秦曉冰

摘要從青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院的蛋雞送檢病料中，無菌采集病死雞肺臟、肝臟組織進(jìn)行細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定，并對(duì)鑒定的分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和致病性試驗(yàn)。結(jié)果表明，分離菌在血瓊培養(yǎng)基上呈圓隆、露滴狀、表面光滑帶熒光的白色菌落，染色鏡檢為革蘭氏陰性短桿菌，經(jīng)PCR鑒定該菌為多殺性巴氏桿菌;該菌對(duì)氟苯尼考、阿米卡星高度敏感，對(duì)頭孢曲松、頭孢氨芐、阿莫西林等13種藥物表現(xiàn)出不同程度耐藥;該菌對(duì)小鼠呈高致死性，表明該菌具有很強(qiáng)的致病性。

關(guān)鍵詞雞源多殺性巴氏桿菌;分離;鑒定;致病性

中圖分類號(hào)S?831.7文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）18-0088-02

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.021

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation and Identification of Pasteurella multocida from Chicken and Its Pathogenicity Research

QIN Xiao-bing（Shandong Key Laborary of Preventive Veterinary Medicine，Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shandong 266109）

AbstractThe lungs and liver tissues of dead laying hens were collected from the animal hospital of Qingdao Agricultural University under sterile conditions to make pathogen isolation，culture and identification.And the drug sensitivity test and pathogenicity test were carried out on the identified and isolated bacteria. The results showed that the isolated bacteria were round，dripping，smooth surface and white colonies with fluorescence on the blood-agar medium，and the isolated bacteria were Gram-negative small bacterium by staining and microscopic examination，and they were identified as Pasteurella multocida by PCR. The isolated strain was highly sensitive to florfenicol and amikacin，and had different drug resistance to ceftriaxone，cephalexin，amoxicillin and other 10 drugs.Furthermore，the isolated strain was highly pathogenic to mice，showing stronger pathogenicity.

Key wordsP.multocida from chicken;Isolation; Identification;Pathogenicity

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）屬于巴氏桿菌科巴氏桿菌屬，是革蘭氏陰性小桿菌[1]。Pm引起雞的出血性敗血癥，又稱禽霍亂，是以病雞出現(xiàn)腸道出血、敗血癥和關(guān)節(jié)炎為主要特征，發(fā)病率和死亡率都非常高的禽重要傳染病之一[2]。Pm存在于禽類的上呼吸道，當(dāng)遇到環(huán)境應(yīng)激或者動(dòng)物機(jī)體抵抗力降低時(shí)會(huì)誘發(fā)該病。

禽巴氏桿菌病在臨床診斷上主要分為最急性型、急性型、慢性型。其中，最急性型常表現(xiàn)為無任何前驅(qū)癥狀，突然倒地，很快死亡，剖檢無特殊病變;急性型最為常見，主要表現(xiàn)為敗血癥，發(fā)病率高、死亡率高;慢性型主要表現(xiàn)為鼻竇腫大、肉髯顯著腫大、關(guān)節(jié)炎等，病死率較低，病例剖檢的變化常因侵害器官不同而異[3-5]。Pm的發(fā)生給養(yǎng)禽業(yè)帶來了不同程度的損失，也給禽產(chǎn)品帶來了食品安全問題，加強(qiáng)對(duì)多殺性巴氏桿菌的研究對(duì)于保護(hù)養(yǎng)禽業(yè)的健康和可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

1材料與方法

1.1病料與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

病料來自于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院的某蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)送檢病死雞，無菌采集其肺臟、肝臟等器官組織。昆明小鼠購自青島派特福德養(yǎng)殖專業(yè)合作社。

1.2主要試劑

犢牛血清購自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司，瓊脂等培養(yǎng)基購自生工生物工程（上海）股份有限公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型），購自天根生化科技有限公司。DNA Marker、DNA 純化回收試劑盒均購自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，瓊脂糖凝膠購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。藥敏試紙購自杭州天和微生物有限公司，其他試劑和染色液均由山東省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3細(xì)菌的分離培養(yǎng)與染色鏡檢

無菌采集病死雞病料肺臟、肝臟等組織分泌物，接種于血清瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長(zhǎng)狀態(tài);選取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢，觀察其形態(tài)特征，并對(duì)疑似菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.4PCR鑒定

1.4.1引物設(shè)計(jì)與合成。

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫登錄的Pm的 Kmt基因，設(shè)計(jì)1對(duì)引物：

Kmt-P1為5-GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGC-3，Kmt-P2為5-TCATCGCACCGTCAAAGGAACCGT-3。引物由北京百盛生物公司合成，預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)度為457 bp。

1.4.2Kmt 基因的擴(kuò)增與鑒定。

取Pm菌液1 mL，離心后取上清液為模板，用Kmt-P1和Kmt-P2進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系（25 μL）：P1、P2、DNA模板各1 μL，ddH2O 14.75 μL，10×Buffer和MgCl2各2.5 μL，dNTP Mix 2 μL，Taq酶0.25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ ?45 s，55 ℃45 s，72 ℃ ?45 s，共30個(gè)循環(huán);72?℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后進(jìn)行回收。

1.5藥敏試驗(yàn)

采用紙片-瓊脂擴(kuò)散法對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，將含有分離菌的肉湯培養(yǎng)液涂布于血瓊培養(yǎng)基，置于恒溫箱孵育1 h，取出將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃條件下過夜，測(cè)量抑菌圈直徑。

