張梅娟，徐紅紅，馬天意，錢朋智，沙 偉

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

植物的生長和發(fā)育離不開水分的運(yùn)輸，將體內(nèi)水勢維持在一個(gè)合適的水平尤為重要。水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一種定位于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)，可以調(diào)節(jié)水分高效快速、可逆地跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而調(diào)控植物體內(nèi)水分的平衡。AQP為主要內(nèi)在的膜鑲嵌蛋白超基因家族(Major Intrinsic proteins，MIPs)中的一員，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中。植物中AQP的類型豐富多樣且表達(dá)豐度極高[1]，如擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有35個(gè)水通道蛋白成員[2]，玉米(Zeamays)中有36個(gè)[3]，水稻(Oryzasativa)中有33個(gè)[4]，葡萄(Vitisvinifera)中有33個(gè)[5]，番茄(Solanumlycopersicum)中有37個(gè)[6]，陸地棉(Gossypiumhirsutum)中有71個(gè)[7]，大豆(Glycinemax)中有66個(gè)[8]，芝麻(Sesamumindicum)中有35個(gè)[9]。根據(jù)序列相似性和亞細(xì)胞定位，AQP被分為7類，分別是質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(Plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)，液泡膜內(nèi)在蛋白(Tonoplast intrinsic proteins, TIPs)，類Nodulin26內(nèi)在蛋白(Nodulin26-like intrinsic proteins, NIPs)，小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(Small basic intrinsic proteins, SIPs)，類GlpF內(nèi)在蛋白(Glycerol facilitator intrinsic proteins, GIPs)，混合類內(nèi)在蛋白(Hybrid intrinsic proteins, HIPs)和未知類X內(nèi)在蛋白(Uncategorized X basic intrinsic proteins, XIPs)[2, 10-12]。其中，GIPs 發(fā)現(xiàn)于小立碗蘚(Physcomitrellapatens)中，HIPs發(fā)現(xiàn)于球蒴蘚(Sphaerotheciellasphaerocarpa)中，XIPs在馬鈴薯(Solanumtuberosum)、煙草(Nicotianatabacum)和小立碗蘚中被發(fā)現(xiàn)，并不常見，相關(guān)研究較少。

PIPs是MIPs中最大的亞家族，分為PIP1s和PIP2s 2個(gè)亞類，是一類多功能蛋白質(zhì)，對(duì)運(yùn)輸機(jī)制有高度選擇性[13]。PIPs分子質(zhì)量約24～30 ku，有6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，5個(gè)親水環(huán)(loop A～E)。其中A、C、E環(huán)位于細(xì)胞膜外，B、D環(huán)及氨基端和羧基末端均位于細(xì)胞質(zhì)一側(cè)；在B、E環(huán)上各有一個(gè)高度保守的天門冬氨酸-脯氨酸-丙氨酸(NPA)小結(jié)構(gòu)域[14-15]。PIP1s與PIP2s的主要區(qū)別在于N端和C端的不同，PIP1s有較長的N端和較短的C端，PIP2s則相反[16-17]。PIP2s具有較高的水分滲透性，PIP1s水分運(yùn)輸能力弱，說明PIP2s在脅迫條件下受到異位蛋白影響比PIP1s大，但二者均能參與植物的生長和發(fā)育[14]。許多研究表明，植物能夠通過調(diào)節(jié)PIPs的活性響應(yīng)各種非生物脅迫，如干旱、高溫、鹽害、滲透脅迫等[18-19]。例如，在擬南芥中過表達(dá)巴西香蕉(Musaacuminata)中的MaPIP1;1基因，在干旱和高鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株的抗性顯著提高，且轉(zhuǎn)基因株系的根系增長，根毛增多[20]。馬尾松(Pinusmassoniana)的PmPIP1基因可受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，推測可能參與了干旱脅迫過程[21]。高羊茅(Festucaarundinacea)基因FaPIP2;1在擬南芥中過表達(dá)，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性明顯增強(qiáng)[22]。灰毛濱藜(Atriplexcanescens)中AcPIP2基因過表達(dá)擬南芥，能夠調(diào)控轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱、高鹽和低溫等脅迫的抵抗力[23]。由此可見，PIPs 在植物抵御非生物脅迫過程中具有非常重要的作用。目前，砂蘚(Racomitiumcanescens)水通道蛋白PIPs基因克隆和功能分析的相關(guān)研究未見報(bào)道。因此，為更好地了解苔蘚植物的抗干旱機(jī)理，本研究對(duì)砂蘚水通道蛋白PIPs基因進(jìn)行克隆，對(duì)其編碼蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)預(yù)測，為苔蘚植物抗旱基因工程研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

