李漫 魏好程 何傳波 馬英 熊何健

摘要[目的]采用響應(yīng)面法優(yōu)化西蘭花莖葉蛋白酶解工藝條件。[方法]以西蘭花莖葉蛋白為原料，選取pH、溫度、加酶量和底物濃度為自變量，水解度為響應(yīng)值，在單因素試驗基礎(chǔ)上，運用 Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計和響應(yīng)面（RSM），確定最佳酶解工藝參數(shù)。[結(jié)果]堿性蛋白酶水解西蘭花莖葉蛋白最佳的酶解條件是pH10、溫度55 ℃、加酶量2 800 U/g、底物濃度4%。[結(jié)論]堿性蛋白酶對西蘭花莖葉蛋白酶解工藝優(yōu)化合理、可行，該研究為西蘭花莖葉蛋白的綜合利用提供了參考。

關(guān)鍵詞西蘭花;莖葉蛋白;酶解;響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號TS?225.1文獻標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0174-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.047

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Optimization of Proteolysis Technology of Broccoli Stem and Leaf

LI Man，WEI Hao-cheng，HE Chuan-bo et al（School of Food and Bioengineering，Jimei University，Xiamen，F(xiàn)ujian 361021）

Abstract[Objective]The response surface methodology was used to optimize the proteolytic conditions of broccoli stems and leaves.[Method]With broccoli stem and leaf protein as raw material，pH，temperature，enzyme amount and substrate concentration were selected as independent variables，and hydrolysis degree was used as response value.Based on single factor experiment，Box-Behnken center combined test design and response were used to determine the optimal enzymatic process parameters.[Result]Alkaline protease hydrolysis of broccoli stem and leaf protein optimal enzymatic conditions were pH10，temperature 55 ℃，enzyme amount 2 800 U/g，the concentration of substrate 4%.[Conclusion]Alkaline protease is reasonable and feasible for the proteolysis process of broccoli stem and leaf.The study provides a reference for the comprehensive utilization of broccoli stem and leaf?protein.

Key wordsBroccoli;Stem and leaf protein;Enzymatic hydrolysis;Response surface optimization

西蘭花（Brassica oleracea）俗稱綠菜花，為十字花科蕓薹屬二年生植物[1]。西蘭花營養(yǎng)成分豐富，被稱為“蔬菜王冠”，具有非常高的食用和藥用保健價值[2]。我國是西蘭花種植大國，2014年我國西蘭花產(chǎn)量約占全球總量的38%[3]。西蘭花種植、加工過程中，會產(chǎn)生大量的莖、葉副產(chǎn)物，除少量作為飼料利用外，大部分被廢棄，既導(dǎo)致資源浪費，又產(chǎn)生環(huán)境污染，對西蘭花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展產(chǎn)生不良影響，西蘭花殘次果和莖葉副產(chǎn)物的資源利用問題亟待解決。

西蘭花莖葉中含有膳食纖維、蛋白質(zhì)、類黃酮和蘿卜硫素等多種營養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)，是一種非常有價值的副產(chǎn)物資源。Campas-Baypoli等[4]研究表明，西蘭花莖干粉中蛋白質(zhì)含量高達22.41%。Xu等[5]利用西蘭花莖葉蛋白，酶解獲得了具有強ACE抑制活性的二肽Val-Trp，IC?50值為?31.30 μmol/L。黨亞麗等[6]通過酶解西蘭花莖葉蛋白，獲得分子量為310～2 600 Da的西蘭花蛋白肽，該肽組分能顯著提高小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力（P<0.05） 和小鼠碳粒廓清功能（P<0.05），具有增強免疫活性。筆者以西蘭花莖葉蛋白為原料，以水解度為指標(biāo)，研究了堿性蛋白酶對西蘭花莖葉蛋白的水解效果，通過單因素試驗和響應(yīng)面分析優(yōu)化酶解條件，旨在為酶技術(shù)應(yīng)用于西蘭花莖葉蛋白酶解生物活性肽的功能性研究提供理論參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

西蘭花莖葉蛋白漿（蛋白質(zhì)占干物質(zhì)含量46.34%）來自臺州市天萊生物科技有限公司，經(jīng)凍干后?-20 ℃保存?zhèn)溆?堿性蛋白酶（酶活力1.01×105 U/g）?購自諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司;三氟乙酸購自Sigma公司;甲醛 AR等其余試劑為國藥分析純。

