王曉靜，孫林靜，孫 玥，張融雪，李軍玲，閆雙勇，蘇京平

(天津市農(nóng)作物研究所 天津市農(nóng)作物遺傳育種重點實驗室，天津 300384)

水是植物生長發(fā)育所必需的物質(zhì)，水孔蛋白(Aquaporins，AQPs)是一類可以通透水分和其他中性小分子的膜內(nèi)在蛋白。根據(jù)氨基酸序列同源性比較，在大多數(shù)植物物種中，水孔蛋白被分成4類，分別是質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(Plasma membrane intrinsic protein，PIP)、液泡膜內(nèi)在蛋白(Tonoplast intrinsic protein，TIP)、NOD26類似內(nèi)在蛋白(NOD26-like intrinsic protein，NIP)和小分子質(zhì)量堿性內(nèi)在蛋白SIP(Small and basic intrinsic protein，SIP)。根據(jù)文獻報道，通常PIP和TIP具有較高的水分運輸活性，而大部分NIP和SIP除運輸少量水分子外，對中性小分子物質(zhì)具有良好的通透能力[1]。

在植物中，首個被發(fā)現(xiàn)的水孔蛋白是液泡膜水孔蛋白γ-TIP，并通過爪蟾卵母細胞體系證明它是一個水通道蛋白[2]。水稻中共有4類水孔蛋白，其中PIP有11個，TIP有10個，NIP和SIP分別有10個和2個[3]。PIP是很重要的一類水孔蛋白，根據(jù)N-末端和C-末端的長度及活性不同，PIP又可以分為PIP1和PIP22個亞類，其中水稻中的PIP1有3個，PIP2有8個。相比PIP1，PIP2有較長的C末端與較短的N末端。PIP2個亞類通透水分和小分子的功能也有所差異，PIP1家族通透水分的能力較低，但PIP2家族有較強的水分運輸效率[4]。

有研究證明，OsPIP2;7基因在水分快速轉(zhuǎn)運、體內(nèi)水分平衡、硼離子毒害的耐受性以及冷害耐受性有重要作用[5-7]。為了深入探索OsPIP2;7基因的生物學(xué)功能，需要利用OsPIP2;7的轉(zhuǎn)基因水稻進行功能研究。本試驗通過將3×HA標簽連接在OsPIP2;7氨基酸的C端，得到pHB-OsPIP2;7-3×HA植物表達載體，并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法對中花11進行遺傳轉(zhuǎn)化，得到過表達OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因植株，將為研究OsPIP2;7的生物學(xué)新功能提供試驗材料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

水稻品種：中花11，由天津市農(nóng)作物研究所提供。

菌株和質(zhì)粒：克隆載體T-Vector pMD 19 (Simple)購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105、質(zhì)粒pHB由上海市植物生理生態(tài)研究所惠贈。

試劑和酶：Taq酶和各種內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒及其他各種生化試劑購自上海生工生物工程有限公司；TRIzol購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑Rever Tra Ace α購自Toyobo公司；HA抗體購自Abmart公司。

1.2 試驗方法

1.2.1OsPIP2;7-3×HA基因片段的克隆 根據(jù)NCBI在線數(shù)據(jù)庫已公布的水稻OsPIP2;7的全長基因序列進行引物設(shè)計(表1，PIP2-F、PIP2-R)，為了構(gòu)建載體及鑒定載體的便利性，設(shè)計引物時分別引入Hind Ⅲ和PstⅠ酶切位點。采用嵌套PCR的方法，根據(jù)HA標簽蛋白的基因序列設(shè)計引物(表1，HA-R1、HA-R2、HA-R3)，同時最后一條引物引入XbaⅠ酶切位點。按照TRIzol(Invitrogen)使用說明書操作，從水稻的三葉齡葉片中提取植物總RNA，紫外分光光度計測定RNA的濃度和純度。取2 μg提取的總RNA，根據(jù)Rever Tra Ace α(Toyobo)說明書操作，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物保存于-20 ℃。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA第一鏈為模板，PIP2-F、PIP2-R為引物對OsPIP2;7進行擴增。將上一步的PCR產(chǎn)物稀釋100倍后作為模板，PIP2-F、HA-R1為引物進行嵌套PCR的第1輪擴增反應(yīng)。按照同樣的方式，分別以PIP2-F和HA-R2、PIP2-F和HA-R3為引物進行嵌套PCR的第2輪和第3輪擴增反應(yīng)。3輪反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物切膠回收，連接到T-Vector pMD 19 (Simple)上，委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。

