張 珊，郭啟平，劉媛媛，黨仁美，聞珊珊

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，小麥分子生物學(xué)與生物技術(shù)實驗室，陜西 楊凌 712100)

小麥(TriticumaestivumL.)是人類主要糧食作物之一，種植面積在谷物中占首位[1]。隨著全球水資源的短缺和氣候的變化，小麥的生長環(huán)境面臨著巨大的挑戰(zhàn)[2]，所以提高小麥的耐旱耐鹽性，對維持其可持續(xù)供應(yīng)有重大意義。因此，了解小麥的抗逆分子機制并應(yīng)用于實踐生產(chǎn)對于提高小麥的產(chǎn)量有重要的指導(dǎo)意義。水通道蛋白(Aquaporins, AQPs)又叫水孔蛋白，以轉(zhuǎn)運水分子而得名，是一種位于細胞膜上的內(nèi)在膜蛋白，通過對氣體、水、小分子溶質(zhì)和重金屬的轉(zhuǎn)運來提高植物的抗逆性[3]。小麥水通道蛋白的克隆及表達分析將會為小麥抗逆性研究提供理論基礎(chǔ)。

水通道蛋白分布十分廣泛，幾乎存在于動植物各個組織器官以及生長發(fā)育的各個時期[4]，介導(dǎo)水分的運輸并維持水分平衡[5]，參與細胞的滲透調(diào)節(jié)、生長分化及籽粒和根部的水分運輸?shù)壬磉^程[6-8]。

根據(jù)水通道蛋白的序列同源性和結(jié)構(gòu)特征可以將其分為5個家族，即存在于質(zhì)膜上的質(zhì)膜內(nèi)在蛋白(Plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)、存在于共生根瘤菌體膜上的類似根瘤素26膜內(nèi)在蛋白(Nodulin 26-like intrinsic proteins，NIPs)、位于液胞膜上的液胞膜內(nèi)在蛋白(Tonoplast intrinsic proteins, TIPs)、 小分子堿性膜內(nèi)在蛋白(Small and basic intrinsic proteins, SIPs)以及未鑒定的膜內(nèi)在蛋白(Unclassified X intrinsic proteins, XIPs)[9]。而TIP1.1基因較高水平的轉(zhuǎn)錄能夠促進小麥的線性蒸騰，利于水分和養(yǎng)分的吸收、運輸[10]。

自從1992年分離出第一個水通道蛋白開始[11]，已經(jīng)在馬鈴薯[12]、水稻[13]、小麥[14]等多種植物中克隆并研究了AQPs的功能。液泡膜內(nèi)在水通道蛋白(TIPs)具有高效的透水性，透水效率達到質(zhì)膜水通道蛋白的100倍以上，能夠控制細胞的膨脹或緊縮，維持細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)環(huán)境[15]，對植物非生物脅迫有著很高的耐受性。在擬南芥中過表達PIP1基因增強了其耐旱和耐鹽性[16]。

目前TaAQP7、TaNIP4-1和TaTIP2[17-19]等水通道蛋白已經(jīng)在小麥非生物脅迫中報道過，而TaTIP1-4DL基因未見報道。本研究借助分子克隆及表達分析等手段分析該基因的生物學(xué)特征，研究其表達模式，以了解其作用機制，為小麥抗逆分子育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及試劑

供試材料中國春由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院518實驗室提供。選取抽穗期小麥的旗葉置于-80 ℃冰箱備用，用于總RNA的提取。

反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自德國Roche生物公司；TaqDNA聚合酶來自TaKaRa公司；大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞購自天根生物公司；TRIzol總RNA提取試劑、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA膠回收純化試劑盒和T4DNA連接酶均購自上海生工生物工程技術(shù)公司；引物合成及測序由北京奧科鼎盛生物公司完成。

1.2 總RNA的提取與cDNA的合成

用TRNzol總RNA提取試劑提取小麥旗葉中的總RNA,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA質(zhì)量，用羅氏反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄出cDNA的第一鏈。

