毛晶晶，李澤嬌，趙雨晴，袁 澍，袁 明*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，四川雅安 625014；2.四川農(nóng)業(yè)大學資源學院，成都 611130）

在黑暗或光照條件下，被子植物原質(zhì)體發(fā)育形成黃化質(zhì)體的過程稱為暗形態(tài)建成（skotomorphogenesis）或黃化作用；相反，在光照條件下植物幼苗前質(zhì)體或黃化質(zhì)體發(fā)育成葉綠體的過程稱為光形態(tài)建成（photomorphogenesis）[1-2]。轉(zhuǎn)綠（greening）就是指植物幼苗從暗形態(tài)建成向光形態(tài)建成轉(zhuǎn)變的過程[3-4]，葉綠素合成是該過程中最重要的生理生化反應(yīng)[1-2]。

葉綠素 a（chlorophyll a，Chl a）和葉綠素 b（chlorophyll b，Chl b）在光合作用中的功能是捕獲光能并驅(qū)動電子轉(zhuǎn)移[5]，對植物的生長發(fā)育及作物產(chǎn)量具有極其重要的作用。植物葉綠素生物合成是一個復雜且高度有序的過程，主要包括3 個部分：四吡咯代謝共同途徑、鎂分支途徑和葉綠素循環(huán)途徑[5]。四吡咯代謝共同途徑中間產(chǎn)物包括：δ-氨基乙酰丙酸（δ-aminolevulinic acid，ALA）、單卟啉膽色素原（porphobilinogen，PBG）、尿卟啉原Ⅲ（uroporphyrinogen Ⅲ，Urogen Ⅲ）、糞卟啉原Ⅲ（coproporphyrinogenⅢ，Coprogen Ⅲ）、原卟啉原Ⅸ（protoporphyrinogen，Protogen Ⅸ）和原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，ProtoⅨ）[5]；鎂分支途徑中的中間產(chǎn)物包括：Mg-原卟啉Ⅸ（Mg-protoporphyrin Ⅸ，Mg-proto Ⅸ）、Mg-原卟啉甲酯（Mg-protoporphyrin methyl ester，Mpe）、Mg-原卟啉Ⅸ二酯（Mg-protoporphyrin Ⅸ dimethyl ester，Mpde）、原葉綠素酸酯 a（protochlorophyllide，Pchlide a）和葉綠素酸酯 a（chlorophyllide a，Chlide a）[5]；葉綠素循環(huán)主要包括Chl a 和Chl b[5]。Proto Ⅸ處還分出另一條合成亞鐵血紅素（heme）和光敏色素的途徑[6]。葉綠素生物合成過程易受外界環(huán)境影響，溫度就是重要影響因子之一，低溫可能導致合成過程中的某些關(guān)鍵酶活性降低甚至喪失，阻礙葉綠素合成和葉綠體發(fā)育，導致植物生長遲緩、發(fā)育不良甚至死亡[7]。

玉米[8]、黃瓜[9-10]、小麥[10]、青松[11]、水稻[12]等植物在去黃化過程中，鹽脅迫、水分脅迫、干旱脅迫、低溫或高溫脅迫均可下調(diào)葉綠素代謝相關(guān)基因的表達或影響一些酶的翻譯后修飾，導致葉綠素合成的相關(guān)酶活性均下降，影響葉綠素合成的前體物質(zhì)ALA、Mpe、Pchlide 含量，導致葉綠素含量降低，影響植物的代謝、生長、光合作用以及產(chǎn)量[12]。玉米（Zea mays L.）是喜溫的禾本科一年生C4 植物，是全世界種植面積最大的作物種類之一，是重要的糧食作物、飼用作物和工業(yè)原料作物，在我國農(nóng)業(yè)乃至國民經(jīng)濟中占有重要地位[13]。玉米最適生長溫度介于25 ℃到28 ℃之間，在早春播種的玉米經(jīng)常遭受春季低溫（10～18 ℃）脅迫，種子萌發(fā)和幼苗生長均受到影響，甚至造成大面積缺苗，最終顯著降低產(chǎn)量[13]。因此，研究低溫對玉米轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素合成的影響具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

