安俐瑤,姜英子*,徐雅娟,解生旭,劉悅

(1.延邊大學(xué)，吉林 延吉 133000；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，吉林省中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130021)

麻黃為麻黃科麻黃屬植物草麻黃(EphedrasinicaStapf)、中麻黃(EphedraintermediaSchrenk et C.A.Mey.)或木賊麻黃(EphedraequisetinaBge.)的干燥草質(zhì)莖[1]。麻黃辛溫，味微苦，入肺、膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫之功效[2]。關(guān)于麻黃的修治，最早見于張機(jī)的《金匱玉函經(jīng)》：“麻黃，折去節(jié)，令通理，寸剉之，寸剉不如碎剉，如豆大為佳[3]。北京西鶴年堂將麻黃炮制成“魚子樣”以分類“去節(jié)麻黃”與“麻黃節(jié)”[4]。雷公云：凡使，去(根)節(jié)并沫，若不盡，服之令人(心)悶[5]?！豆鹆止疟緜s病論》中共載方劑四百余，用麻黃的方劑共29首，其中備注“去節(jié)”的方劑共14首[6]?？梢姟奥辄S去節(jié)”在古代是必不可少的炮制工序。

以《傷寒論》中的“麻黃湯”與“射干麻黃湯”為例，分析麻黃去節(jié)與否的作用。麻黃湯記載“麻黃(去節(jié))”，主治太陽病，頭痛發(fā)熱，身疼腰痛，骨節(jié)疼痛，惡風(fēng)，無汗而喘[7]。麻桂并用，增強(qiáng)麻黃的發(fā)汗作用，此中重用麻黃發(fā)汗解表之功，以治表為主；射干麻黃湯未做“去節(jié)”標(biāo)注，則按照不去節(jié)入藥。其具有化痰利咽，清肺降氣之功，此中重用麻黃宣肺平喘之功，以治里為主[8]。故可大概推測，古人用麻黃，發(fā)汗解表多去節(jié)，宣肺平喘不去節(jié)。

有學(xué)者用氣相色譜法對麻黃全草、節(jié)、去節(jié)各部位的主成分進(jìn)行含量測定，結(jié)果表明，總麻黃堿的含量為，去節(jié)>全草>節(jié)[9]。近年來也有學(xué)者使用UPLC-Q TOF MSET探究麻黃蜜炙、酒制、醋制和炒炭的化學(xué)成分變化[10]。還有學(xué)者用指紋圖譜及PCA和CA法分析不同地區(qū)及正品、偽品麻黃藥材的質(zhì)量差異，但是尚未系統(tǒng)研究麻黃去節(jié)與否的區(qū)別[11-12]。筆者建立15批去節(jié)麻黃和麻黃節(jié)的高效液相色譜(HPLC)特征圖譜，并采用聚類分析法(CA)和主成分分析法(PCA)對兩種炮制品進(jìn)行分析。在特征圖譜的結(jié)果中去節(jié)麻黃被標(biāo)記出6個(gè)共有峰，麻黃節(jié)樣品被標(biāo)記出10個(gè)共有峰。CA結(jié)果中將兩種炮制品分為2類，PCA結(jié)果顯示，去節(jié)麻黃篩選出累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到85.634%的3個(gè)因子，麻黃節(jié)篩選出累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到83.976%的4個(gè)主成分。這說明了“去節(jié)麻黃”與“麻黃節(jié)”之間的差異，證明麻黃“去節(jié)”有炮制的必要，為后續(xù)開發(fā)復(fù)方中帶有“去節(jié)麻黃”的傳統(tǒng)制劑提供參考。

1 材料

Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)；水為娃哈哈純凈水；乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。鹽酸麻黃堿對照品(批號：171241-201007，中國食品藥品檢定研究院)；鹽酸偽麻黃堿對照品(批號：171237-201208，中國食品藥品檢定研究院)。

