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        插田泡果實花色苷萃取方法比較及微波萃取條件優(yōu)化

        2019-11-04 08:41:56蔣華梅王向前
        關(guān)鍵詞:花色酸化微波

        蔣華梅, 王向前, 楊 丹

        (1.貴陽學(xué)院 化學(xué)與材料工程學(xué)院, 貴州 貴陽 550005;2.貴陽學(xué)院圖書館, 貴州 貴陽 550005)

        薔薇科懸鉤子屬類植物插田泡(RubuscoreanusMaq.),全世界分布廣泛,中國主要分布于貴州、陜西、安徽、四川等地。插田泡果實6-8月成熟,營養(yǎng)豐富,富含花色苷、超氧化物歧化酶、維生素C、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分[1-3]?;ㄉ諏偎苄渣S酮多酚類化合物,具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂、改善胰島素抵抗、抗腫瘤、抗突變及預(yù)防心肌缺損等生物活性[4-7]。

        植物花色苷的萃取方法有溶劑法、微波輔助法、超聲波輔助法、酶法、超臨界流體萃取法等[4,8-11]。溶劑法操作簡便,但提取率不高;酶法提取率高,但反應(yīng)條件的微小波動會使酶活大大降低,且提取過程中可能產(chǎn)生新的化學(xué)物質(zhì),影響提取物純度;超臨界流體萃取法提取率高,但儀器昂貴;微波、超聲輔助法操作簡便,省時省力,節(jié)約試劑且提取率高。

        目前,插田泡果實花色苷的研究僅涉及溶劑振蕩萃取和抗氧化活性方面的內(nèi)容[2]。為完善插田泡果實花色苷的萃取方法及提高花色苷得率,實驗首先比較了微波輔助法、超聲波輔助法、超聲- 微波協(xié)同萃取法3種方法對花色苷得率的影響,并采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化插田泡果實花色苷的微波萃取條件,以期為插田泡植物資源利用及其花色苷的研究提供借鑒。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        插田泡果實于2018年6月采自貴州省安順市西秀區(qū),挑選紫黑色成熟果實超純水洗凈,-40 ℃冰箱冷凍儲存?zhèn)溆?。無水乙醇、氫氧化鈉、醋酸鈉、氯化鉀,均為分析純,重慶川東化工有限公司;鹽酸(分析純),西隴化工有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        FA1104型電子分析天平,上海西艾電子有限公司;BluStar- A型紫外- 可見分光光度計,北京萊伯泰科儀器股份有限公司;CW- 100型超聲- 微波協(xié)同萃取儀,上海比朗儀器制造有限公司;PHS- 3C型精密酸度計,上海雷磁創(chuàng)益儀器儀表有限公司。

        1.3 實驗方法

        1.3.1最大吸收波長的確定

        準(zhǔn)確稱取5.00 g插田泡果實,研缽研碎,轉(zhuǎn)移至250 mL三口燒瓶中,加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液(pH值 2)150 mL,于超聲- 微波協(xié)同萃取儀中微波反應(yīng)2 min,過濾,收集濾液。濾液在200~700 nm范圍內(nèi)進行掃描,確定花色苷的最大吸收波長。

        1.3.2花色苷得率的測定

        參照插田泡果實花色苷及玫瑰茄紅素[2,12-13]測定方法。插田泡果實解凍后準(zhǔn)確稱取5.00 g研碎,不同條件下萃取、抽濾,收集濾液,濾液定容至250 mL得到插田泡果實花色苷粗提液。準(zhǔn)確移取2 mL插田泡果實花色苷粗提液與鹽酸緩沖液(pH 值1.0)6 mL混合,搖勻;再準(zhǔn)確移取2 mL花色苷粗提液與醋酸緩沖液(pH值 4.5)6 mL混合,搖勻。分別用相應(yīng)的緩沖溶液為空白對照,于最大吸收波長538 nm處測吸光度,花色苷得率計算見式(1)。

        (1)

        式(1)中,w為插田泡果實花色苷得率,mg/100 g;ΔA為ApH 1和ApH 4.5的吸光度差值;V為插田泡果實花色苷提取液的總體積,mL;F為稀釋倍數(shù);M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量,449 g/mol;ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù),29 600 L/(mol·cm);b為比色皿厚度,1 cm;m為樣品質(zhì)量,g。