1.2.2 植物表達載體的構(gòu)建 將pHB載體用Hind Ⅲ和XbaⅠ進行雙酶切，電泳，切膠回收帶酶切位點的pHB片段。將pMD19-T-OsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ進行雙酶切，電泳，切膠回收帶酶切位點的OsPIP2;7-3×HA目的條帶。將帶黏性末端的OsPIP2;7-3×HA與pHB載體連接，用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，在含有50 mg/L卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 h后挑取單克隆振蕩培養(yǎng)，提取的質(zhì)粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ進行雙酶切檢測陽性克隆。委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司對陽性克隆進行確認，最后將正確質(zhì)粒命名為pHB-OsPIP2;7-3×HA(圖1)。

圖1 植物表達載體pHB-OsPIP2;7-3×HA結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of plant expression vector pHB-OsPIP2;7-3×HA

1.2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及鑒定 將構(gòu)建好的pHB-OsPIP2;7-3×HA載體用凍融交替法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA 105感受態(tài)細胞，在含有50 mg/L卡那霉素和50 mg/L利福平的YEB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，挑取單克隆振蕩培養(yǎng)24～36 h，用引物PIP2-F和HA-R3進行菌液PCR擴增來檢測陽性克隆。將得到的陽性農(nóng)桿菌用添加乙酰丁香酮的AAM液體培養(yǎng)基重懸后，對粳稻品種中花11成熟胚誘導(dǎo)的愈傷組織進行侵染。將侵染后的愈傷組織進行不同抗生素篩選，篩選時用羧卞青霉素抑制農(nóng)桿菌的生長，用潮霉素作為陽性愈傷組織的篩選劑，得到的陽性愈傷組織經(jīng)過預(yù)分化與分化后生綠色芽，待芽長至2～3 cm后放入生根培養(yǎng)基中壯苗。選取發(fā)育良好的生根植株(以中花11為對照)，用CTAB法提取植株的基因組DNA，潮霉素引物(表1，HYG-F、HYG-R)進行PCR擴增，1.0%瓊脂糖進行凝膠電泳。

表1 擴增OsPIP2;7-3×HA與HYG基因的PCR特異引物序列Tab.1 The sequences of primers for amplification of OsPIP2;7-3×HA and HYG

注： 小寫字母為酶切位點序列。

Note:Small case letters are the sequence of enzyme sites.

1.2.4 RNA水平上鑒定轉(zhuǎn)基因植株 提取1.2.3中使用潮霉素引物篩選到的OsPIP2;7水稻轉(zhuǎn)基因陽性植株的RNA，使用Rever Tra Ace α進行cDNA 反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄的第一鏈cDNA為模板，目的基因OsPIP2;7的引物(P27RT-F和P27RT-R)與管家基因OsUBI的引物(UBIRT-F和UBIRT-R)進行PCR擴增，篩選RNA水平上過表達OsPIP2;7的水稻轉(zhuǎn)基因植株。反應(yīng)體系為20 μL，包括:ddH2O 12.5 μL、10×Buffer(含20 mmol/L Mg2+) 2 μL、引物(10 μmol/L)2 μL、dNTP(2.5 mmol/L) 1 μL、Tag DNA聚合酶(2 U/μL) 0.5 μL、DNA模板2 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 1 min，28個循環(huán)或者32個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察并拍照。

1.2.5 膜蛋白的提取 液氮凍存水稻葉片組織研成粉末，倒入加有0.5 mL 裂解緩沖液(150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L Tris-HCl, pH 值7.4, 1%V/V10 mmol/L PMSF)的離心管內(nèi)。將離心管放冰水浴，加入等體積預(yù)冷的稀釋緩沖液(300 mmol/L NaCl, 20 mmol/L Tris-HCl, pH值 7.4, 4%V/VTriton X-114)，總體積1 mL。振蕩完畢后離心管放冰水浴10 min。4 ℃，12 000 r/min離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新管，棄沉淀。將裝有上清裂解液的小管置于37 ℃水浴，不時振蕩，孵育20 min后，溶液分為兩相。12 000 r/min離心5 min，吸取上層水相，棄去。加入0.5 mL預(yù)冷的稀釋緩沖液與下層油狀相混合，振蕩后冰水浴10 min。將含膜蛋白的油狀下層相轉(zhuǎn)移到新管，加入9倍體積的預(yù)冷的丙酮，-20 ℃過夜。4 ℃，12 000 r/min離心10 min。棄上清，干燥沉淀，加入100 μL水后進行蛋白質(zhì)定量。

