881P值0.2210.6010.111

PD:牙周探診深度；BI：齦溝出血指數(shù)；CAL:臨床附著喪失；對照組：慢性牙周炎血糖正常；試驗(yàn)1組：慢性牙周炎+HbA1c6.0%～6.9%；試驗(yàn)2組：慢性牙周炎+HbA1c7.0%～8.9%；試驗(yàn)3組：慢性牙周炎+HbA1c≥9.0%

2.24組患者Pg、Aa、Fn、Pi、Tf、Td的檢出率比較 4組Pg、Aa、Tf、Pi、Td的檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，試驗(yàn)3組Pg、Aa、Tf、Pi、Td檢出率高于對照組和試驗(yàn)1組(P<0.05)；各組Fn檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 4組患者牙周炎微生物菌群檢出率比較 [例(%)]

Pg：牙齦卟啉單胞菌；Aa：伴放線放線桿菌；Fn：具核梭桿菌；Tf：福塞坦菌；Pi：中間型普里沃菌；Td：齒垢密螺旋體；對照組：慢性牙周炎血糖正常；試驗(yàn)1組：慢性牙周炎+HbA1c6.0%～6.9%；試驗(yàn)2組：慢性牙周炎+HbA1c7.0%～8.9%；試驗(yàn)3組：慢性牙周炎+HbA1c≥9.0%；a與對照組比較，P<0.05；b與試驗(yàn)1組比較，P<0.05

2.34組牙周炎微生物菌群相對含量比較 4組Pg、Aa、Fn、Tf、Pi、Td相對含量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。試驗(yàn)1、2、3組Pg、Aa、Fn、Tf、Pi、Td相對含量大于對照組(P<0.05)，試驗(yàn)2、3組Pg、Aa、Fn、Tf、Pi、Td相對含量大于試驗(yàn)1組(P<0.05)，試驗(yàn)3組Pg、Aa、Fn、Tf、Pi、Td相對含量大于試驗(yàn)2組(P<0.05)。見表3。

2.4不同HbA1c控制水平與微生物總菌群相對含量的相關(guān)分析 試驗(yàn)1組、試驗(yàn)2組、試驗(yàn)3組微生物總菌群相對含量分別為32.1±1.6、34.6±2.8、36.1±1.2，不同HbA1c控制水平與微生物總菌群相對含量正相關(guān)(r=0.914，P=0.023)。

3 討 論

2型糖尿病與牙周病關(guān)系密切，炎癥的存在對糖尿病患者血糖的控制存在較大的不良影響。相關(guān)研究顯示，高血糖可改變體內(nèi)中性粒細(xì)胞的趨化性，黏附作用和吞噬作用，使機(jī)體對牙周炎或牙周感染的敏感性增強(qiáng)，導(dǎo)致免疫細(xì)胞產(chǎn)生更多的炎癥因子和介質(zhì)[3-6]。當(dāng)糖尿病血糖控制較差時(shí)，機(jī)體的細(xì)胞因子濃度及齦溝液中的炎癥因子水平相應(yīng)升高，而對患者進(jìn)行牙周基礎(chǔ)治療后，血糖水平均會(huì)有所下降，可見牙周基礎(chǔ)治療對2型糖尿病的控制有一定效果[7-8]。

菌斑的微生物與牙周炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，分析齦下菌群的種屬構(gòu)成可以了解微生物，特別是致病微生物對牙周病炎癥反應(yīng)的作用。研究表明，在鏡下觀察及免疫組織化學(xué)法進(jìn)行細(xì)菌檢測未發(fā)現(xiàn)糖尿病的狀態(tài)對牙周可疑致病菌存在特異性聯(lián)系[7]。隨著試驗(yàn)方法的豐富，應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)法對特定菌種進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，受牙周炎癥水平、血糖控制水平等條件影響，部分牙周炎伴2型糖尿病患者齦下菌斑中可疑致病菌在種屬上存在差異[9-12]。

近年來許多研究應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌檢測，該方法特異性強(qiáng)、方便快速、靈敏度高等，但僅能檢測目標(biāo)菌種的存在與否。龐大的數(shù)據(jù)為篩選可疑致病微生物提供了更大的空間，對細(xì)菌的研究從原來的種屬構(gòu)成比發(fā)展到各微生物種間相互作用網(wǎng)絡(luò)，為病因?qū)W、疾病的診療提供了新的推論。