        1.3.3花色苷萃取方法的確定

        準(zhǔn)確稱取3份各5.00 g樣品,在料液比1∶30(g/mL)、體積分?jǐn)?shù)75%乙醇(pH 值2)的條件下,分別以微波150 W、超聲波150 W、超聲- 微波協(xié)同300 W,按1.3.2節(jié)方法進行萃取反應(yīng)1 min,平行實驗3次。

        1.3.4單因素實驗設(shè)計

        按1.3.2節(jié)方法,料液比1∶30(g/mL)、萃取溫度35 ℃,選取微波功率(90、120、150、180、210 W)、微波提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 min)、酸化乙醇體積分?jǐn)?shù)(55%、65%、75%、85%)、酸化乙醇pH值(1、2、3、4)4個因素進行實驗,考察單一因素改變對插田泡果實花色苷得率的影響,平行重復(fù)3次,結(jié)果取平均值。

        1.3.5響應(yīng)面試驗設(shè)計

        根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選擇3個因素微波功率(X1)、微波提取時間(X2)、酸化乙醇體積分?jǐn)?shù)(X3)進行響應(yīng)面試驗,根據(jù)Box- Behnken試驗設(shè)計原理,以插田泡果實花色苷得率(Y)為響應(yīng)值,利用Design-Expert 8.0.6進行三因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗,以確定插田泡果實花色苷的最佳微波萃取條件,因素水平見表1。

        表1 響應(yīng)面試驗因素水平Tab.1 Factors and levels of response surface design

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        采用Excel、 Design-Expert 8.0.6和Origin軟件進行數(shù)據(jù)處理。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 最大吸收波長的確定結(jié)果

        圖1 插田泡花色苷紫外可見光譜Fig.1 UV- Vis spectroscopy of anthocyanin from Rubus coreanus Maq.

        花色苷類物質(zhì)經(jīng)紫外- 可見光譜掃描后有2個特征峰,一個在紫外光區(qū)270~290 nm附近,與苯甲酰基有關(guān);另一個在可見光區(qū)500~540 nm,與肉桂酰基有關(guān)。圖1顯示插田泡果實花色苷在292 nm和538 nm波長處有特征吸收峰。310 nm處吸收峰,表明插田泡果實花色苷含有?;鶊F,?;乃釣閷ο愣顾醄4,14]。因此,實驗選取538 nm作為測定波長。

        2.2 花色苷萃取方法的確定結(jié)果

        微波輔助法、超聲波輔助法、超聲- 微波協(xié)同萃取法的花色苷得率分別為317.75、257.19、253.10 mg/100 g。結(jié)果表明,微波輔助法比超聲波和超聲- 微波協(xié)同萃取法更有利于插田泡果實花色苷的快速溶出,提高花色苷得率。超聲- 微波協(xié)同萃取法花色苷得率稍低,可能是由于微波、超聲波同時作用,體系溫度較高(最高至36 ℃),造成部分花色苷分解(花色苷在此介質(zhì)中的最低分解溫度是35 ℃),得率降低。因此實驗選用微波輔助萃取的方法對插田泡果實花色苷進行提取。

        2.3 單因素實驗結(jié)果

        圖2 各因素對花色苷得率的影響Fig.2 Effects of factors on anthocyanin yield

        各因素對花色苷得率的影響如圖2。由圖2(a)可知,插田泡果實花色苷得率隨著微波功率的升高出現(xiàn)明顯的上升趨勢。當(dāng)功率到達150 W時,花色苷得率最大,隨后出現(xiàn)下降趨勢。功率的升高使花色苷更易溶出,花色苷得率增大。但當(dāng)微波功率過大,體系溫度太高,促使花色苷分解,得率減少[8]。由圖2(b)可知,插田泡果實花色苷得率隨微波提取時間延長先快速增加,提取1.0 min時達到最大294.39 mg/100 g;之后隨著微波提取時間的延長,體系溫度升高,由于花色苷較差的熱穩(wěn)定性,花色苷得率反而減小。由圖2(c)可知,插田泡果實花色苷得率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加逐漸增大;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)超過75%時,花色苷得率降低,這是由于有機溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加降低了親水性花色苷的提取率,導(dǎo)致總花色苷得率降低[15-16]。由圖2(d)可知,插田泡果實花色苷得率隨酸化乙醇pH值的增大而增加,當(dāng)pH 值2時達到最大;之后花色苷得率隨pH值的增大而緩慢下降。說明花色苷類物質(zhì)的提取應(yīng)在適宜酸度范圍內(nèi)進行,酸度過高(如pH 值1)或過低將降低花色苷穩(wěn)定性,導(dǎo)致花色苷的水解及降解[17]。