1.2.6 蛋白免疫印跡 SDS-PAGE 采用Mini-PROTEAN Tetra Cell (Bio-Bad)垂直電泳系統(tǒng)。濃縮膠濃度為3%，分離膠濃度為12%，凝膠厚度為0.75 mm。將定量后的蛋白質(zhì)溶液加入上樣孔中，每孔加蛋白30 g進行電泳(電泳緩沖液為：3.03 g/L Tris, 14.4 g/L Gly, 1 g/L SDS)。電泳條件為：100 V電泳15 min，150 V至電泳結(jié)束，時間為1.0～1.5 h。

轉(zhuǎn)膜：將電泳結(jié)束后的凝膠浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液(3.03 g/L Tris, 14.4 g/L Gly, 200 mL/L甲醇)中，期間準備轉(zhuǎn)膜所用的3 M濾紙和PVDF膜。首先將PVDF膜在甲醇中浸泡數(shù)秒，再浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，3 M濾紙也浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中。應(yīng)用Mini-PROTEAN Ⅱ Cell (Bio-Bad)轉(zhuǎn)印系統(tǒng)轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為：100 V濕轉(zhuǎn)1 h。

免疫印跡：脫脂奶粉封閉1 h，1∶3 000 anti-HA (Abmart)抗體孵育2 h，PBST溶液洗3遍，每遍10 min。二抗(HRP-conjugated secondary antibody, Santa Cruz)孵育1 h，PBST洗3遍，每遍10 min。使用增強化學(xué)發(fā)光法，將HRP底物ECL發(fā)光液(Pierce)1∶1等體積混合，將混合物覆蓋在PVDF膜表面，搖晃均勻并反應(yīng)1～2 min，保鮮膜將PVDF膜包好后，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Chemi DocTM XRS+(Bio-Rad)掃描并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsPIP2;7-3×HA基因片段的克隆

以水稻全長cDNA第一鏈為模板，使用PIP2-F和PIP2-R為引物進行PCR反應(yīng)，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，片段大小為882 bp(圖2-A)。嵌套PCR的3輪擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，片段大小分別為911，937，969 bp(圖2-B)，與預(yù)期片段大小一致。將嵌套PCR的終產(chǎn)物切膠回收后，與T-Vector pMD 19 (Simple)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌獲得陽性克隆，測序后經(jīng)與NCBI上公布的目的基因OsPIP2;7與HA標簽蛋白的核酸序列進行比對分析，結(jié)果表明，OsPIP2;7-3×HA基因片段克隆正確。

A. 以PIP2-F和PIP2-R為引物的PCR擴增結(jié)果；B. 嵌套PCR的擴增結(jié)果。HA1. 以PIP2-F和HA-R1為引物的PCR擴增結(jié)果；HA2.以PIP2-F和HA-R2為引物的PCR擴增結(jié)果；HA3. 以PIP2-F和HA-R3為引物的PCR擴增結(jié)果。M. 分子質(zhì)量標記DL2000。

A. PCR results ofOsPIP2;7when usingPIP2-F andPIP2-R as primers; B. PCR results of nested PCR. HA1. PCR results ofOsPIP2;7-3×HAwhen usingPIP2-F andHA-R1 as primers; HA2.PCR results ofOsPIP2;7-3×HAwhen usingPIP2-F andHA-R2 as primers; HA3. PCR results ofOsPIP2;7-3×HAwhen usingPIP2-F andHA-R3 as primers. M. Molecular Marker DL2000.

