陳琦，李春秀，鄭高偉，郁惠蕾，許建和

工業(yè)蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的計(jì)算生物學(xué)解析

陳琦，李春秀，鄭高偉，郁惠蕾，許建和

華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院，上海 200237

工業(yè)催化用酶已經(jīng)成為現(xiàn)代生物制造技術(shù)的核心“芯片”。不斷設(shè)計(jì)和研發(fā)新型高效的酶催化劑是發(fā)展工業(yè)生物技術(shù)的關(guān)鍵。工業(yè)催化劑創(chuàng)新設(shè)計(jì)的科學(xué)基礎(chǔ)是對(duì)酶與底物的相互作用、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制的深入剖析。隨著生物信息學(xué)和智能計(jì)算技術(shù)的發(fā)展，可以通過(guò)計(jì)算的方法解析酶的催化反應(yīng)機(jī)理，進(jìn)而對(duì)其結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域進(jìn)行理性重構(gòu)，實(shí)現(xiàn)酶催化性能的定向設(shè)計(jì)與改造，促進(jìn)其工業(yè)應(yīng)用。聚焦工業(yè)酶結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系解析的計(jì)算模擬和理性設(shè)計(jì)，已成為工業(yè)酶高效創(chuàng)制改造不可或缺的關(guān)鍵技術(shù)。本文就各種計(jì)算方法和設(shè)計(jì)策略以及未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行簡(jiǎn)要介紹和討論。

工業(yè)蛋白質(zhì)，酶，結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，分子模擬，理性設(shè)計(jì)

酶催化為大宗化學(xué)品、精細(xì)化學(xué)品和新型材料等產(chǎn)品提供了一種可持續(xù)的綠色合成策略，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物制造產(chǎn)業(yè)的核心“芯片”，也是國(guó)際知識(shí)產(chǎn)權(quán)爭(zhēng)奪的焦點(diǎn)。天然環(huán)境中獲得的酶催化性能一般較差，難以滿足工業(yè)應(yīng)用對(duì)其催化活力、穩(wěn)定性、溶劑耐受性、底物譜等各個(gè)方面的性能要求，需要進(jìn)行進(jìn)一步分子改造。因此，不斷設(shè)計(jì)和研發(fā)新型、高效的酶催化劑是發(fā)展工業(yè)生物技術(shù)的關(guān)鍵所在。

工業(yè)催化劑創(chuàng)新設(shè)計(jì)的科學(xué)基礎(chǔ)是對(duì)酶與底物的相互作用、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系及其調(diào)控機(jī)制的深入剖析。對(duì)蛋白質(zhì)特定區(qū)域或位點(diǎn)特征的計(jì)算研究主要集中在：活性位點(diǎn)的構(gòu)象、動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、突變效應(yīng)和反應(yīng)環(huán)境的影響；底物結(jié)合和產(chǎn)物釋放；底物傳遞；輔因子結(jié)合和釋放；催化機(jī)制和過(guò)渡態(tài)途徑等。相關(guān)的計(jì)算手段主要有分子動(dòng)力學(xué)模擬(Molecular dynamics simulation, MD)[1]、量子力學(xué)模擬(Quantum mechanics, QM)、混合量子力學(xué)和分子力學(xué)(Quantum mechanics/molecular mechanics, QM/MM) 模擬等[2]。

分子動(dòng)力學(xué)模擬以經(jīng)典牛頓力學(xué)為理論基礎(chǔ)，模擬獲取體系內(nèi)所有原子隨時(shí)間運(yùn)動(dòng)的軌跡，通過(guò)分析軌跡文件中整個(gè)體系的結(jié)構(gòu)或原子之間相互作用變化，來(lái)解析整個(gè)體系的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)。通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬或其他采樣方法分析酶的構(gòu)象靈活性，可以闡明活性位點(diǎn)和突變位點(diǎn)對(duì)酶催化活性的調(diào)控作用?；旌狭孔恿W(xué)和分子力學(xué)用量子力學(xué)方法計(jì)算生物大分子活性部位，用分子力學(xué)、分子動(dòng)力學(xué)或自由能微擾理論計(jì)算體系中其他原子，這樣就可得到生物大分子活性部位的電子結(jié)構(gòu)，通過(guò)能量分析，研究底物的結(jié)合模式及酶的催化機(jī)理等性質(zhì)[3]。QM/MM能夠在計(jì)算能量分布和能壘、獲得催化機(jī)理信息、反應(yīng)途徑、反應(yīng)速率等方面提供準(zhǔn)確性更高的解析。