砂蘚采于黑龍江省五大連池風(fēng)景區(qū)石龍。選取生長旺盛的材料，用無菌水清洗后，于室溫中培養(yǎng)，取莖尖部分放于液氮中速凍，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取 采用沙偉等[24]的改良SDS法進(jìn)行砂蘚總RNA的提取。

1.2.2RcPIP2的克隆 從砂蘚干旱轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中篩選得到1個(gè)PIPs家族基因PIP2的轉(zhuǎn)錄本序列，根據(jù)其序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物R1(5′-GAGGCGG CTTCGTAGGTTA-3′)和R2(5′-GCACAGCGACCTA CATACAAGA-3′)，擴(kuò)增基因PIP2全長序列，并命名為RcPIP2基因。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收、連接、轉(zhuǎn)化和雙酶切鑒定。對(duì)已鑒定的陽性克隆送至北京華大基因進(jìn)行測序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 運(yùn)用ProtParam軟件預(yù)測該基因的基本理化性質(zhì)；通過ProtScale和TMHMM軟件預(yù)測基因RcPIP2編碼的氨基酸序列的親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)域；利用SignalP 4.1和SOPMA軟件對(duì)氨基酸序列的信號(hào)肽和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測；氨基酸序列立體結(jié)構(gòu)預(yù)測由SWISS-MODEL軟件完成。將氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的BlastX進(jìn)行同源性搜索和比對(duì)，利用MEGA 5.0軟件分析RcPIP2蛋白質(zhì)與其他植物的PIP2蛋白質(zhì)的進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 RcPIP2基因 cDNA 全長的克隆

以砂蘚反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，以干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)PIP2進(jìn)行擴(kuò)增，得到的目的片段長度約1 200 bp(圖1-A)?；厥漳康钠闻c克隆載體相連，得到重組質(zhì)粒pMD19 simple T-PIP2，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)藍(lán)白斑篩選出陽性克隆菌落，提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果與目的片段大小相吻合，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1-B)。測序結(jié)果顯示，PIP2基因全長為1 267 bp，ORF長807 bp，共編碼含有268個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)序列，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致(圖2)。對(duì)該片段的測序結(jié)果表明，這是首次從砂蘚中克隆獲得的PIP2基因家族成員，因此，命名為RcPIP2基因。

M.DL2000 DNA Marker。

ATG.起始密碼子；TAG.終止密碼子；單下劃線. 高度保守序列；黑框. 高度保守天門冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸Asn-Pro-Ala (NPA)。ATG.Initiator codon; TAG.Terminator codon; Single underline.Highly conserved sequence; Black box.Conserved Asn-Pro-Ala (NPA).

2.2 生物信息學(xué)分析

2.2.1 RcPIP2蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及親疏水性分析RcPIP2基因編碼的氨基酸序列中，相對(duì)含量比較多的氨基酸是丙氨酸Ala(A)和甘氨酸Gly(G)，分別為12.9%，9.3%，氨基酸組成見表1。