圖2OsPIP2;7-3×HA基因片段的PCR擴增
Fig.2 PCR amplification ofOsPIP2;7-3×HAgene segment

2.2 植物表達載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

含目的基因質(zhì)粒pMD 19-TOsPIP2;7-3×HA及植物雙元表達載體pHB經(jīng)Hind Ⅲ和XbaⅠ進行雙酶切(圖3-A，B)、酶切產(chǎn)物切膠純化后，于16 ℃連接3 h，產(chǎn)物經(jīng)熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α感受態(tài)，挑取卡那抗生素平板上的單菌落進行陽性重組子的篩選及鑒定。Hind Ⅲ和XbaⅠ雙酶切鑒定結(jié)果顯示2條帶，其中目的基因片段大小為969 bp(圖3-C)。DNA測序結(jié)果顯示，pHB-OsPIP2;7-3×HA植物表達載體構(gòu)建成功。

將pHB-OsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA 105后，用PIP2-F和HA-R3引物進行PCR擴增，凝膠結(jié)果顯示目標條帶與預(yù)期結(jié)果一致(圖3-D)，表明所構(gòu)建的pHB-OsPIP2;7-3×HA載體已成功轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。

A. pMD 19-TOsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切；B. pHB空載體用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切；C. pHB-OsPIP2;7-3×HA陽性克隆用Hind Ⅲ和XbaⅠ酶切；D. pHB-OsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA 105后，用引物PIP2-F和HA-R3擴增的PCR產(chǎn)物。1. pMD 19-TOsPIP2;7-3×HA質(zhì)粒酶切結(jié)果；2.pHB空載體酶切結(jié)果；3. pHB-OsPIP2;7-3×HA陽性克隆酶切結(jié)果；4. 農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)入pHB空載體后的PCR擴增結(jié)果；5. 農(nóng)桿菌中轉(zhuǎn)入pHB-OsPIP2;7-3×HA載體的陽性克隆PCR擴增結(jié)果。M1. 分子質(zhì)量標記DL2000；M2.分子質(zhì)量標記DL5000。

A. Restriction enzyme identification ofHind Ⅲ andXbaⅠ；B. Restriction enzyme identification ofHind Ⅲ andXbaⅠ；C. Restriction enzyme identification ofHind Ⅲ andXbaⅠof a positive pHB-OsPIP2;7-3×HAclone; D. PCR results of the transformed pHB-OsPIP2;7-3×HAinto theAgrobacteriumstrains of EHA 105 when usingPIP2-F andHA-R3. 1. Enzyme identification of pMD 19-TOsPIP2;7-3×HA; 2.Enzyme identification of pHB empty vector;3.Enzyme identification of pHB-OsPIP2;7-3×HA; 4. PCR results of the transformed pHB into theAgrobacteriumstrain; 5. PCR results of the transformed pHB-OsPIP2;7-3×HAinto theAgrobacteriumstrain. M1. Molecular Marker DL2000. M2.Molecular Marker DL5000.

圖3 植物表達載體pHB-OsPIP2;7-3×HA的構(gòu)建
Fig.3 Construction of plant expression vector pHB-OsPIP2;7-3×HA

2.3 轉(zhuǎn)基因植株的獲得及檢測

2.3.1 潮霉素篩選OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻 提取23個轉(zhuǎn)基因水稻植株的全基因組DNA，用潮霉素引物進行PCR擴增。結(jié)果顯示，除了#1、#16單株沒有條帶，其余植株均擴增出550 bp的預(yù)期片段，對照植株中花11中沒有出現(xiàn)電泳條帶(圖4)，符合預(yù)期結(jié)果。說明pHB-OsPIP2;7-3×HA載體已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入水稻的基因組中。

2.3.2 篩選OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻在RNA水平表達上升的株系 提取12株潮霉素陽性的轉(zhuǎn)基因水稻總mRNA，反轉(zhuǎn)錄成第一鏈的cDNA為模板，管家基因OsUBI的表達量為對照，通過半定量PCR的方法來檢測OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻不同植株的OsPIP2;7表達量。半定量PCR結(jié)果顯示，#12、#13、#19、#20植株的OsPIP2;7的表達量比中花11高很多(圖5)，成功得到在RNA水平上過表達OsPIP2;7的轉(zhuǎn)基因水稻。

ZH11. 陰性對照植株中花11；1-23. 轉(zhuǎn)基因水稻不同株系；M. 分子質(zhì)量標記DL500。ZH11. Zhonghua 11 as negative control; 1-23. Different lines of transgenic rice； M. Molecular marker DL500.

ZH11. 陰性對照植株中花11；11、12、13、15、17、19、20. 轉(zhuǎn)基因水稻不同株系；M. 分子質(zhì)量標記DL2000。ZH11. Zhonghua 11 as negative control; 11，12，13，15，17，19，20. Different lines of transgenic rice. M. Molecular marker DL2000.