除了常規(guī)的計(jì)算方法，研究者不斷開(kāi)發(fā)其他或有針對(duì)性的計(jì)算策略深入研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系。結(jié)合計(jì)算模擬和實(shí)驗(yàn)分析，不僅可以揭示酶分子催化反應(yīng)背后的結(jié)構(gòu)機(jī)理，同時(shí)可以指導(dǎo)酶的分子改造，促進(jìn)其工業(yè)應(yīng)用[4-5]。Baker課題組開(kāi)發(fā)了RosettaDesign和RosettaReModel工具來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和靈活性設(shè)計(jì)[6]。JANUS通過(guò)分析多序列比對(duì)的結(jié)果來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)相關(guān)但功能不同的酶改造所需的突變[7]?；赪eb服務(wù)器的HotSpot Wizard可以用于自動(dòng)識(shí)別酶結(jié)構(gòu)中的“熱點(diǎn)”氨基酸，指導(dǎo)針對(duì)底物特異性、催化活力或?qū)τ尺x擇性的設(shè)計(jì)改造，以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的注釋[8]。POCKETOPTIMIZER針對(duì)活性口袋進(jìn)行設(shè)計(jì)，可用于對(duì)酶的活性位點(diǎn)殘基進(jìn)行替換，提高其對(duì)小分子底物的結(jié)合能力[9]。CAVER和POVME2可用于分析通過(guò)MD模擬所獲得的軌跡中底物口袋和通道的形態(tài)和大小，有針對(duì)性地指導(dǎo)活性口袋和底物通道的結(jié)構(gòu)改造[10-11]。荷蘭Janssen課題組開(kāi)發(fā)的CASCO工具可以用于突變體的設(shè)計(jì)，通過(guò)高通量的MD模擬對(duì)設(shè)計(jì)的突變進(jìn)行排序，以指導(dǎo)酶的立體選擇性改造實(shí)驗(yàn)[12]。FRESCO方法通過(guò)預(yù)測(cè)折疊自由能、增加二硫鍵、剔除不合理突變等步驟來(lái)設(shè)計(jì)小巧型突變體文庫(kù)，理性指導(dǎo)酶的熱穩(wěn)定性改造[13]。

1 基于計(jì)算生物學(xué)的酶分子理性設(shè)計(jì)

