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        西蘭花莖葉蛋白酶解工藝優(yōu)化

        2019-11-01 01:21:48李漫魏好程何傳波馬英熊何健
        安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年18期

        李漫 魏好程 何傳波 馬英 熊何健

        摘要[目的]采用響應(yīng)面法優(yōu)化西蘭花莖葉蛋白酶解工藝條件。[方法]以西蘭花莖葉蛋白為原料,選取pH、溫度、加酶量和底物濃度為自變量,水解度為響應(yīng)值,在單因素試驗基礎(chǔ)上,運用 Box-Behnken 中心組合試驗設(shè)計和響應(yīng)面(RSM),確定最佳酶解工藝參數(shù)。[結(jié)果]堿性蛋白酶水解西蘭花莖葉蛋白最佳的酶解條件是pH10、溫度55 ℃、加酶量2 800 U/g、底物濃度4%。[結(jié)論]堿性蛋白酶對西蘭花莖葉蛋白酶解工藝優(yōu)化合理、可行,該研究為西蘭花莖葉蛋白的綜合利用提供了參考。

        關(guān)鍵詞西蘭花;莖葉蛋白;酶解;響應(yīng)面優(yōu)化

        中圖分類號TS?225.1文獻標(biāo)識碼A

        文章編號0517-6611(2019)18-0174-04

        doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.047

        開放科學(xué)(資源服務(wù))標(biāo)識碼(OSID):

        Optimization of Proteolysis Technology of Broccoli Stem and Leaf

        LI Man,WEI Hao-cheng,HE Chuan-bo et al(School of Food and Bioengineering,Jimei University,Xiamen,F(xiàn)ujian 361021)

        Abstract[Objective]The response surface methodology was used to optimize the proteolytic conditions of broccoli stems and leaves.[Method]With broccoli stem and leaf protein as raw material,pH,temperature,enzyme amount and substrate concentration were selected as independent variables,and hydrolysis degree was used as response value.Based on single factor experiment,Box-Behnken center combined test design and response were used to determine the optimal enzymatic process parameters.[Result]Alkaline protease hydrolysis of broccoli stem and leaf protein optimal enzymatic conditions were pH10,temperature 55 ℃,enzyme amount 2 800 U/g,the concentration of substrate 4%.[Conclusion]Alkaline protease is reasonable and feasible for the proteolysis process of broccoli stem and leaf.The study provides a reference for the comprehensive utilization of broccoli stem and leaf?protein.

        Key wordsBroccoli;Stem and leaf protein;Enzymatic hydrolysis;Response surface optimization

        西蘭花(Brassica oleracea)俗稱綠菜花,為十字花科蕓薹屬二年生植物[1]。西蘭花營養(yǎng)成分豐富,被稱為“蔬菜王冠”,具有非常高的食用和藥用保健價值[2]。我國是西蘭花種植大國,2014年我國西蘭花產(chǎn)量約占全球總量的38%[3]。西蘭花種植、加工過程中,會產(chǎn)生大量的莖、葉副產(chǎn)物,除少量作為飼料利用外,大部分被廢棄,既導(dǎo)致資源浪費,又產(chǎn)生環(huán)境污染,對西蘭花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展產(chǎn)生不良影響,西蘭花殘次果和莖葉副產(chǎn)物的資源利用問題亟待解決。

        西蘭花莖葉中含有膳食纖維、蛋白質(zhì)、類黃酮和蘿卜硫素等多種營養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì),是一種非常有價值的副產(chǎn)物資源。Campas-Baypoli等[4]研究表明,西蘭花莖干粉中蛋白質(zhì)含量高達22.41%。Xu等[5]利用西蘭花莖葉蛋白,酶解獲得了具有強ACE抑制活性的二肽Val-Trp,IC?50值為?31.30 μmol/L。黨亞麗等[6]通過酶解西蘭花莖葉蛋白,獲得分子量為310~2 600 Da的西蘭花蛋白肽,該肽組分能顯著提高小鼠淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力(P<0.05) 和小鼠碳粒廓清功能(P<0.05),具有增強免疫活性。筆者以西蘭花莖葉蛋白為原料,以水解度為指標(biāo),研究了堿性蛋白酶對西蘭花莖葉蛋白的水解效果,通過單因素試驗和響應(yīng)面分析優(yōu)化酶解條件,旨在為酶技術(shù)應(yīng)用于西蘭花莖葉蛋白酶解生物活性肽的功能性研究提供理論參考。

        1材料與方法

        1.1材料與試劑

        西蘭花莖葉蛋白漿(蛋白質(zhì)占干物質(zhì)含量46.34%)來自臺州市天萊生物科技有限公司,經(jīng)凍干后?-20 ℃保存?zhèn)溆?堿性蛋白酶(酶活力1.01×105 U/g)?購自諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司;三氟乙酸購自Sigma公司;甲醛 AR等其余試劑為國藥分析純。