本研究通過對14 ℃（取10～18 ℃中間值）低溫脅迫下玉米幼苗轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素合成中間產(chǎn)物的分析，探究轉(zhuǎn)綠過程中低溫影響葉綠素合成的具體步驟，為進一步探討低溫脅迫調(diào)控高等植物葉綠素合成的機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料及處理方法

玉米種子福玉一號購于種衍種業(yè)股份有限公司。挑選顆粒飽滿完整的玉米種子，用蒸餾水浸種8 h 后，于25 ℃黑暗下催芽48 h。將發(fā)芽的種子移栽至土壤（營養(yǎng)土∶黏土=1 ∶1）中在黑暗下培養(yǎng)6 d。將所有的植株隨機平均分為兩組，每組36 株。一組置于玉米最適生長溫度25 ℃，人工光照120 μmol/（m2·s）見光48 h；另一組置于低溫脅迫14 ℃，人工光照120 μmol/（m2·s）見光48 h。分別測定見光前、25 ℃見光48 h 和14 ℃見光48 h 植株的第二片葉葉綠素合成途徑11 項中間產(chǎn)物及血紅素共12 項指標。

1.2 研究指標與方法

1.2.1 葉綠素及血紅素含量測定

葉綠素含量測定參照Guo X.等[14]的方法，采用80%丙酮提取色素，并用紫外分光光度計測定葉綠素總量、葉綠素a、葉綠素b 及其比值。血紅素含量測定參照O.Czamacki[15]等的方法，采用丙酮-二甲亞砜-濃鹽酸，乙醚萃取，紫外分光光度計測定。

1.2.2 葉綠素前體物質(zhì)含量測定

δ-氨基乙酰丙酸含量測定參照楊清等[16]的方法，4%三氯乙酸提取，Ehrlich-Hg 試劑顯色，紫外分光光度計法測定。膽色素原含量測定參照陳凌艷等[17]的方法，采用Tris-EDTA 緩沖液提取，Ehrlich-Hg 試劑顯色，紫外分光光度計法測定。尿卟啉原Ⅲ和糞卟啉Ⅲ含量測定參照董立花等[18]的方法，尿卟啉原Ⅲ采用磷酸緩沖液（pH 6.8）提取，紫外分光光度計法測定；糞卟啉Ⅲ采用磷酸緩沖液（pH 6.8）提取，0.1 mol/L 的鹽酸萃取，紫外分光光度計法測定。原卟啉Ⅸ含量測定參照舒華等[19]的方法，采用丙酮-氨水混合液提取，正己烷萃取，熒光分光光度計法測定。

鎂原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ單甲酯和鎂原卟啉Ⅸ二酯含量測定參照舒華等[19]的方法，采用丙酮-氨水混合液提取，正己烷萃取，Mg-Proto Ⅸ和Mpe 存在于下相丙酮液中，熒光分光光度計法測定Mg-ProtoⅨ和Mpe 的共同熒光強度；采用丙酮-氨水混合液提取，正己烷、乙醚分別依次萃取，從而計算出Mpe的相對含量；Mpde 存在于上述步驟烷相中，將烷相在真空低溫干燥箱中干燥后溶于80%丙酮，熒光分光光度計法測定其相對含量。原葉綠素酸酯和葉綠素酸酯含量測定參照董立花等[18]的方法，熒光分光光度計測定相應(yīng)的熒光強度。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均重復3 次，試驗數(shù)據(jù)用Excel 2007 整理，用 SPSS 19.0 進行 LSD 顯著性差異分析（P＜0.05），用Origin Pro 9.0 進行數(shù)據(jù)繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對四吡咯代謝共同途徑的影響