1.2儀器與設(shè)備

FA1004 型電子天平（上海精科天平）;UV8000A型紫外可見分光光度計（尤尼柯儀器公司）;?LEAD-2 pH 計（上海奧豪斯儀器有限公司）;JDC-0.2真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）;電熱式恒溫水浴鍋（天津歐諾儀器儀表有限公司）;ULTMATE3000高效液相色譜儀（美國賽默飛公司）。

1.3方法

1.3.1西蘭花莖葉蛋白酶解流程。

西蘭花莖葉蛋白漿→冷凍干燥→配制西蘭花莖葉蛋白懸浮液→85 ℃滅菌20 min→調(diào)pH、加酶→恒溫水浴鍋酶解→100 ℃滅酶15 min→200 nm孔徑陶瓷濾膜，取透過液→200 Da孔徑卷式膜，取截留液→西蘭花莖葉蛋白酶解液。

1.3.2分析測定方法。蛋白含量采用微量凱氏定氮法測定;水解度采用甲醛電位滴定法測定[7]，通過式（1）計算水解度。

水解度=C×（V1-V0）×0.014×m/（5×M）×100%??（1）

式中，C為NaOH濃度（mol/L）;V1為樣品在加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）;V0為空白在加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積（mL）;m為酶解液氨基氮質(zhì)量（mg）;M為樣品總氮質(zhì)量（mg）。

1.3.3單因素試驗。

以水解度為指標(biāo)，固定酶解時間為3 h，選擇底物濃度和加酶量進行單因素試驗。其他基礎(chǔ)條件參照酶的說明書和向廠家詢問的最適條件。各個因素變化梯度分別為底物濃度（2%、3%、4%、5%、6%）、加酶量（1 000、?2 000、3 000、4 000和5 000 U/g）。

1.3.4西蘭花莖葉蛋白酶解條件優(yōu)化。

選取pH、酶解溫度、底物濃度和加酶量4個因素，以水解度為響應(yīng)值，運用4因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗，優(yōu)化堿性蛋白酶酶解參數(shù)，其響應(yīng)面因素及水平如表1所示。

1.3.5西蘭花莖葉蛋白酶解物中蛋白肽的分子量分布。色譜條件：凝膠柱TSKgel G2000SWXL（7.8 mm×300 mm）;流動相為乙腈/超純水/TFA=45/55/0.1（V/V），流速為?0.5 mL/min;檢測波長為220 nm;柱溫30 ℃。選用GSH（還原型谷胱甘肽，MW 307.00 Da）、GSSG（氧化型谷胱甘肽，MW 613.00 Da）、桿菌肽（MW 1 422.69 Da）、胰島素（MW ?5 777.54 Da）和細胞色素C（MW 12 384.00 Da）為標(biāo)準(zhǔn)品，通過凝膠色譜測定酶解產(chǎn)物蛋白肽分子量分布。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗結(jié)果由Microsoft Excel 2007進行處理，采用SPSS 19.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，Duncans法進行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1西蘭花莖葉蛋白酶解單因素試驗結(jié)果

2.1.1加酶量。由圖1可知，隨著酶添加量的增大，水解度呈上升趨勢，但過了2 000 U/g曲線斜率變小，這是由于在酶解反應(yīng)初期，加酶量的增大可以使更多的底物被作用，從而提高水解速度;當(dāng)加酶量達到一定程度時，酶量的增加反而會抑制酶解速度[8]。周雪松[9]的研究表明，當(dāng)酶用量大于最適濃度時，過量的酶很難與底物接觸，其對底物蛋白的水解能力不會明顯提高，如果酶量過大甚至?xí)鹈傅淖匀茉鰪姟？紤]到試驗成本和試劑最大利用率，加酶量選?2 000 U/g左右較合適。

2.1.2底物濃度。由圖2可知，在酶解過程中，底物濃度為2%～4%時，隨著底物濃度的增加，水解度有明顯的提升，但是當(dāng)?shù)孜餄舛冗M一步增大時，水解度雖然也增大，但是提升的趨勢平緩。這是因為底物濃度的增大，降低了體系中的酶濃度，使得酶促反應(yīng)速度下降，水解度降低[10-11]，故選擇底物濃度3%左右較為合適。