1.3 TaTIP1-4DL基因的克隆

以二穗短柄草TIP1(XP_003558815.1)的序列為探針搜索六倍體小麥數(shù)據(jù)庫Ensembl Plants中相似序列，得到4D、4A、4B 3條相似度90%以上的拷貝，分別為TraesCS4D02G308800、TraesCS4A02G410800.1和TraesCS4B02G310900.1。用小麥表達量在線分析軟件Wheat Expression Browser(http://www.wheat-expression.com/)比較3條不同拷貝的表達量水平，選擇在小麥根、葉、籽粒中的表達量較高的4D染色體上的拷貝設(shè)計特異性引物(F-0：5′-CTTGGAGGTG ACCGAAAATG-3′；R-0：5′-GGAGACGATGACGAGAC GC-3′)進行PCR擴增。以小麥旗葉的cDNA為模板擴增基因全長，PCR擴增體系包括TaqDNA聚合酶0.25 μL，10×Buffer緩沖液5 μL，4 μL的dNTPs，1 μL的cDNA(100 ng/μL)模板，上下游引物(5 μmol/L)各1 μL，最后用水補足到50 μL終體積。反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性3 min，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min。之后PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，膠回收電泳片段后連接于T載體，挑陽性克隆送楊凌奧科公司測序，重復(fù)3次，獲得基因序列。

1.4 生物信息學(xué)分析

將所得的TaTIP1-4DL基因的編碼蛋白用在線軟件ExPASy-ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)進行理化性質(zhì)的預(yù)測；運用SignaIP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)和TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在線軟件分別對蛋白的信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)進行預(yù)測；為了解TaTIP1-4DL蛋白的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，運用SPOMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=np%20sa_sopma.html)和Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)分別對蛋白進行二級結(jié)構(gòu)和3D模型的預(yù)測；運用Plant CARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析TaTIP1-4DL基因的啟動子；以TaTIP1-4DL蛋白質(zhì)序列為模板，在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)比對得到不同物種的同源蛋白，使用DNAMAN軟件進行TaTIP1氨基酸多序列比對和保守域分析，并使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建基于Neighbor-joining(Bootstrap值為1 000)的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.5 TaTIP1-4DL基因表達分析

為進一步研究TaTIP1-4DL基因在小麥不同組織中的表達情況，分別提取抽穗期小麥根、莖、葉、潁殼、籽粒的總RNA，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，并用紫外分光光度儀檢測其濃度質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于該基因的組織特異性表達分析。選取小麥對水分最敏感的灌漿期對小麥進行非生物脅迫[20]。將灌漿期的小麥分別置于含有100 μmol/L的ABA，20%的PEG和200 mmol/L的NaCl的水溶液中，并在0，3，6，9，12，24 h時分別取樣品的葉片和籽粒，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于ABA，干旱和鹽脅迫下的表達分析。設(shè)計特異性引物(F-1:5′-TACCAGTGGGTGTACTGGGT-3′；R-1:5′-TTAGT AGTCGGTGGTGGGGA-3′)為TaTIP1-4DL基因的定量引物，小麥Actin作為內(nèi)參，引物為Actin-F：5′-TA GATGCAGTAAAGAACCTGAC-3′；Actin-R：5′-GCCGT GGAGAAGAAGGATC-3′。RT-PCR反應(yīng)體系為：SYBR Mixture 10 μL， cDNA模板(100 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，最后用水補足到20 μL。用Roche LightCycler 480儀器進行RT-PCR試驗，反應(yīng)程序為95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，反應(yīng)重復(fù)40個循環(huán)，每個樣品3次生物學(xué)重復(fù)。用公式2-ΔΔCT計算基因表達量，用SPSS對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，用Excel 2013作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥TaTIP1-4DL基因的克隆

利用特異性引物F-0和R-0對中國春旗葉的cDNA進行PCR擴增，50 μL的PCR產(chǎn)物分2個膠孔進行1%瓊脂糖凝膠電泳，得到大概760 bp的特異性條帶(圖1)。經(jīng)過膠回收、連接、轉(zhuǎn)化、藍白斑篩選等分子試驗，選取陽性克隆進行搖菌、測序。測序結(jié)果與Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果顯示與4DL上的序列相似度達到100%，序列全長771 bp，將其命名為TaTIP1-4DL基因。

2.2 TaTIP1-4DL蛋白生物信息學(xué)分析

2.2.1 TaTIP1-4DL蛋白的理化性質(zhì)分析 利用ExPASy-ProtParam分析得到小麥TaTIP1-4DL蛋白的分子式為C1229H1889N299O329S；分子質(zhì)量為26.3 ku；理論等電點(PI)為6.82；不穩(wěn)定指數(shù)(Ⅱ)計算為25.48，為穩(wěn)定性蛋白；總親水性平均數(shù)為0.865，可以推測為疏水性蛋白。TaTIP1-4DL蛋白包括257個氨基酸，其中丙氨酸(Ala)占 13.2%，甘氨酸(Gly)占14.0%，纈氨酸(Val)占10.5%。

M.D2000plus DNA分子質(zhì)量標準；1-2.PCR產(chǎn)物。M.D2000plus DNA ladder；1-2.PCR products.