2.3.3 篩選OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻在蛋白質(zhì)水平表達上升的植株 提取5株RNA水平上過表達OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻植株的膜蛋白，由于HA與OsPIP2;7為融合蛋白，OsPIP2;7的單克隆抗體較難制備，并且費用昂貴，所以用HA抗體檢測OsPIP2;7-HA的蛋白質(zhì)表達量。Western-blot結(jié)果顯示，HA標簽蛋白在這5株轉(zhuǎn)基因植株中都有表達(圖6)，說明在OsPIP2;7轉(zhuǎn)基因水稻中，去除水稻中OsPIP2;7的本底表達，OsPIP2;7在蛋白質(zhì)水平上過表達。

ZH11. 陰性對照植株中花11；1、12、13、19、20. 轉(zhuǎn)基因水稻不同株系；M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標記。ZH11. Zhonghua 11 as negative control; 1，12，13，19，20. Different lines of transgenic rice； M. Protein molecular weight Marker.

3 結(jié)論與討論

在水孔蛋白發(fā)現(xiàn)之前，人們一致認為水分是通過自由擴散的方式進出膜脂雙層的，直至1992年第一個水孔蛋白的發(fā)現(xiàn)，人們才知道水孔蛋白是水分通過細胞膜的最主要方式[8]。水分參與了植物從種子萌發(fā)到衰老死亡的所有過程，維持體內(nèi)的水分平衡是植物每時每刻都在進行的活動，水孔蛋白在其中起到重要的作用[9-13]。在植物的不同物種中克隆到水孔蛋白，并進行功能分析后發(fā)現(xiàn)，水孔蛋白除了具有水分選擇性運輸功能之外，還可以選擇性的通透尿素[14]、甘油[15]、二氧化碳[16]等小分子和硅[17-18]、硼[6]等營養(yǎng)元素。植物的任何生命活動都離不開水，維持體內(nèi)的水分平衡對于植物的生命活動至關(guān)重要，因此，水孔蛋白對于植物在正?；蛘呙{迫生長條件下的生長發(fā)育發(fā)揮了重要的作用。

OsPIP2;7的生物學(xué)功能已有報道[5-7]，為探索OsPIP2;7的新功能，需要利用OsPIP2;7的轉(zhuǎn)基因水稻進行功能研究。由于水孔蛋白作為膜蛋白本身的特性，主要是低豐度、疏水性等原因，導(dǎo)致水孔蛋白抗體獲得難度大，商業(yè)化的水孔蛋白抗體價格昂貴，并且水稻中的水孔蛋白家族成員多，與OsPIP2;7同源性較高的蛋白有很多，使用OsPIP2;7作為抗體檢測不同轉(zhuǎn)基因株系中OsPIP2;7的蛋白質(zhì)表達量時，在Western-blot試驗時，難以確定檢測得到的蛋白量是否為OsPIP2;7的實際表達量，因此，很有必要使用標簽蛋白系統(tǒng)。目前，市場上應(yīng)用較廣的標簽系統(tǒng)包括myc、HA、Flag、His、GST等，其中HA標簽系統(tǒng)利用一個HA(流感病毒血凝素，Influenza hemagglutinin epitope:YPYDVPDYA)短肽融合到目標蛋白。HA標簽抗體能特異識別C末端或N末端帶有HA標簽的融合蛋白，也可以用于檢測與HA標簽融合表達蛋白的表達、細胞內(nèi)定位，以及純化、定性或定量檢測HA標簽融合表達蛋白等。因此，本試驗在植物表達載體構(gòu)建時，在OsPIP2;7氨基酸的C末端添加3個HA標簽用于目的蛋白的檢測，這對于研究OsPIP2;7的生物學(xué)新功能具有重要的意義。該載體的構(gòu)建解決了使用水孔蛋白抗體檢測OsPIP2;7的蛋白質(zhì)表達量試驗中，可以檢測到大量同源蛋白，致使檢測到的蛋白質(zhì)表達量不準確的問題。

已有諸多研究表明，水分虧缺、高溫、低溫、鹽脅迫、CO2濃度升高、養(yǎng)分缺乏等非生物逆境脅迫均可改變水孔蛋白的表達，進而影響水分通透活性[19-24]，但通過轉(zhuǎn)基因的方式將水孔蛋白在植株體內(nèi)高表達，并進行基因功能研究的報道較少，本研究構(gòu)建pHB-OsPIP2;7-3×HA載體并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，對后續(xù)OsPIP2;7新功能的研究提供了試驗基礎(chǔ)。