        2.4 微波萃取條件優(yōu)化結(jié)果

        2.4.1響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果分析

        表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Experimental design and results for response surface analysis

        2.4.2交互作用對花色苷得率的影響

        根據(jù)回歸方程繪出響應(yīng)面圖及等高線圖,見圖3~圖5,分析微波功率、微波提取時間、酸化乙醇體積分?jǐn)?shù)3個因素對插田泡果實花色苷得率的交互影響。

        表3 花色苷得率的方差分析Tab.3 Variance analysis of anthocyanin yield

        差異顯著,P<0.05;差異極顯著,P<0.000 1;差異不顯著,P>0.05。

        圖3 微波功率與提取時間對花色苷得率的交互影響Fig.3 Interactions of microwave power and extraction time on anthocyanin yield

        圖4 微波功率與乙醇體積分?jǐn)?shù)對花色苷得率的交互影響Fig.4 Interactions of microwave power and ethanol concentration on anthocyanin yield

        圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時間對花色苷得率的交互影響Fig.5 Interactions of ethanol concentration and extraction time on anthocyanin yield

        由圖3可知,隨著微波提取時間和微波功率的增加,插田泡花色苷得率先增大后減少,響應(yīng)面的坡度陡峭,表明交互效應(yīng)顯著。由圖4可知,隨著酸化乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波功率的增加,插田泡花色苷得率先增大后減少,坡度更為陡峭,等高線呈橢圓形,說明交互作用更為顯著。由圖5可知,隨著酸化乙醇體積分?jǐn)?shù)和微波提取時間的增大,插田泡花色苷得率先緩慢地增大后減少,坡度較平緩,說明兩因素的交互作用不顯著。從等高線可知3個因素對花色苷得率的影響由大到小依次為微波提取時間、酸化乙醇體積分?jǐn)?shù)、微波功率。

        2.4.3優(yōu)化提取條件的確定及驗證實驗結(jié)果

        通過Design-Expert 8.0.6軟件分析得到插田泡果實花色苷的優(yōu)化提取條件為微波功率147.70 W、微波提取時間1.10 min、酸化乙醇體積分?jǐn)?shù)74.13%(pH值2)??紤]實際操作的簡便性,將以上條件調(diào)整為微波功率148 W、微波提取時間1.10 min、酸化乙醇體積分?jǐn)?shù)74%(pH值2),并進行5次平行實驗,測得插田泡果實花色苷得率為372.39 mg/100 g,與模擬計算值基本接近,表明預(yù)測值與真實值之間有很好的擬合性,進一步驗證了模型的可靠性[9]。

        3 結(jié) 論

        微波萃取法的插田泡果實花色苷得率高于超聲波和超聲- 微波協(xié)同萃取法,也高于溶劑振蕩萃取法的花色苷得率[2],說明微波輔助萃取技術(shù)更有利于插田泡果實細(xì)胞中花色苷組分的浸出,萃取效率更高。通過單因素實驗和響應(yīng)面試驗,確定插田泡果實花色苷的優(yōu)化微波萃取工藝參數(shù)為微波功率148 W、微波提取時間1.10 min、酸化乙醇體積分?jǐn)?shù)74%(pH值 2),該條件花色苷得率可達372.39 mg/100 g。

        該研究為插田泡果實花色苷萃取提供了一種經(jīng)濟、環(huán)保、高效可行的方法,但插田泡花色苷資源的純化、鑒定、生物活性及作用機制、作用基因、靶器官、受體等方面的研究仍然任重而道遠。隨著插田泡植物資源研究的深入,插田泡花色苷必將充分發(fā)揮其在醫(yī)藥、食品、化妝品等領(lǐng)域的價值,為人類健康做出積極有益的貢獻。

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