通過ProtParam軟件預(yù)測RcPIP2蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量(Mr)為28.3 ku，理論等電點(diǎn)(pI)為6.64，其中負(fù)電荷殘基數(shù)(Asp+Glu)為15，正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)為14，為中性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定系數(shù)為21.61<40，表示該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定性蛋白質(zhì)；脂肪系數(shù)為102.39，表示該蛋白質(zhì)中脂肪側(cè)鏈所占的比值較大，推測疏水性較強(qiáng)。ProtScale軟件可分析蛋白質(zhì)疏水曲線，其中正值表示疏水，負(fù)值表示親水，疏水性較高的肽段位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部，親水性較高的肽段位于蛋白質(zhì)分子的表面(圖3)。圖3結(jié)果顯示，RcPIP2蛋白質(zhì)符合膜蛋白的特征，具有較強(qiáng)的疏水性。

表1 RcPIP2蛋白質(zhì)的氨基酸組成

Tab.1 The amino acid composition of RcPIP2 protein%

氨基酸Amino acid比例Proportion 氨基酸Amino acid比例Proportion Ala (A)12.9Lys (K)1.5Arg (R)4.5Met (M)3.3Asn (N)3.6Phe (F)5.1Asp (D)2.1Pro (P)5.4Cys (C)2.4Ser (S)5.7Gln (Q)2.7Thr (T)6.3Glu (E)3.9Trp (W)1.5Gly (G)9.3Tyr (Y)3.3His (H)2.4Val (V)6.9Ile (I)8.1Pyl (O)0.0Leu (L)9.0Sec (U)0.0

2.2.2 RcPIP2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析 利用NCBI中Conserved Domains在線軟件分析保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)，RcPIP2具有膜內(nèi)在蛋白(MIP)家族信號(hào)序列，屬于MIP超家族成員(圖4)。該結(jié)構(gòu)域具有高等植物高度保守序列HINPAVTFG，且在氨基酸的C端和N端包含2個(gè)特有的高度保守的天門冬酰胺-脯氨酸-丙氨酸Asn-Pro-Ala (NPA)結(jié)構(gòu)單元(圖2)。

圖3 RcPIP2蛋白質(zhì)疏水性分析Fig.3 Hydrophobicity analysis of RcPIP2

圖4 RcPIP2蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域Fig.4 Conserved domains of RcPIP2 protein

2.2.3 RcPIP2蛋白質(zhì)信號(hào)肽和和跨膜結(jié)構(gòu)域分析 利用SignalP 4.1軟件進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，RcPIP2不存在信號(hào)肽，推測為非分泌蛋白質(zhì)。利用TMHMM軟件對(duì)RcPIP2跨膜區(qū)分析顯示，膜螺旋中氨基酸期望值高達(dá)134.158 97，存在6個(gè)可能的跨膜區(qū)域(TM1-TM6)，其中37-59，110-132，86-208位氨基酸均是由內(nèi)向外跨膜；69-91，152-174，234-256位氨基酸均是由外向內(nèi)跨膜，且N端和C端都位于膜的內(nèi)側(cè)(圖 5)。

圖5 RcPIP2蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測Fig.5 Prediction of transmembrane domains of RcPIP2 protein

2.2.4 RcPIP2蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 采用SOMPA預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，RcPIP2蛋白質(zhì)擁有α螺旋(h)80個(gè)，占總數(shù)的37.31%；β折疊(e)64個(gè)，占總數(shù)的20.9%；無規(guī)則卷曲(c)148個(gè)，占總數(shù)的38.43%(圖 6)。

藍(lán). α-螺旋；紫. 無規(guī)則卷曲；紅. 延伸鏈；綠. β-轉(zhuǎn)角。Blue.Alpha helix; Purple.Random coil; Red.Extended strand; Green.Beta turn.

利用SWISS-MODEL對(duì)RcPIP2氨基酸三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行在線預(yù)測發(fā)現(xiàn)，RcPIP2蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)與水通道蛋白的高級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致，由水通道蛋白分子組成四聚體，其中每一個(gè)亞基都有一個(gè)通道，這4個(gè)亞基平行分布，在四聚體中間形成第5個(gè)通道(圖 7)。