麻黃藥材共收集15批樣品，根據(jù)《中國藥典》2015年版(一部)麻黃的含量測定方法，測定藥材中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿(以下簡稱總堿量)的含量，結(jié)果顯示：15批麻黃藥材總堿量均大于0.8%，全部符合藥典標(biāo)準(zhǔn)；所有去節(jié)麻黃的總堿量均大于麻黃節(jié)的總堿量。其中12批“去節(jié)麻黃”的總堿量接近“麻黃節(jié)”的總堿量的2倍，結(jié)果見表1。

表1 麻黃兩種供試品的總堿量

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 藥材的前處理 將麻黃藥材的節(jié)和節(jié)間分開，節(jié)的前后可留一小部分，所留部分應(yīng)盡量小。兩種炮制品粉碎后過5號藥典篩。

2.1.2 指紋圖譜供試品溶液的制備 取“2.1.1”項(xiàng)下所得的樣品約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入1.44%磷酸溶液50 mL，稱定重量，超聲處理(功率600 W，頻率50 Hz)20 min，放冷，再稱定重量，用1.44%磷酸溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 對照品溶液的制備 精密稱定鹽酸麻黃堿對照品4.9 mg，鹽酸偽麻黃堿對照品4.4 mg以甲醇溶解，混合定容于100 mL容量瓶中。

2.3 HPLC指紋圖譜測定及共有峰鑒定

2.3.1 HPLC指紋圖譜色譜條件 Shimadzu LC-20AT高效液相色譜儀，Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)色譜柱；柱溫30 ℃；流速1 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL；流動相A：0.05%磷酸—0.05%三乙胺溶液，B：乙腈；梯度洗脫(0～4 min，2%→2% B；4～12 min，2%→4%B；12～28 min，4%→6%B；28～45 min，6%→9%B；45～60 min，9%→12%B；60～85 min，12%→18%B；85～87 min，18%→2%B)；波長210 nm。

2.3.2 HPLC指紋圖譜采集與分析 分別按照“2.3.1”項(xiàng)下條件分析混合對照品溶液和15批“麻黃節(jié)”供試品與“去節(jié)麻黃”供試品溶液，記錄87 min圖譜，混合對照品溶液HPLC色譜圖見圖1,15批去節(jié)麻黃HPLC色譜圖見圖2，15批麻黃節(jié)HPLC色譜圖見圖4。

15批麻黃節(jié)和去節(jié)麻黃的特征圖譜顯示，由對照品指認(rèn)的鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的特征峰均比較穩(wěn)定，其中鹽酸偽麻黃堿峰面積適中，分離度較好，因而被選為參照峰(S)。將二者的特征圖譜分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2012.130723版本)”軟件，以S1為參照圖譜，時(shí)間窗寬度設(shè)置為0.5 s，進(jìn)行多點(diǎn)校正，全譜峰匹配后以中位數(shù)法生成2個(gè)共有模式圖譜，其中15批去節(jié)麻黃的共有模式圖譜見圖3，共6個(gè)共有峰；15批麻黃節(jié)的共有模式圖譜見圖5，共10個(gè)共有峰。計(jì)算各共有峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積，結(jié)果見表2。

1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿

1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿

3.鹽酸麻黃堿；4.鹽酸偽麻黃堿

1.鹽酸麻黃堿；2.鹽酸偽麻黃堿

4.鹽酸麻黃堿；5.鹽酸偽麻黃堿

2.3.3 指紋圖譜的方法學(xué)考察

2.3.3.1 精密度試驗(yàn) 精密稱取編號6的去節(jié)麻黃樣品和麻黃節(jié)樣品0.5 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC分析，連續(xù)測定6次，測定記錄色譜圖，以參照峰的保留時(shí)間和峰面積為參比，結(jié)果見表3，可知該方法精密度好。