1.6動(dòng)物試驗(yàn)

從純化培養(yǎng)24 h的血清瓊脂平板中挑選6個(gè)單菌落，分別無菌接種于含犢牛血清的肉湯培養(yǎng)液中，置于37 ℃、200 r/min的搖床中振蕩24 h。用移液器向新潔凈離心管中加入180 μL滅菌生理鹽水并從原離心管中吸取?20 μL的菌液，混勻后稀釋成1∶10的菌液，按上述操作配制成濃度以10倍遞減的菌液。吸取100 μL的各稀釋菌液移入不同血清瓊脂培養(yǎng)基中涂布，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)?24 h，菌落長(zhǎng)出后計(jì)數(shù)。菌液活菌數(shù)（CFU/mL）=所選平板菌落?數(shù)×稀釋倍數(shù)×10，計(jì)算結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)值（2.5×?108 CFU/mL）進(jìn)行比較。選擇2組活菌數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)值相近的菌液，分為 Ⅰ 組和 Ⅱ 組，每組皮下接種6只7日齡的健康小鼠，劑量為?1 mL/只;另外3只小鼠作為對(duì)照組（CK），接種生理鹽水，劑量為1 mL/只，正常給水給料，飼養(yǎng)24 h后觀察臨床癥狀及死亡率，并對(duì)分離菌進(jìn)行鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1分離菌的培養(yǎng)特性

用病死雞肝臟和肺臟組織分別進(jìn)行細(xì)菌分離與培養(yǎng)，該分離菌在麥康凱培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，在血清瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后形成圓隆、露滴狀、表面光滑的半透明白色菌落，45°折光下可見有淡藍(lán)色熒光，不溶血，革蘭氏染色鏡檢可見菌體鈍圓，呈陰性的短桿菌（圖1）。該分離菌與多殺性巴氏桿菌的分離培養(yǎng)特性一致。

2.2Kmt基因的擴(kuò)增結(jié)果Kmt基因擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段小于500 bp，與預(yù)期結(jié)果相符（圖2）。測(cè)序后登錄NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blast同源性比對(duì)，分離菌與Pm菌株的同源性為99.6%，進(jìn)一步證實(shí)該菌為多殺性巴氏?桿菌。

2.3藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌對(duì)青霉素、頭孢曲松、頭孢氨芐、阿莫西林、新霉素、卡那霉素、多西環(huán)素、阿奇霉素等13種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥，對(duì)紅霉素、氧氟沙星、慶大霉素中度敏感，對(duì)氟苯尼考、阿米卡星高度敏感。根據(jù)多重耐藥的判定原則，該菌株對(duì)2類以上的抗生素同時(shí)耐藥，判定該菌株為多重耐藥菌株。

2.4動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

相同濃度的2種菌液腹部皮下注射小鼠后，Ⅰ、Ⅱ 組試驗(yàn)小鼠24 h內(nèi)死亡11只，Ⅰ 組 6只全部死亡，Ⅱ組死亡5只，活著的一只小鼠眼部出血，對(duì)照組（CK）小鼠正常。對(duì)12只小鼠進(jìn)行剖檢，可見肺臟出血（12/12），肝臟和脾臟出血、腫脹（12/12），腎臟和心臟表明有出血點(diǎn)（11/12）。經(jīng)鑒定從試驗(yàn)死亡小鼠肺臟中分離到與原分離菌相一致的巴氏桿菌，表明分離菌與多殺性巴氏桿菌致死小鼠的癥狀一致，且該菌具有較強(qiáng)的致病力。

3討論

Pm可以在家禽的上呼吸道和消化道存在，是一種條件性致病菌，當(dāng)雞舍內(nèi)產(chǎn)生氣溫驟變、通風(fēng)不良等應(yīng)激因素，或者雞感染其他疫病造成機(jī)體抵抗力下降時(shí)，容易誘發(fā)該菌的繁殖，引起禽霍亂的發(fā)生[6]。該病在臨床上發(fā)生經(jīng)常有其他誘發(fā)因素，特別是疫病的誘發(fā)，常常伴隨著敗血支原體、大腸桿菌病和沙門氏菌等發(fā)生多重混合感染[7]。Pm往往容易被忽略，此次從病料中分離的細(xì)菌中就含有大腸桿菌。實(shí)驗(yàn)室在其他蛋雞送檢病料中，也多次分離到Pm，說明在規(guī)?；半u養(yǎng)殖場(chǎng)中Pm依然存在，有潛在的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

Pm容易產(chǎn)生耐藥性，該試驗(yàn)中分離的菌株對(duì)青霉素、頭孢氨芐、阿莫西林、多西環(huán)素、阿奇霉素等13種抗生素表現(xiàn)出不同程度的耐藥，這與許多研究報(bào)道[8-10]相一致。建議雞場(chǎng)不要盲目濫用抗生素藥物，臨床不發(fā)病時(shí)，不要用抗生素;發(fā)病時(shí)，盡量用中草藥或者益生素代替抗生素;不得不用時(shí)必須要遵守《獸醫(yī)使用規(guī)范》，并且是2種不同的抗生素交叉使用。發(fā)生疫病時(shí)，要先進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，選擇敏感的藥物進(jìn)行治療，并且要隔離病雞，加強(qiáng)消毒，將疫情消滅在萌芽狀態(tài)。

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