呂 莉 王 元 顏澤清 婁紅軍

透明質(zhì)酸(Hyaluronic Acid，HA)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰氨基葡糖構(gòu)成的雙糖單位連接而成的高分子黏性多糖，是構(gòu)成機(jī)體內(nèi)關(guān)節(jié)軟骨及滑液的主要成分，它在機(jī)體關(guān)節(jié)內(nèi)能起到保護(hù)軟骨以及合成滑膜內(nèi)HA的作用。1934年美國(guó)的Meyer等首先從牛眼玻璃體中分離出該物質(zhì)。相關(guān)研究表明，HA具有獨(dú)特的皮膚保濕、營(yíng)養(yǎng)、抗衰老、抗菌消炎、促進(jìn)傷口愈合、改善關(guān)節(jié)功能及藥物載體等功能。相比于傳統(tǒng)的關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸治愈關(guān)節(jié)炎，口服透明質(zhì)酸在改變傳統(tǒng)給藥方式的同時(shí)，還能通過不同的途徑發(fā)揮作用功效。商品用HA多以其鈉鹽形式存在，即透明質(zhì)酸鈉（Sodium Hyaluronate）。目前，口服透明質(zhì)酸鈉功效的研究?jī)H僅涉及到改善軟骨病癥狀、緩解關(guān)節(jié)炎的病痛等方面。本試驗(yàn)主要通過飼喂含有一定比例的透明質(zhì)酸鈉犬糧后，研究觀察其對(duì)于改善犬髖關(guān)節(jié)發(fā)育的效果及預(yù)后。

據(jù)有關(guān)報(bào)道，犬類關(guān)節(jié)炎損害程度與其關(guān)節(jié)軟骨中所含透明質(zhì)酸呈強(qiáng)烈負(fù)相關(guān)（r＝-0.696，p＜0.001），因而派生出一種臨床治療關(guān)節(jié)炎的方法，直接在關(guān)節(jié)腔中注射透明質(zhì)酸，也取得了良好的效果。然而，注射級(jí)別的HA對(duì)無菌、蛋白等指標(biāo)要求嚴(yán)格，成本高昂，手術(shù)操作對(duì)醫(yī)生要求較高。國(guó)外也有許多報(bào)道，在動(dòng)物飼料中添加HA，也取得了良好的效果。本實(shí)驗(yàn)比較在飼料中添加氨基葡萄糖、軟骨素和透明質(zhì)酸鈉的幾種方式，研究其治療犬類關(guān)節(jié)炎的效果。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用犬糧由南京警犬研究所科技開發(fā)中心動(dòng)物食品廠特制。其中，基礎(chǔ)犬糧中不含有葡萄糖胺、軟骨素及透明質(zhì)酸鈉。

本實(shí)驗(yàn)用透明質(zhì)酸鈉由華熙生物科技股份有限公司提供的貝熙TM飼料添加劑 透明質(zhì)酸鈉。各組犬用日糧營(yíng)養(yǎng)成份見表1：

表1：實(shí)驗(yàn)用日糧營(yíng)養(yǎng)成份表

（二）試驗(yàn)犬

在退役老年德國(guó)牧羊犬中，選取臨床上具有典型髖骨關(guān)節(jié)炎癥狀的30頭犬進(jìn)行試驗(yàn)；外觀癥狀主要表現(xiàn)為后肢行走異常、關(guān)節(jié)有壓痛等；X線觀察主要表現(xiàn)有關(guān)節(jié)間隙增寬、承壓關(guān)節(jié)面不平整等情況。將這30頭犬隨機(jī)分成5組，每組6頭犬，采用Lequesne 指數(shù)進(jìn)行關(guān)節(jié)評(píng)分后，進(jìn)行個(gè)別調(diào)整，降低組間評(píng)分差異。各組Lequesne評(píng)分情況如表2：

表2：實(shí)驗(yàn)初各組Lequesne評(píng)分均數(shù)表

經(jīng)過方差分析，各組間Lequesne評(píng)分均數(shù)不存在顯著性差異（＞ 0.05）。

（三）試驗(yàn)犬管理

所有試驗(yàn)犬按統(tǒng)一采用封閉式飼養(yǎng)管理，集中飼養(yǎng)，一犬一舍，定量喂食（按體重的2%計(jì)算飼喂量每天，約0.6kg），喂食對(duì)應(yīng)：基礎(chǔ)犬糧組喂食1組，葡萄糖胺+軟骨素組喂食2組，0.03%HA組喂食3組，0.09%HA組喂食4組，葡萄糖胺+軟骨素+HA組喂食5組。