2.2.2 TaTIP1-4DL蛋白的信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測 利用SignalP 4.1 Server在線軟件分析表明，TaTIP1-4DL蛋白不存在信號肽結(jié)構(gòu)。TMHMM的跨膜區(qū)預(yù)測表明：TaTIP1-4DL蛋白含有6個可能的跨膜區(qū)域， 為水通道蛋白的典型跨膜結(jié)構(gòu)。其中由內(nèi)向外跨膜的有17-39位，101-123位和173-195位氨基酸，由外向內(nèi)跨膜的有59-81位，138-160位和215-237位氨基酸(圖2)。

圖2 TaTIP1-4DL蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.2 Prediction of transmembrane domains of TaTIP1-4DL

2.2.3 TaTIP1-4DL蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測 SOPMA在線預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)表明，α-螺旋和無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)含量較多，都占到36.96%，其次是β-片層占到20.23%，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)所占最少為5.84%。Phyre2進行3D模型預(yù)測如圖3，模型的置信度達到100%，氨基酸序列的覆蓋度達到90%，因此，可以認為該蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測是可靠的。從模型中可以看出該蛋白結(jié)構(gòu)為沙漏模型，包括6個貫穿兩面的長α螺旋和2個幾乎頂對頂放置的短α螺旋。

圖3 TaTIP1蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of three dimensional structure of TaTIP1 protein

2.2.4TaTIP1-4DL基因的啟動子順式作用元件分析 啟動子可以控制基因表達的起始和表達程度，是基因的重要組成部分，對啟動子的元件進行分析可以為更深入了解TaTIP1-4DL基因的功能奠定基礎(chǔ)。Plant CARE軟件對該基因啟動子序列進行分析，結(jié)果表明：該基因啟動子區(qū)包含激素響應(yīng)元件例如脫落酸響應(yīng)元件(ABRE、ABRE3a、ABRE40)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif、 TGACG-motif)。脅迫響應(yīng)元件包括與干旱和鹽脅迫都相關(guān)的DRE元件和光響應(yīng)元件(G-Box、G-box、I-box、GF1-motif)。另外還包括胚乳特異性表達元件(GCN4-motif)。上述順式作用元件分析表明，植物激素與非生物脅迫可能影響TaTIP1-4DL基因的表達。

2.2.5TaTIP1-4DL基因氨基酸序列比對及進化分析 通過DNAMAN軟件分析TaTIP1-4DL基因氨基酸序列與來自高粱(XP_002465859.1)、玉米(NP_001104896.1)、二穗短柄草(XP_003558815.1)和山羊草(XP_020178611.1)的TIP1氨基酸序列進行多重比對，分析其保守區(qū)氨基酸序列。結(jié)果如圖4所示，所有參比物種的TIP1蛋白氨基酸序列相似度達到91.83%，其中小麥與山羊草的氨基酸序列最相似，可以達到93.0%。說明小麥中TIP1基因的氨基酸序列與其他物種的氨基酸序列具有高度同源性。另外，參比物種的氨基酸序列中都含有6個保守跨膜區(qū)和2個保守的NPA基序，這也是液泡膜內(nèi)在蛋白家族的典型特征[21]。

TM 1-6 代表6個跨膜區(qū)域；2個方框表示2個保守的NPA基序。TM 1-6 represented transmembrane domains；Two boxes respresent the two conserved NPA motifs.

利用MEGA 7.0繪制系統(tǒng)進化樹，結(jié)果顯示(圖5)，所有參比物種可以分為兩大類，木薯、番茄等雙子葉植物一類，小麥、玉米等單子葉植物一類。其中TaTIP1-4DL蛋白與山羊草的親緣關(guān)系最近，其次是黑麥草，二穗短柄草將三者聚類在一起。該進化結(jié)果也與氨基酸比對的結(jié)果相符。

2.3 TaTIP1-4DL基因表達分析

對小麥根、莖、葉、籽粒、潁殼的表達分析顯示：TaTIP1-4DL基因在這5個組織中都有表達，但是表達水平存在差異。其中，在葉中的表達量最高，可以達到莖中的9.5倍，而根、潁殼、籽粒中的表達量沒有明顯的差別，可以得出該基因為組成型表達，且在葉中表達量較高。ABA、PEG和的NaCl的脅迫表達分析表明：小麥葉片和根組織中TaTIP1-4DL基因在脫落酸、干旱和鹽脅迫處理下的表達量的變化趨勢相似，都是先上升后下調(diào)。另外，葉子中TaTIP1-4DL基因的表達量變化比籽粒的明顯。脫落酸脅迫表明，在處理的第6小時葉和籽粒中基因的表達量都達到最高，之后隨著脅迫時間的增加逐漸下調(diào)。干旱脅迫結(jié)果表明，籽粒中TaTIP1-4DL基因的表達量也呈現(xiàn)先上升后下調(diào)的趨勢，但是葉中在處理后的第6小時表達量達到最高，為處理前的14倍，之后迅速下降，而后又有上升的趨勢。鹽脅迫的結(jié)果和ABA相似，表達量都是先上調(diào)后下調(diào)，且葉中的表達量在第6小時時達到最高(圖6)。以上分析表明，TaTIP1-4DL基因在ABA、干旱和鹽的脅迫下被誘導(dǎo)表達，這對提高小麥的抗逆性有重要作用。