        1.2儀器與設(shè)備

        FA1004 型電子天平(上海精科天平);UV8000A型紫外可見分光光度計(尤尼柯儀器公司);?LEAD-2 pH 計(上海奧豪斯儀器有限公司);JDC-0.2真空冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司);電熱式恒溫水浴鍋(天津歐諾儀器儀表有限公司);ULTMATE3000高效液相色譜儀(美國賽默飛公司)。

        1.3方法

        1.3.1西蘭花莖葉蛋白酶解流程。

        西蘭花莖葉蛋白漿→冷凍干燥→配制西蘭花莖葉蛋白懸浮液→85 ℃滅菌20 min→調(diào)pH、加酶→恒溫水浴鍋酶解→100 ℃滅酶15 min→200 nm孔徑陶瓷濾膜,取透過液→200 Da孔徑卷式膜,取截留液→西蘭花莖葉蛋白酶解液。

        1.3.2分析測定方法。蛋白含量采用微量凱氏定氮法測定;水解度采用甲醛電位滴定法測定[7],通過式(1)計算水解度。

        水解度=C×(V1-V0)×0.014×m/(5×M)×100%??(1)

        式中,C為NaOH濃度(mol/L);V1為樣品在加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL);V0為空白在加入甲醛后消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積(mL);m為酶解液氨基氮質(zhì)量(mg);M為樣品總氮質(zhì)量(mg)。

        1.3.3單因素試驗。

        以水解度為指標(biāo),固定酶解時間為3 h,選擇底物濃度和加酶量進行單因素試驗。其他基礎(chǔ)條件參照酶的說明書和向廠家詢問的最適條件。各個因素變化梯度分別為底物濃度(2%、3%、4%、5%、6%)、加酶量(1 000、?2 000、3 000、4 000和5 000 U/g)。

        1.3.4西蘭花莖葉蛋白酶解條件優(yōu)化。

        選取pH、酶解溫度、底物濃度和加酶量4個因素,以水解度為響應(yīng)值,運用4因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗,優(yōu)化堿性蛋白酶酶解參數(shù),其響應(yīng)面因素及水平如表1所示。

        1.3.5西蘭花莖葉蛋白酶解物中蛋白肽的分子量分布。色譜條件:凝膠柱TSKgel G2000SWXL(7.8 mm×300 mm);流動相為乙腈/超純水/TFA=45/55/0.1(V/V),流速為?0.5 mL/min;檢測波長為220 nm;柱溫30 ℃。選用GSH(還原型谷胱甘肽,MW 307.00 Da)、GSSG(氧化型谷胱甘肽,MW 613.00 Da)、桿菌肽(MW 1 422.69 Da)、胰島素(MW ?5 777.54 Da)和細胞色素C(MW 12 384.00 Da)為標(biāo)準(zhǔn)品,通過凝膠色譜測定酶解產(chǎn)物蛋白肽分子量分布。

        1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

        試驗結(jié)果由Microsoft Excel 2007進行處理,采用SPSS 19.0軟件對各組數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,Duncans法進行多重比較。

        2結(jié)果與分析

        2.1西蘭花莖葉蛋白酶解單因素試驗結(jié)果

        2.1.1加酶量。由圖1可知,隨著酶添加量的增大,水解度呈上升趨勢,但過了2 000 U/g曲線斜率變小,這是由于在酶解反應(yīng)初期,加酶量的增大可以使更多的底物被作用,從而提高水解速度;當(dāng)加酶量達到一定程度時,酶量的增加反而會抑制酶解速度[8]。周雪松[9]的研究表明,當(dāng)酶用量大于最適濃度時,過量的酶很難與底物接觸,其對底物蛋白的水解能力不會明顯提高,如果酶量過大甚至?xí)鹈傅淖匀茉鰪姟?紤]到試驗成本和試劑最大利用率,加酶量選?2 000 U/g左右較合適。

        2.1.2底物濃度。由圖2可知,在酶解過程中,底物濃度為2%~4%時,隨著底物濃度的增加,水解度有明顯的提升,但是當(dāng)?shù)孜餄舛冗M一步增大時,水解度雖然也增大,但是提升的趨勢平緩。這是因為底物濃度的增大,降低了體系中的酶濃度,使得酶促反應(yīng)速度下降,水解度降低[10-11],故選擇底物濃度3%左右較為合適。

        2.2西蘭花莖葉蛋白堿性蛋白酶水解條件優(yōu)化

        在單因素試驗基礎(chǔ)上,固定堿性蛋白酶酶解時間為3 h,選取pH、酶解溫度、底物濃度和加酶量4個因素,以水解度為響應(yīng)值,運用響應(yīng)面試驗設(shè)計,優(yōu)化堿性蛋白酶酶解參數(shù),試驗結(jié)果見表2。