每天早晚各飼喂一次，試驗(yàn)中注意觀察各組犬的食欲，保證飲水，每天定時(shí)打掃犬舍衛(wèi)生，每周給犬體進(jìn)行一次體表梳理和清潔，每月進(jìn)行一次驅(qū)蟲處理。除試驗(yàn)測(cè)試外，不安排犬舍外運(yùn)動(dòng)。試驗(yàn)觀測(cè)時(shí)間為24周。

（四）測(cè)試方法與評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

實(shí)驗(yàn)24周后，觀察記錄實(shí)驗(yàn)犬的關(guān)節(jié)表現(xiàn)及關(guān)節(jié)指數(shù)，觀察記錄疼痛或不適、晨僵、關(guān)節(jié)腫脹、步行痛等。

本試驗(yàn)采用國(guó)際骨關(guān)節(jié)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Lequesne 指數(shù)：

1.關(guān)節(jié)休息痛:正常行0分;輕度疼痛主1分;疼痛較重計(jì)2分;疼痛嚴(yán)重計(jì)3分。

2.活動(dòng)痛:正常計(jì)0分;上下樓有癥狀計(jì)1分;上下樓疼痛計(jì)2分;行走時(shí)疼痛計(jì)3分。

3.壓痛：正常計(jì)0分;重壓時(shí)疼痛計(jì)1分；中度壓痛計(jì)2分；輕度壓痛計(jì)3分。

4.腫脹：正常計(jì)0分;稍腫計(jì)1分；軟組織腫脹計(jì)2分；腫脹嚴(yán)重計(jì)3分。

5.晨僵：正常計(jì)0分;僵硬但很快恢復(fù)（小于5分鐘）計(jì)1分；僵硬但短時(shí)間恢復(fù)（5～10分鐘）計(jì)2分；僵硬但較長(zhǎng)時(shí)間恢復(fù)（10分鐘以上）計(jì)3分。

6.行走能力：行走沒有限制計(jì)0分；步態(tài)行走異常計(jì)1分；步態(tài)行走異常緩慢計(jì)2分；步態(tài)嚴(yán)重緩慢計(jì)3分；

7.均分小于0.5，表示輕度功能障礙；均分處于0.5～1.33之間，表示中度功能障礙；處于1.33～2.33之間，表示重度功能障礙；大于2.33分以上表示功能障礙極其嚴(yán)重。

（五）統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel方差分析，比較其P-value。差異判斷標(biāo)準(zhǔn)為：P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

試驗(yàn)24周后，Lequesne指數(shù)各項(xiàng)評(píng)分與分別與實(shí)驗(yàn)初相比，其休息痛、活動(dòng)痛、壓痛、腫脹、晨僵、行走能力等各項(xiàng)指標(biāo)均有變化。各組實(shí)驗(yàn)犬的Lequesne指數(shù)平均數(shù)的變化情況如下圖1所示：

圖1 犬關(guān)節(jié)炎Leguesne評(píng)分變化

其中，實(shí)驗(yàn)2組與1組間不存在顯著性差異（P＞0.05），說明在實(shí)驗(yàn)期間，添加0.5%的葡萄糖胺和0.2%的軟骨素組，對(duì)犬的關(guān)節(jié)炎沒有明顯的改善作用。實(shí)驗(yàn)3組與1組間存在顯著性差異（P＜0.05），說明在實(shí)驗(yàn)期間，添加0.03%的透明質(zhì)酸，對(duì)犬的關(guān)節(jié)炎具有明顯的改善作用。實(shí)驗(yàn)4組與1組間、實(shí)驗(yàn)5組與1組間存在極顯著性差異（P＜0.01），說明在實(shí)驗(yàn)期間，添加0.09%的透明質(zhì)酸鈉，或者添加0.25%的葡萄糖胺、0.1%的軟骨素、0.03%透明質(zhì)酸鈉組合，對(duì)實(shí)驗(yàn)犬關(guān)節(jié)炎具有明顯的改善作用。具體方差比較數(shù)據(jù)見表3：

表3：實(shí)驗(yàn)?zāi)└鹘M與第1組間的Lequesne值方差比較情況

第1組實(shí)驗(yàn)犬的Lequesne評(píng)分值，實(shí)驗(yàn)?zāi)ň?.64）與實(shí)驗(yàn)初（均值1.44）相比，有所上升，但經(jīng)過方差分析，二者差異不顯著。表明實(shí)驗(yàn)犬的關(guān)節(jié)炎狀態(tài)經(jīng)過24周的發(fā)展，雖有加重趨勢(shì)，但其差異不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其方差比較情況見表4：