表2 15批去節(jié)麻黃與麻黃節(jié)指紋圖譜共有峰的相對峰面積與相對保留時(shí)間RSD值

2.3.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取編號6的去節(jié)麻黃和麻黃節(jié)樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果見表3，由表可知該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備麻黃節(jié)和去節(jié)麻黃供試品溶液，室溫放置，分別在0、2、4、8、12、24 h按“2.3.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行HPLC分析，24 h內(nèi)結(jié)果見表3，由表可知該方法制備的供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表3 方法學(xué)的RSD值

2.3.4 15批麻黃藥材相似度評價(jià) 以15批麻黃節(jié)和去節(jié)麻黃藥材共有模式圖譜為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行整體相似度評價(jià)，15批去節(jié)麻黃藥材的相似度為0.879～0.994，15批麻黃節(jié)藥材的相似度在0.895～0.996，結(jié)果見表4。

2.3.5 聚類分析 使用SPSS 22.0軟件對30批樣品(其中1～15號為去節(jié)麻黃樣品，16～30號麻黃節(jié))進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，采用組間連接法，得到聚類樹狀圖，見圖6。

圖6顯示當(dāng)類間距離介于15～20時(shí)，去節(jié)麻黃和麻黃節(jié)可以被明顯地聚為2類。

2.3.6 主成分分析 采用SPSS 22.0軟件，以絕對共有峰面積為變量，分別計(jì)算主成分特征值、貢獻(xiàn)率及累積貢獻(xiàn)率。選取特征值>1,主成分累計(jì)貢獻(xiàn)率>70%以上者，由表5～6、圖7～8可看出，去節(jié)麻黃中前3個(gè)主成分能代表去節(jié)麻黃特征圖譜，而麻黃節(jié)中前4個(gè)主成分能代表麻黃節(jié)特征圖譜。

表4 15批去節(jié)麻黃與15批麻黃節(jié)的指紋圖譜相似度

圖6 15批去節(jié)麻黃和15批麻黃節(jié)的聚類樹狀圖

表5 去節(jié)麻黃特征值表

表6 麻黃節(jié)特征值表

圖7 去節(jié)麻黃特征值散點(diǎn)圖

圖8 麻黃節(jié)特征值散點(diǎn)圖

豎讀表7和表8發(fā)現(xiàn)去節(jié)麻黃和麻黃節(jié)因子載荷矩陣中因子1在多數(shù)共有峰的上有較大的載荷。因此，兩種炮制品中的因子1可初步確定為綜合因子，即認(rèn)為主成分1可以反映兩種炮制品特征圖譜較全面的信息。由表9可知因子1中3號共有峰得分系數(shù)的絕對值最高，因此，去節(jié)麻黃的主成分分析中，與因子1最密切的共有峰為3號共有峰。由表10可以知主成分1中2號共有峰得分系數(shù)的絕對值最高，與之相近的是9號共有峰。因此，與主成分1最密切的共有峰為2號共有峰，9號共有峰也值得關(guān)注。

表7 去節(jié)麻黃主成分因子載荷矩陣

表9 去節(jié)麻黃主成分得分系數(shù)矩陣及保留時(shí)間

表10 麻黃節(jié)主成分得分系數(shù)矩陣及保留時(shí)間

3 討論

3.1 色譜柱考察 考察了Agilent Zorbax SB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)和 Phenomenex Polar-RP 80A(4.6 mm×250 mm,4 μm)色譜柱。結(jié)果顯示，使用Phenomenex Polar-RP 80A色譜柱時(shí)麻黃堿和偽麻黃堿2個(gè)對照峰分離效果優(yōu)于Agilent Zorbax SB-C18色譜柱，但是其余成分分離效果不好，無法體現(xiàn)指紋圖譜的特征性，因此采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱。