        對表2結(jié)果進行多元擬合分析,得到堿性蛋白酶水解度對pH、溫度、加酶量和底物濃度的二次多項回歸方程Y=?19.47+2.38A+1.02B+4.44C+2.62D+2.74AB+0.75AC-?0.060AD+1.35BC+0.34BD+1.70CD-1.10A2-1.71B2-0.85C2-?2.92D2,R2=0.990 2。由回歸模型方差分析可知,二次多項回歸方程P<0.000 1,表明該二次多項回歸模型高度顯著,且失擬值為0.534 3>0.05,不顯著,表明模型與實際情況擬合得很好,預(yù)測值與實際測量值之間具有高度的相關(guān)性,可以應(yīng)用到理論的預(yù)測[12]。由F值可以看出,影響堿性蛋白酶酶解效果的各因素主次關(guān)系為底物濃度(C)>加酶量(D)>pH(A)>溫度(B)。通過數(shù)據(jù)分析,確定堿性蛋白酶最優(yōu)酶解條件為pH10、酶解溫度55 ℃、加酶量2 800 U/g、底物濃度4%,此條件下堿性蛋白酶實際水解度為31.13%,與理論水解度?30.29%基本一致。

        2.3西蘭花莖葉蛋白酶解影響因素交互作用分析

        對兩因素間交互作用的交互分析采用降維分析法。觀察響應(yīng)面的陡峭程度可看出因素變化對響應(yīng)值的影響效果,響應(yīng)面越平緩,說明響應(yīng)值對因素變化不敏感,反之,則表示響應(yīng)值對因素變化比較敏感,簡而言之,隨著因素的變化響應(yīng)值會做出相應(yīng)的敏感反應(yīng)[13]。該研究根據(jù)回歸方程建立響應(yīng)面圖(圖3)。觀察圖3中各個響應(yīng)面可知, AB、BC、CD存在極顯著的交互作用(P<0.01);AC之間的交互作用顯著( 0.010.05)。

        2.4西蘭花莖葉蛋白酶解物中蛋白肽分子量分布

        西蘭花莖葉蛋白酶解物中主要成分為小分子蛋白肽。標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的洗脫時間分別為細胞色素C為11.90 min,胰島素為?14.13 min,桿菌肽為15.86 min,GSSG為19.01?min,GSH為19.85 min。相同條件下測定西蘭花莖葉蛋白肽的分子質(zhì)量,其分子質(zhì)量的分布如圖4所示,西蘭花莖葉蛋白主要水解為相對分子量3 000 Da以下的小分子肽,其中分子量1 000 Da以下組分占65.63%。

        3結(jié)論

        該研究以西蘭花莖葉蛋白為原料,水解度為響應(yīng)值,通過單因素試驗和響應(yīng)面設(shè)計分析優(yōu)化堿性蛋白酶酶解西蘭花莖葉蛋白的工藝條件。最終確定堿性蛋白酶酶解西蘭花莖葉蛋白的最佳酶解條件為pH 10、溫度55 ℃、加酶量?2 800 U/g、底物濃度4%,此條件下堿性蛋白酶實際水解度為31.13%,與理論水解度30.29%基本一致。

        以往的研究發(fā)現(xiàn),活性肽所具有的抗氧化以及抗菌等活性跟其分子量大小有著密切關(guān)聯(lián),一般情況下,活性肽分子量越小,其生物活性則越強[14]。蛋白肽作為蛋白質(zhì)降解的中間產(chǎn)物,它的作用體現(xiàn)在以下2個方面:一方面它可以繼續(xù)降解成氨基酸被腸道吸收利用以合成機體蛋白;另一方面它可以直接以小肽的形式被機體吸收利用,從而發(fā)揮更重要的生理功能。蛋白質(zhì)在酶解時所用到的蛋白酶在水解過程中同樣會產(chǎn)生許多小分子量的活性成分,這些小片段肽可能在機體內(nèi)會具有特殊生理調(diào)節(jié)功能[15]。該研究通過分析西蘭花莖葉蛋白酶解產(chǎn)物分子量分布,發(fā)現(xiàn)西蘭花莖葉蛋白經(jīng)堿酶酶解后,其主要成分為相對分子量3 000 Da以下的小分子肽,其中分子量1 000 Da以下組分占65.63%。已有研究表明,米糠蛋白[16]、羽扇豆蛋白[17]、大豆蛋白水解物[18]等植物蛋白源類物質(zhì)有良好的降血脂活性。該試驗為西蘭花莖葉蛋白酶解物生理活性的研究奠定了基礎(chǔ),也為西蘭花莖葉蛋白的高值化開發(fā)提供了參考。

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