在牙周病的微生物種類中，目前有一部分細(xì)菌已被認(rèn)為在牙周炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，其中證據(jù)充分的致病菌包括Pg、Tf、Aa；而直腸彎曲桿菌、纏結(jié)優(yōu)桿菌、Fn、Pi、變黑普菌、微小微單胞菌、中間鏈球菌和Td則為中等證據(jù)的致病菌[13]。微生物群落在不同個(gè)體內(nèi)的數(shù)量構(gòu)成及分布情況均不同，通過對微生物多樣性的分析可以了解微生物群落在罹患2型糖尿病等全身疾病時(shí)是否具有共性差異，進(jìn)而從微生物角度解析牙周病與2型糖尿病之間的關(guān)系。早期研究表明，使用微生物涂片法及免疫組織化學(xué)法進(jìn)行細(xì)菌檢測無法明確高血糖狀態(tài)與牙周致病菌之間是否存在特異性聯(lián)系[14]。黃婧[15]對慢性牙周炎與牙周炎伴2型糖尿病患者齦下菌斑中7種牙周可疑致病菌(Pg、Tf、Td、Fn、Pi、變黑普菌和Aa)進(jìn)行定性分析，結(jié)果顯示兩組7種可疑致病菌電泳灰度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。16S rDNA是編碼原核生物核糖體小亞基基因，包括10個(gè)可變區(qū)，其因細(xì)菌不同而存在差異，且變異程度與細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育密切相關(guān)，具有種、屬結(jié)構(gòu)調(diào)整，該基因已逐漸成為細(xì)菌鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16-17]。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，16S rDNA基因克隆文庫法不需分離培養(yǎng)微生物，增加了檢測和鑒定口腔中非培養(yǎng)微生物的能力[18-19]。本研究結(jié)果顯示，4組PD、BI、CAL比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別例數(shù) Pg Aa Fn Tf Pi Td對照組2223.1±1.426.9±3.926.1±1.926.8±2.325.9±1.226.7±3.9試驗(yàn)1組2229.2±2.4a31.5±3.1a32.1±1.9a32.3±1.0a32.1±3.1a33.1±1.9a試驗(yàn)2組2133.1±3.1ab34.1±2.8ab35.1±1.3ab32.1±2.2 34.5±1.1ab34.1±1.2ab試驗(yàn)3組2135.2±1.1abc36.0±1.8abc36.0±2.2abc35.1±2.1abc33.1±1.4abc36.9±0.8abcF值32.00623.10020.10329.20632.10030.125P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

Pg：牙齦卟啉單胞菌；Aa：伴放線放線桿菌；Fn：具核梭桿菌；Tf：福塞坦菌；Pi：中間型普里沃菌；Td：齒垢密螺旋體；對照組：慢性牙周炎血糖正常；試驗(yàn)1組：慢性牙周炎+HbA1c6.0%～6.9%；試驗(yàn)2組：慢性牙周炎+HbA1c7.0%～8.9%；試驗(yàn)3組：慢性牙周炎+HbA1c≥9.0%；a與對照組比較，P<0.05；b與試驗(yàn)1組比較，P<0.05；c與試驗(yàn)2組比較，P<0.05

近年來，牙周炎合并糖尿病的研究成為熱點(diǎn)。馬麗等[4]研究表明，輕度牙周炎合并糖尿病患者Pi檢出率低于無糖尿病牙周炎者，重度牙周炎合并糖尿病患者的Aa、Pg、Tf檢出率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而Td、Fn及其他情況下各菌種的檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Ebersole等[5]研究運(yùn)用棋盤式DNA雜交技術(shù)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法比較了西班牙裔的合并牙周炎與2型糖尿病患者與未患糖尿病患者菌斑構(gòu)成及相應(yīng)細(xì)菌抗體水平，結(jié)果顯示糖尿病患者菌斑中Pg、Aa及彎曲菌屬檢出率高于非糖尿病的牙周炎患者，但僅有糖病患者中直腸彎曲桿菌的抗體水平增高。Davila-Perez等[6]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病伴牙周炎與無牙周炎患者Pg的檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Hintao等[7]分析2型糖尿病合并牙周炎患者唾液、齦上菌斑及齦下菌斑中的17種菌株，結(jié)果顯示2型糖尿病合并牙周炎患者與2型糖尿病不合并牙周炎患者的唾液、口腔含漱液和齦下菌斑的生物體系差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。曾紅燕和楊圣輝[8]通過聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)檢測目標(biāo)微生物發(fā)現(xiàn)2型糖尿病慢性牙周炎的厭氧菌總數(shù)、口腔鏈球菌總數(shù)、核梭桿菌、口腔乳桿菌數(shù)量均低于非糖尿病慢性牙周炎患者。Casarin等[20]采用16S rRNA基因克隆測序方法比較未控制的2型糖尿病與無糖尿病的慢性牙周炎患者齦下菌斑多樣性，其中慢性牙周炎患者中卟啉菌屬、絨毛產(chǎn)線菌、真細(xì)菌、坦納菌屬和密螺旋體的檢出率較高；未控制的 2型糖尿病患者中放線菌屬、奈瑟菌屬、孿生菌屬、艾肯菌屬、月形單胞菌屬、放線桿菌屬、二氧化碳噬纖維菌屬、梭菌屬、韋榮菌屬、鏈球菌屬的檢出率較高。Casarin等[21]和Nowakowska等[22]的研究證實(shí)，血糖水平可控制糖尿病個(gè)體齦下牙周袋中Ⅰ型Epstein-Bart病毒和念珠菌的定植。還有文獻(xiàn)對牙周炎和糖尿病的相關(guān)性進(jìn)行綜述和研究[23-24]。本研究結(jié)果與上述相關(guān)研究結(jié)果不同的原因可能與病例選取、檢測方法、研究目的、指標(biāo)選擇不同等有關(guān)。本研究結(jié)果還顯示，不同HbA1c控制水平與微生物總菌群相對含量呈正相關(guān)。

綜上所述，受試者條件、試驗(yàn)方法、選擇檢測的致病菌不同等因素的影響，尚不能確定在牙周炎合并2型糖尿病患者相對無2型糖尿病牙周炎患者在口腔菌群方面的特征性差異。但控制牙周炎可能有降低血糖水平的作用，同樣，控制血糖水平可能緩解牙周炎的進(jìn)展。