表4：第1組實(shí)驗(yàn)初與實(shí)驗(yàn)?zāi)㎜equesne值方差比較

經(jīng)過方差分析，實(shí)驗(yàn)?zāi)┑?組與第2組間存在顯著差異；說明在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)，相比較添加葡萄糖胺和軟骨素，添加0.03%的HA對(duì)犬關(guān)節(jié)炎具有明顯的改善作用。第4組與第2組間、第5組與第2組間存在極顯著差異；說明在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)，相比較添加葡萄糖胺和軟骨素，添加0.09%的HA或者添加葡萄糖胺+軟骨素+HA組合，對(duì)犬關(guān)節(jié)炎具有極其明顯的改善作用。其具體P值如表5：

表5：其它各組間Lequesne值方差比較情況

三、分析與討論

透明質(zhì)酸為關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)及滑液的主要成分，在關(guān)節(jié)腔內(nèi)對(duì)修復(fù)細(xì)胞提供網(wǎng)狀支持和營(yíng)養(yǎng)環(huán)境、活化細(xì)胞表面特殊膜受體，并具有潤(rùn)滑、緩沖應(yīng)力等作用。近幾年，透明質(zhì)酸鈉常用于治療骨關(guān)節(jié)炎，其治愈功能備受關(guān)注，在臨床中的應(yīng)用越來越多。目前，對(duì)于關(guān)節(jié)炎而言，常常通過注射外源性的HA，或口服含HA的營(yíng)養(yǎng)物，能夠補(bǔ)充關(guān)節(jié)滑液中消耗的HA，并促進(jìn)修復(fù)磨損的軟骨膜層，改善受損的關(guān)節(jié)；另外HA在關(guān)節(jié)內(nèi)具有清除自由基功能，調(diào)節(jié)關(guān)節(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬作用及白細(xì)胞趨化性，從而抑制炎癥反應(yīng)，阻止關(guān)節(jié)軟骨退化。

通常，在許多先期的處方犬糧中，輔助治療關(guān)節(jié)炎的營(yíng)養(yǎng)添加物就是葡萄糖胺和軟骨素，在本實(shí)驗(yàn)中，沒有明顯的效果，并非否定它們對(duì)修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的作用，在本實(shí)驗(yàn)中沒有藥物介入，葡萄糖胺和軟骨素的輔助治療作用難以單獨(dú)發(fā)揮。在許多HA治療犬的關(guān)節(jié)炎的報(bào)道，有的是犬保健品，有的是添加在犬糧中，其組方一般葡萄糖胺+軟骨素+透明質(zhì)酸鈉組合，其中透明質(zhì)酸的添加量很少，主要是與其成本較高有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)設(shè)5組，其中有3組分別添加了0.03%、0.09%和0.03%（另加葡萄糖胺和軟骨素），相對(duì)劑量比較大，在沒有其它藥物干預(yù)的情況下，在24周內(nèi)，實(shí)驗(yàn)犬的關(guān)節(jié)狀態(tài)分別得到了明顯的改善。但其劑量或者組方，還需要進(jìn)一步優(yōu)化，以期找到添加量更合理、治療效果更好的組方。

本試驗(yàn)中，添加葡萄糖胺和軟骨素，對(duì)犬關(guān)節(jié)炎的改善作用不如添加HA的組。在犬糧單獨(dú)添加0.03%HA，能起到改善關(guān)節(jié)炎的作用，如果HA添加量達(dá)到0.09%，作用更加顯著。在傳統(tǒng)配方中添加少量HA，能非常顯著地改善關(guān)節(jié)炎狀態(tài)。在臨床應(yīng)用時(shí)，要保障犬的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、同時(shí)限制犬運(yùn)動(dòng)。

從實(shí)驗(yàn)犬的實(shí)驗(yàn)?zāi)┢诒憩F(xiàn)來看，雖然第3組、第4組、第5組犬的關(guān)節(jié)炎從重度功能障礙狀態(tài)改善到中度功能障礙狀態(tài)，但離輕度功能障礙狀態(tài)或恢復(fù)正常狀態(tài)，還有較大差距。但也有個(gè)體，基本上恢復(fù)正常，其實(shí)驗(yàn)初的關(guān)節(jié)炎程度很微小，也就是說，HA或含HA組方，對(duì)輕度關(guān)節(jié)炎具有一定的治愈作用，對(duì)重度關(guān)節(jié)炎也具有明顯的改善作用。

透明質(zhì)酸對(duì)骨關(guān)節(jié)的修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過程，在其治療機(jī)理上，有些報(bào)道相互矛盾，因而需要進(jìn)一步的研究，但其應(yīng)用會(huì)得到進(jìn)一步推廣。