1.1 解析酶的催化機(jī)理

多尺度的分子動(dòng)力學(xué)模擬和QM/MM模擬已被廣泛地用于多種類(lèi)型的酶分子催化反應(yīng)機(jī)理的解析[14-18]。

針對(duì)二氫葉酸還原酶ecDHFR催化循環(huán)中的關(guān)鍵問(wèn)題，即Met20環(huán)在化學(xué)氫化物轉(zhuǎn)移步驟中是否采用閉合構(gòu)象，Major等使用QM/MM模擬研究了野生和突變型ecDHFR酶的Met20環(huán)在反應(yīng)中的構(gòu)象。研究表明，盡管Met20環(huán)的構(gòu)象對(duì)氫化物轉(zhuǎn)移速率和供體-受體距離的相關(guān)性不明顯，但它對(duì)活性位點(diǎn)水合的有序性具有十分顯著的影響[19]。劉永軍課題組利用QM/MM探索來(lái)源于熱帶假絲酵母的烯?；蝓ミ€原酶Etr1p催化烯酰硫酯為?；蝓サ拇呋瘷C(jī)制。計(jì)算結(jié)果表明穩(wěn)定的共價(jià)烯加合物的形成遵循邁克爾加成機(jī)理。同時(shí)，結(jié)晶水分子雖然不參與催化反應(yīng)，但通過(guò)形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)在氫化物轉(zhuǎn)移和質(zhì)子轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用[20]。Loll等解析了典型的二萜合酶CotB2催化反應(yīng)的化學(xué)機(jī)制。隨著陽(yáng)離子沿著反應(yīng)路徑的變化，CotB2活性中的三維結(jié)構(gòu)也隨之改變，作者確定了活性中心通用的結(jié)構(gòu)特征，可用于其他來(lái)源的萜烯合酶生成大環(huán)化合物的理性設(shè)計(jì)[21]。Leys獲得了合成單萜的芳樟醇合成酶和1,8-桉樹(shù)腦合成酶與氟化底物類(lèi)似物的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。模擬表明這些單萜合酶在反應(yīng)中不會(huì)發(fā)生顯著的構(gòu)象變化，這樣有助于利用基于結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)工程手段，將這些酶的催化范圍擴(kuò)展到其他單萜底物[22]。

細(xì)胞色素P450酶的底物譜非常廣泛，Houk課題組綜合使用DFT計(jì)算和MD模擬分析酶分子的構(gòu)象變化和結(jié)合機(jī)制，解析酶催化機(jī)制和過(guò)渡態(tài)[23]。另外，P450過(guò)氧化酶OleTJE使用H2O2作為氧化劑，催化脂肪酸轉(zhuǎn)化為烯烴而無(wú)需額外的電子傳遞。Faponle等同樣綜合利用DFT和QM/MM研究，針對(duì)OLeTJE進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造以提高產(chǎn)品的選擇性[24]。德國(guó)Reetz課題組獲得細(xì)胞色素P450-BM3單加氧酶可以有效生物催化生成對(duì)苯二酚。計(jì)算研究證實(shí)P450-BM3突變體對(duì)苯酚選擇性氧化，導(dǎo)致在環(huán)氧化物中間體C3=C4雙鍵上產(chǎn)生區(qū)域選擇性[25]。

Moliner等開(kāi)展了關(guān)于甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶和3種突變體催化SN2反應(yīng)實(shí)現(xiàn)甲基轉(zhuǎn)移的QM / MM理論研究，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)觀察到的速率恒定還原和反向次級(jí)α-3H動(dòng)力學(xué)同位素效應(yīng)的變化是否應(yīng)該歸因于甲基供體與受體間距離的變化，計(jì)算獲得的活化自由能和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)非常一致[26]。同樣的，Damborsky等對(duì)鹵代烷脫鹵素酶DhaA31催化水解1,2,3-三氯丙烷所涉及的主要步驟進(jìn)行了全面的計(jì)算研究。研究發(fā)現(xiàn)底物從通道進(jìn)入活性中心并結(jié)合是一個(gè)相對(duì)快速的過(guò)程，碳-鹵鍵的裂解為反應(yīng)中的限速步驟。突變體中可催化的構(gòu)象數(shù)目增加且SN2的反應(yīng)能壘降低，使得突變體中限速步驟的效率顯著增強(qiáng)。最終通過(guò)對(duì)DhaA31的突變實(shí)驗(yàn)和對(duì)中間突變體的動(dòng)力學(xué)分析證實(shí)了理論觀察的結(jié)果[27]。

分子氧的活化機(jī)制是金屬酶研究中的核心問(wèn)題，Shaik課題組針對(duì)非血紅素羥乙基膦酸酯雙加氧酶HEPD和甲基膦酸合酶MPnS這兩種特殊C-H加氧酶進(jìn)行QM/MM模擬研究，結(jié)果顯示MPnS中的O2活化是由活性位點(diǎn)中的相鄰賴氨酸Lys28介導(dǎo)的，證實(shí)了在金屬酶的氧活化機(jī)制中存在不尋常的質(zhì)子穿梭機(jī)制[28]。Faber等解析了金屬依賴型異乳清酸脫羧酶IDCase催化-芳香雜環(huán)化合物區(qū)域選擇性羧化的反應(yīng)機(jī)制和底物特異性機(jī)理。結(jié)果表明天然底物5-羧基尿嘧啶的脫羧是通過(guò)親電芳香取代反應(yīng)進(jìn)行的，且雜環(huán)底物與周?chē)陌被釟埢纬瑟?dú)特的氫鍵作用，使得IDCase顯示出較高的底物特異性[29]。