2.2.5 RcPIP2蛋白質(zhì)一致性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 利用NCBI的Blast軟件進(jìn)行RcPIP2基因編碼氨基酸序列的同源性查找，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RcPIP2蛋白質(zhì)與其他物種的PIP2蛋白質(zhì)相似性較高，與擬南芥(NP_191042.1)、小立碗蘚(AAS65964.1)、玉米(NP_001105616.1)、煙草(NP_001312276.1)、陸地棉(NP_001314334.1)、地錢(PTQ40096.1)、高粱(XP_002446796.1)、大豆(XP_003556232.1)、二穗短柄草(XP_003580150.1)、谷子(XP_004953172.1)和水稻(XP_015645289.1)等物種中的PIP2蛋白質(zhì)的相似性均在66%以上。其中，與小立碗蘚的一致性最高，為67%，這說明在長期的進(jìn)化中，PIP2基因的結(jié)構(gòu)也在進(jìn)化，但是相對(duì)保守。

利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，以上物種被聚為兩大支，其中砂蘚、小立碗蘚和地錢親緣關(guān)系最近，聚為一支(圖8)。

圖7 RcPIP2蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.7 Predicted tertiary structure of RcPIP2 protein

分支上的數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)該節(jié)點(diǎn)可信度。The numbers on the branches represent the reliability percent of bootstraps values based on 1 000 replications.

3 結(jié)論與討論

植物中的水分經(jīng)過長距離運(yùn)輸，利用擴(kuò)展和滲透調(diào)節(jié)的方式進(jìn)入單個(gè)細(xì)胞，在整個(gè)過程中都離不開水分的跨膜運(yùn)輸。而植物水通道蛋白介導(dǎo)的自由水快速被動(dòng)地跨生物膜轉(zhuǎn)運(yùn)便構(gòu)成了植物體水進(jìn)出細(xì)胞的主要途徑。砂蘚可以經(jīng)歷長期的干旱脅迫，復(fù)水后仍能快速地恢復(fù)正常生長，說明其具有獨(dú)特的耐旱、抗旱機(jī)制[25]。本研究成功擴(kuò)增出砂蘚水通道蛋白R(shí)cPIP2基因序列。研究發(fā)現(xiàn)，RcPIP2蛋白屬于MIP超家族，具有保守的HINPAVTFG氨基酸序列，6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，存在2個(gè)特異保守區(qū)(NPA)，分別深入到脂質(zhì)雙層的內(nèi)部，呈中心反向相對(duì)排列，可在膜雙脂層中間重疊成2個(gè)半孔，形成一個(gè)狹窄的水通道，允許水分子通過。NPA是水通道蛋白的特異性保守序列，幾乎所有的MIP均具有此結(jié)構(gòu)域。因此，本研究所獲得的RcPIP2基因基本可確定為水通道蛋白家族成員。

利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)砂蘚水通道蛋白R(shí)cPIP2編碼氨基酸的特性進(jìn)行分析可知，該蛋白質(zhì)為中性蛋白質(zhì)，無信號(hào)肽區(qū)域，說明為非分泌性蛋白質(zhì)，且并不缺乏結(jié)構(gòu)區(qū)域。RcPIP2蛋白質(zhì)共由80個(gè)α螺旋、64個(gè)β折疊和148個(gè)無規(guī)則卷曲構(gòu)成。通過其立體結(jié)構(gòu)可以看出，該蛋白質(zhì)為四聚體形式，中間為高度保守的NPA基序組成的水通道，與水通道蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)相吻合。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，砂蘚、小立碗蘚和地錢均為苔蘚植物中的成員，而RcPIP2與二者的親緣關(guān)系最近，處于同一進(jìn)化枝，進(jìn)一步推測本研究中所得的RcPIP2是PIP2蛋白質(zhì)家族中的一員，研究結(jié)果可為后續(xù)進(jìn)一步研究其功能提供重要的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并最終為苔蘚植物的耐旱機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

目前對(duì)植物水通道蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及其調(diào)節(jié)機(jī)制還知之甚少，真正揭開植物水通道蛋白在植物生命活動(dòng)的分子機(jī)理中的作用所面臨的任務(wù)還十分艱巨[26]。對(duì)抗旱植物水通道蛋白分子水平的研究還需要進(jìn)一步的深入探索。