圖5 小麥與其他物種TIP1蛋白的進化分析Fig.5 Phylogene tree of TIP1 proteins from wheat and other species

不同小寫字母顯著差異(P<0.05 )。Significant difference in different lowercase letters (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

水通道蛋白對水分子有高度選擇性，在促進水分吸收和遠距離運輸中發(fā)揮重要作用。蛋白質(zhì)的功能是通過其結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)的，AQPs也不例外。本試驗基于小麥數(shù)據(jù)庫克隆到TaTIP1-4DL基因，結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示TaTIP1-4DL蛋白也具有APQs典型的沙漏結(jié)構(gòu)，符合APQs的經(jīng)典結(jié)構(gòu)模型[22]。氨基酸比對結(jié)果顯示，TaTIP1-4DL蛋白也具有2個保守的NPA基序，6個典型的跨膜結(jié)構(gòu)域，說明水通道蛋白在進化和結(jié)構(gòu)功能上具有一定的保守性。小麥和其他幾種植物TIP1相似蛋白的進化樹分析表明，小麥的TIP1蛋白與山羊草、黑麥草、二穗短柄草具有高度同源性，表明該蛋白氨基酸序列可以作為植物分類的依據(jù)。

水通道蛋白的一個特征是在各個組織中普遍表達[23]，但在各個組織中的表達量會有差異。本試驗對克隆出的TaTIP1-4DL基因做RT-PCR分析得出，TaTIP1-4DL基因為組成型表達，在小麥的各個組織中都有表達，這與前人在毛竹[24]、大麥[25]中對TIP1基因的表達分析結(jié)果一致。而TaTIP1-4DL基因在抽穗期的不同組織中葉子的表達量最高，這與TIP1在楊樹中的試驗結(jié)果一致[26]。猜測這與TaTIP1基因?qū)λ值霓D(zhuǎn)運有關(guān)，抽穗期的小麥，葉片細胞需要保持足夠的細胞膨壓用于孕育籽粒，相似的情況出現(xiàn)在玉米中[27]?，F(xiàn)已有研究表明，水通道蛋白與正在生長或分裂的組織或器官的細胞擴增呈正相關(guān)[10]。

植物應(yīng)對非生物脅迫時會通過細胞膨壓來維持體內(nèi)滲透平衡和離子平衡，降低外界因素帶來的傷害[28]，而TIP類蛋白負責調(diào)節(jié)細胞膨壓，維持細胞結(jié)構(gòu)的完整性。Plant CARE軟件預(yù)測TaTIP1-4DL基因的啟動子內(nèi)含有與脅迫響應(yīng)相關(guān)的應(yīng)答元件，暗示該基因可能參與小麥的逆境脅迫。對小麥做進一步的逆境脅迫表達分析，結(jié)果顯示：高濃度脫落酸、干旱、高鹽幾種脅迫方式都對TaTIP1-4DL基因在籽粒和葉片中的表達有不同程度的誘導(dǎo)，普遍遵循先上調(diào)后下降的趨勢。在葉片中的誘導(dǎo)程度普遍高于籽粒，并且脫落酸和干旱對TaTIP1-4DL基因表達的誘導(dǎo)較大。其他物種包括煙草[29]、水稻[30]、菜用大豆[31]等中都有關(guān)于對TIP1基因的相似脅迫研究。

本研究克隆出小麥TaTIP1-4DL基因，該基因編碼257個氨基酸，其蛋白結(jié)構(gòu)符合水通道蛋白的經(jīng)典結(jié)構(gòu)模型。組織特異性表達顯示該基因在各個組織中都有表達，為組成型表達。非生物脅迫表達分析顯示，脫落酸、干旱、高鹽都對TaTIP1-4DL基因有不同程度的誘導(dǎo)。該試驗為TaTIP1-4DL基因在小麥非生物脅迫中的抗逆功能研究有一定實際意義，而其中的分子機制還需進一步研究。