2.2西蘭花莖葉蛋白堿性蛋白酶水解條件優(yōu)化

在單因素試驗基礎(chǔ)上，固定堿性蛋白酶酶解時間為3 h，選取pH、酶解溫度、底物濃度和加酶量4個因素，以水解度為響應(yīng)值，運用響應(yīng)面試驗設(shè)計，優(yōu)化堿性蛋白酶酶解參數(shù)，試驗結(jié)果見表2。

對表2結(jié)果進行多元擬合分析，得到堿性蛋白酶水解度對pH、溫度、加酶量和底物濃度的二次多項回歸方程Y=?19.47+2.38A+1.02B+4.44C+2.62D+2.74AB+0.75AC-?0.060AD+1.35BC+0.34BD+1.70CD-1.10A2-1.71B2-0.85C2-?2.92D2，R2=0.990 2。由回歸模型方差分析可知，二次多項回歸方程P<0.000 1，表明該二次多項回歸模型高度顯著，且失擬值為0.534 3>0.05，不顯著，表明模型與實際情況擬合得很好，預(yù)測值與實際測量值之間具有高度的相關(guān)性，可以應(yīng)用到理論的預(yù)測[12]。由F值可以看出，影響堿性蛋白酶酶解效果的各因素主次關(guān)系為底物濃度（C）>加酶量（D）>pH（A）>溫度（B）。通過數(shù)據(jù)分析，確定堿性蛋白酶最優(yōu)酶解條件為pH10、酶解溫度55 ℃、加酶量2 800 U/g、底物濃度4%，此條件下堿性蛋白酶實際水解度為31.13%，與理論水解度?30.29%基本一致。

2.3西蘭花莖葉蛋白酶解影響因素交互作用分析

對兩因素間交互作用的交互分析采用降維分析法。觀察響應(yīng)面的陡峭程度可看出因素變化對響應(yīng)值的影響效果，響應(yīng)面越平緩，說明響應(yīng)值對因素變化不敏感，反之，則表示響應(yīng)值對因素變化比較敏感，簡而言之，隨著因素的變化響應(yīng)值會做出相應(yīng)的敏感反應(yīng)[13]。該研究根據(jù)回歸方程建立響應(yīng)面圖（圖3）。觀察圖3中各個響應(yīng)面可知， AB、BC、CD存在極顯著的交互作用（P<0.01）;AC之間的交互作用顯著（ 0.010.05）。

2.4西蘭花莖葉蛋白酶解物中蛋白肽分子量分布

西蘭花莖葉蛋白酶解物中主要成分為小分子蛋白肽。標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的洗脫時間分別為細胞色素C為11.90 min，胰島素為?14.13 min，桿菌肽為15.86 min，GSSG為19.01?min，GSH為19.85 min。相同條件下測定西蘭花莖葉蛋白肽的分子質(zhì)量，其分子質(zhì)量的分布如圖4所示，西蘭花莖葉蛋白主要水解為相對分子量3 000 Da以下的小分子肽，其中分子量1 000 Da以下組分占65.63%。

3結(jié)論

該研究以西蘭花莖葉蛋白為原料，水解度為響應(yīng)值，通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計分析優(yōu)化堿性蛋白酶酶解西蘭花莖葉蛋白的工藝條件。最終確定堿性蛋白酶酶解西蘭花莖葉蛋白的最佳酶解條件為pH 10、溫度55 ℃、加酶量?2 800 U/g、底物濃度4%，此條件下堿性蛋白酶實際水解度為31.13%，與理論水解度30.29%基本一致。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，活性肽所具有的抗氧化以及抗菌等活性跟其分子量大小有著密切關(guān)聯(lián)，一般情況下，活性肽分子量越小，其生物活性則越強[14]。蛋白肽作為蛋白質(zhì)降解的中間產(chǎn)物，它的作用體現(xiàn)在以下2個方面：一方面它可以繼續(xù)降解成氨基酸被腸道吸收利用以合成機體蛋白;另一方面它可以直接以小肽的形式被機體吸收利用，從而發(fā)揮更重要的生理功能。蛋白質(zhì)在酶解時所用到的蛋白酶在水解過程中同樣會產(chǎn)生許多小分子量的活性成分，這些小片段肽可能在機體內(nèi)會具有特殊生理調(diào)節(jié)功能[15]。該研究通過分析西蘭花莖葉蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布，發(fā)現(xiàn)西蘭花莖葉蛋白經(jīng)堿酶酶解后，其主要成分為相對分子量3 000 Da以下的小分子肽，其中分子量1 000 Da以下組分占65.63%。已有研究表明，米糠蛋白[16]、羽扇豆蛋白[17]、大豆蛋白水解物[18]等植物蛋白源類物質(zhì)有良好的降血脂活性。該試驗為西蘭花莖葉蛋白酶解物生理活性的研究奠定了基礎(chǔ)，也為西蘭花莖葉蛋白的高值化開發(fā)提供了參考。