3.2 流動相和檢測波長的考察 分別考察了210 nm下使用磷酸和甲酸、260 nm下使用磷酸和甲酸的條件。發(fā)現(xiàn)使用甲酸時(shí)檢測波長在210 nm時(shí)紫外吸收較大，基線不平穩(wěn)，干擾特征圖譜生成，但波長在260 nm時(shí)無論使用甲酸或者磷酸麻黃堿和偽麻黃堿兩個(gè)對照峰不明顯，因此最終使用磷酸-210 nm作為流動相。后續(xù)考察了磷酸濃度為0.05%和0.1%時(shí)的峰譜，當(dāng)酸水濃度從0.1%濃度的磷酸溶液降到0.05%時(shí)，36 min處原本上浮的基線下降，這使得峰面積更加準(zhǔn)確，成分分離效果更好。

3.3 供試品提取方法考察 考察了磷酸超聲提取和水煎煮提取，結(jié)果顯示，二者所能提取的主要物質(zhì)基本相同，但是磷酸超聲能提取出較多的生物堿類成分，在水煎液的指紋圖譜中雜質(zhì)較多，影響主成分的有效分離。因此最終選擇磷酸超聲提取。

3.4 相似度分析 依據(jù)本研究的測定方法，15批麻黃藥材的特征圖譜基本吻合，其中14批藥材的相似度大于0.9，僅有1批來自吉林瞻榆朝陽村的藥材無論是節(jié)與去節(jié)的供試品相似度均小于0.9，表明該地區(qū)藥材質(zhì)量可能存在質(zhì)量不穩(wěn)定情況。

3.5 聚類分析和主成分分析 PCA過程會自動生成各因子的權(quán)重，可較大程度上抵制人為評價(jià)的干擾；CA能夠找到隱藏在眾多共性下的差異，兩者結(jié)合分析使分析的結(jié)果更加客觀。CA結(jié)果顯示，15批麻黃樣品并未完全按照產(chǎn)地分別聚類，不同產(chǎn)地的藥材仍有共性，這說明麻黃藥材并未因地域分布而存在較大差異，這可以保證大生產(chǎn)時(shí)投料的穩(wěn)定性。PCA結(jié)果顯示，去節(jié)麻黃中前3個(gè)主成分能代表去節(jié)麻黃特征圖譜，而麻黃節(jié)中前4個(gè)主成分能代表麻黃節(jié)特征圖譜，這說明麻黃節(jié)中所含物質(zhì)較去節(jié)麻黃多。在去節(jié)麻黃中與主成分1最密切的共有峰是3號峰即鹽酸麻黃堿峰，而麻黃節(jié)中顯示與主成分1有密切關(guān)系的峰為2號峰和9號峰，并非由對照品指認(rèn)的峰。由此可推斷，去節(jié)麻黃樣品主要發(fā)揮作用的化學(xué)成分應(yīng)為麻黃堿類物質(zhì)，麻黃堿類物質(zhì)可以興奮β受體引起發(fā)汗，這與前述的功效推斷相吻合[13-14]。

4 小結(jié)

本文首次建立特征圖譜并采用聚類分析與主成分分析法對去節(jié)麻黃與麻黃節(jié)做了系統(tǒng)對比，特征圖譜按照“節(jié)與去節(jié)”將兩種炮制品聚成兩個(gè)亞類，這說明二者在成分上有明顯差別，同時(shí)也說明麻黃在使用時(shí)需做去節(jié)炮制的必要性。聚類分析時(shí)關(guān)于藥材產(chǎn)地的聚類不明顯，由此推測是每個(gè)產(chǎn)地的藥材批次數(shù)量不足的緣故。建議以后的學(xué)者可使用更多批次的藥材進(jìn)行特征圖譜的考察，并建立更便捷高效的方法。主成分分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)在去節(jié)麻黃樣品中3號共有峰(鹽酸麻黃堿峰)是影響其特征圖譜的主要色譜峰，而麻黃節(jié)樣品中影響其特征圖譜的主要色譜峰是2號共有峰和9號共有峰，因此證明了以鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量作為評價(jià)麻黃質(zhì)量的指標(biāo)是片面的。