與未見光相比，見光 48 h 后，25 ℃下 ALA 含量顯著下降，但是14 ℃低溫下ALA 含量卻略有上升（圖1），說明光照和溫度都是影響ALA 含量的重要因子。見光 48 h 后，PBG、Urogen Ⅲ和 CoprogeⅢ的積累量均升高；14 ℃低溫處理的幼苗的PBG、Urogen Ⅲ和Coproge Ⅲ含量均低于25 ℃處理組；說明低溫抑制見光幼苗的PBG、Urogen Ⅲ和CoprogeⅢ的積累。Proto Ⅸ是葉綠素和血紅素生物合成的最后一個共同中間產(chǎn)物，見光48 h 后，Proto Ⅸ含量均顯著下降，尤其是14 ℃低溫條件下。與常溫轉(zhuǎn)綠相比，低溫轉(zhuǎn)綠過程中ALA 積累較高，而PBG、UrogenⅢ、Coproge Ⅲ和Proto Ⅸ含量均低于常溫，說明ALA 向PBG 的轉(zhuǎn)化可能受到低溫抑制。

2.2 低溫脅迫對鎂分支途徑的影響

光照48 h 后，Mg-proto Ⅸ和Mpe 含量均上升，但是14 ℃低溫脅迫下Mg-proto Ⅸ積累量較25 ℃更高，而Mpe 含量較25 ℃低（圖2），說明低溫可能抑制Mg-proto Ⅸ向Mpe 進一步轉(zhuǎn)化。見光后Mpde 含量均顯著下降，且14 ℃和25 ℃處理組無顯著差異。Pchlide 和Chlide 見光后含量均顯著下降，在14 ℃低溫脅迫下更低。低溫脅迫可能抑制鎂分支途徑的Mg-proto Ⅸ向Mpe 的轉(zhuǎn)化，從而導致后續(xù)產(chǎn)物Pchlide 和 Chlide 含量較 25 ℃更低。

2.3 低溫脅迫對葉綠素合成的影響

25 ℃常溫見光后，總?cè)~綠素及葉綠素a、b 含量均急劇上升（圖3A）；但14 ℃低溫見光后，葉綠素含量與見光前相比變化不顯著，表明14 ℃低溫嚴重抑制葉綠素合成。25 ℃和14 ℃見光后的Chl a/Chl b 值分別為4.36 和1.99（圖3B），說明低溫可能對葉綠素a 向葉綠素b 的轉(zhuǎn)化也有抑制作用。

圖1 低溫脅迫對四吡咯代謝共同途徑中各個中間代謝物相對含量的影響Figure 1 Effect of low temperature on the relative contents of intermediate metabolites in the common pathway of tetrapyrrole metabolism

圖2 低溫脅迫對鎂分支途徑中各個中間代謝產(chǎn)物相對含量的影響Figure 2 Effect of low temperature on the relative content of intermediate metabolites in magnesium branching pathway

圖3 低溫脅迫對總?cè)~綠素和葉綠素a、b 的相對含量（A）以及葉綠素a 與葉綠素b 比值的影響（B）Figure 3 Effect of low temperature on the relative content of total chlorophyll，chlorophyll a，chlorophyll b （A） and the ratio of chlorophyll a to chlorophyll b （B）

2.4 低溫脅迫對血紅素合成的影響

血紅素與葉綠素合成有四吡咯代謝共同途徑，共用ALA 前體物質(zhì)，且血紅素對ALA 的合成有反饋抑制作用[6]。本研究表明血紅素作為鐵分支的第一個產(chǎn)物，見光后，其積累量顯著上升，說明光能促進血紅素的合成。14 ℃低溫下血紅素積累量明顯低于25 ℃常溫下的積累量，說明低溫會抑制血紅素積累（圖4）。

圖4 低溫脅迫對血紅素相對含量的影響Figure 4 The effects of low temperature on on the relative content of heme