參考文獻

[1]ARES A M，NOZAL M J，BERNAL J.Extraction chemical characterization and biological activity deter mination of broccoli health promoting compounds[J].Journal of chromatography A，2013，1313（20）：78-95.

[2]LATT-?K P，APPEL K E，LAMPEN A.Health benefits and possible risks of broccoli-An overview[J].Food and chemical toxicology，2011，49（12）：3287-3309.

[3]劉海萍.西蘭花莖葉粉營養(yǎng)價值評定及其在綠牧草雞日糧中的應(yīng)用研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2009：1-49.

[4]CAMPAS-BAYPOLI O N，SNCHEZ-MACHADO D I，BUEMO-SOLANO C，et al.Biochemical composition and physicochemical properties of broccoli flours[J].International journal of food sciences and nutrition，2009，60（4）：163-173.

[5]XU Y，BAO T，HAN W，et al.Purification and identification of an angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptide from cauliflower by-products protein hydrolysate[J].Process biochemistry，2016，51（9）：1299-1305.

[6]黨亞麗，么春艷，周亭屹，等.西蘭花莖葉多肽的酶法提取及其增強免疫力功能研究[J].食品工業(yè)科技，2017，38（11）：352-355.

[7]RUTHERFURD S M.Methodology for deter mining degree of hydrolysis of proteins in hydrolysates：A review[J].J AOAC Int，2010，93（5）：1515-1522.

[8]宋茹，馮婷立，謝超.海產(chǎn)小雜魚抗氧化肽制備工藝[J].食品科學(xué)，2011，32（12）：29-33.

[9]周雪松.雞肉蛋白酶解及其產(chǎn)物抗氧化活性研究[D].廣州：華南理工大學(xué)，2016.

[10]KONG X Z，ZHOU H M，QIAN H F.Enzymatic hydrolysis of wheat gluten by proteases and properties of the resulting hydrolysate [J].Food chemistry，2007，102：759-763.

[11]張一帆，張?zhí)苽ィ胝?響應(yīng)面法優(yōu)化西藏核桃蛋白酯解工藝[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2017，8（12）：4747-4754.

[12]ABDEL-FATTAH Y R，SAEED H M，GOHAR M，et al.Improved production of Pseudomonas aeruginosa uricase by optimization of process paremeters through statistical experimental designs[J].Process biochemistry，2005，40（5）：1707-1714.

[13]朱玉英，王存芳，王建民.粗糧型羊乳奶泡加工工藝的響應(yīng)面優(yōu)化[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)， 2016，39（3）：18-24.

[14]KATO M，NAKANISHI T，TANI T，et al.Low-molecular fraction of wheat protein hydrolysate stimulates glucagon-like peptide-1 secretion in an enteroendocrine L cell line and improves glucose tolerance in rats[J].Nutrition research，2017，37：37-45.

[15]殷雪婷.生物活性肽的制備方法及其功能[J].河南科技，2011（4）：57.

[16]居錫萍.血脂異常的藥物治療[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10（34）：95-99.

[17]WANG J，SHIMADA M，NAGAOKA S.Identification of the active protein in rice bran protein having an inhibitory activity of cholesterol micellar solubility[J].Bioscience，biotechnology，and biochemistry，2017，81（6）：1216-1219.

[18]LAMMI C，ZANONI C，CALABRESI L，et al.Lupin protein exerts cholesterol-lowering effects targeting PCSK9：From clinical evidences to elucidation of the in vitro molecular mechanism using HepG2 cells[J].Journal of functional foods，2016，23：230-240.