3 討論與結(jié)論

目前研究均表明光和溫度是影響葉綠素合成的重要環(huán)境因素。喻敏等發(fā)現(xiàn)低溫抑制葉綠素合成，導致其含量顯著降低[20]；另外，賈學靜在紅花木的研究中，認為溫度升高可能是紅花 檵木紅葉轉(zhuǎn)綠的關(guān)鍵因素，再次說明溫度對色素合成的重要性[21]。舒華等通過降低光照強度，使茶樹新梢葉綠素含量顯著增加；同時葉綠素生物合成的前體ALA、PBG、Urogen Ⅲ等含量降低，而Proto Ⅸ、Mg-ProtoⅨ、Pchlide 含量升高，說明光照也是影響葉綠素及其前體物質(zhì)積累的重要因子之一[19]。董立花在寬葉吊蘭中發(fā)現(xiàn)，葉綠素生物合成受晝夜節(jié)律的調(diào)控[16]，推測可能是由于晝夜光照和溫度的差異導致；本研究的結(jié)果也表明光和溫度對葉綠素合成影響很大，且低溫顯著抑制葉綠素生物合成（圖3）。

初始前體物質(zhì)ALA 的合成和鎂離子的插入步驟是植物葉綠素合成兩個關(guān)鍵調(diào)控點[22]，但是不同的環(huán)境因素對葉綠素合成途徑的影響是具有差異的。近幾年來，不少學者對不同現(xiàn)象進行分析，探討是葉綠素合成途徑中哪一具體步驟起作用，對葉綠素合成方面的研究進行補充。董立花發(fā)現(xiàn)在金心吊蘭的金心部分，葉綠素代謝途徑中存在3 個受阻位點：ALA、Proto Ⅸ和Pchlide 的合成，由于金心吊蘭金心部分在合成開始時ALA 已受到抑制，推測ALA 合成受阻可能是其形成黃色葉條紋的主要原因[23]；楊清等通過葉面噴施胺鮮脂（DA-6）提高ALA向PBG 轉(zhuǎn)化的效率，從而使葉綠素積累量增加[24]；S.Cenkci 等發(fā)現(xiàn)鉛導致蘿卜（Brassica rapa L.）幼苗葉片ALA 積累，ALA 脫水酶活性降低，光合色素含量下降，且變化程度呈劑量依賴關(guān)系[25]；本研究也發(fā)現(xiàn)在玉米轉(zhuǎn)綠過程中，低溫也會抑制ALA 向PBG 轉(zhuǎn)化（圖1），說明ALA 向 PBG 的轉(zhuǎn)化易受外界環(huán)境影響。Wu Y.等發(fā)現(xiàn)NaCl 脅迫下，黃瓜幼苗鐵螯合酶（HEMH）基因表達下調(diào)，血紅素積累降低[26]；本研究發(fā)現(xiàn)低溫也會抑制玉米轉(zhuǎn)綠過程中血紅素的積累（圖4），推測可能就是低溫抑制鐵螯合酶基因表達或者該酶活性導致的。喻敏等發(fā)現(xiàn)低溫抑制冬小麥Chl a 向Chl b 的轉(zhuǎn)化，導致葉綠素合成受阻[20]；本研究發(fā)現(xiàn)低溫也抑制玉米轉(zhuǎn)綠過程中Chl a 向Chl b 的轉(zhuǎn)化（圖3）。綜上所述，不同的環(huán)境因子對植物葉綠素合成的調(diào)控位點可能不同。

低溫脅迫是早春作物幼苗階段經(jīng)常面臨的環(huán)境脅迫，常常導致作物減產(chǎn)，而植物的轉(zhuǎn)綠過程對環(huán)境變化尤為敏感。通過對玉米轉(zhuǎn)綠過程中葉綠素合成前體物質(zhì)的分析，本研究發(fā)現(xiàn)低溫通過影響ALA 向PBG 的轉(zhuǎn)化和Mg-Proto Ⅸ向Mpe 的轉(zhuǎn)化，降低 PBG、Urogen Ⅲ、Coprogen Ⅲ、Proto Ⅸ、Mpe、Pchlide、Childe 的積累量，進而降低Chl a 和Chl b產(chǎn)量；另外低溫還會抑制Chl a 向Chl b 的轉(zhuǎn)化，但更深入的調(diào)控機制還需進一步探究。