1.2 提高酶的催化效率

基于催化反應(yīng)機(jī)理的計(jì)算解析的催化機(jī)理，可以全面揭示蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系，并針對(duì)性地對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合口袋和活性位點(diǎn)進(jìn)行理性設(shè)計(jì)改造。例如，大位阻的底物對(duì)結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)具有更高的依賴性，通過(guò)突變可以調(diào)節(jié)結(jié)合口袋的靈活性(如結(jié)合口袋的體積)，以形成更適合特定底物識(shí)別和穩(wěn)定的構(gòu)象狀態(tài)[30-31]。

通過(guò)在活性位點(diǎn)附近的位置引入單突變，孔旭東等將來(lái)源于巨大芽孢桿菌的環(huán)氧水解酶EH底物范圍擴(kuò)大到更具空間要求的環(huán)氧化物底物[32]。英國(guó)Turner課題組對(duì)來(lái)自黑曲霉的單胺氧化酶MAO-N野生酶進(jìn)行研究，設(shè)計(jì)獲得了一系列突變體能夠催化各種大位阻的手性胺底物。這些突變位點(diǎn)不僅位于酶的疏水口袋，其中一部分還位于遠(yuǎn)離酶催化活性中心的遠(yuǎn)端位置[33-34]。Klinman課題組通過(guò)計(jì)算手段理性推測(cè)得到大豆脂氧合酶SLO-1從溶液到酶活性位點(diǎn)的氧分子通道，結(jié)合定點(diǎn)突變方法，最終確定氧通道中兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸的調(diào)控機(jī)制，并計(jì)算出相應(yīng)突變體的氧分子通道模型[35]。Shin等開(kāi)展()-構(gòu)型選擇性轉(zhuǎn)氨酶OATA的晶體結(jié)構(gòu)及計(jì)算模擬分析，從分子機(jī)制角度解釋了酶催化的反應(yīng)機(jī)理，所獲得的雙點(diǎn)突變體對(duì)3種酮底物的催化活力均有顯著提高[36]。Kaila等對(duì)FeII/α-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶AsqJ催化喹諾酮生物堿的多步合成進(jìn)行研究。發(fā)現(xiàn)底物的甲基化對(duì)活性位點(diǎn)內(nèi)π-堆積相互作用進(jìn)行微調(diào)，對(duì)AsqJ的催化反應(yīng)必不可少。為了對(duì)AsqJ進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，作者擴(kuò)大了活性位點(diǎn)內(nèi)的相互作用，最終獲得的工程酶對(duì)非甲基化替代物具有顯著增強(qiáng)的催化活性[37]。根據(jù)對(duì)底物結(jié)合模式的分析，Mattevi對(duì)5-羥甲基糠醛氧化酶HMFO氧化5-甲?；?2-呋喃甲酸生成2,5-呋喃二甲酸進(jìn)行理性設(shè)計(jì)改造，兩個(gè)關(guān)鍵突變?cè)黾拥孜锝Y(jié)合親和力并促進(jìn)酶與底物醛基以正確結(jié)合姿勢(shì)結(jié)合[38]。類(lèi)似的策略同樣被用于設(shè)計(jì)改造禾谷鐮刀菌殼寡糖氧化酶的底物譜，使其對(duì)乙酰-D-葡糖胺的底物特異性發(fā)生改變，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)其他非天然底物的高效催化[39]。

針對(duì)來(lái)源于光滑假絲酵母的野生型羰基還原酶KR1的底物適用性不夠廣泛、催化活性不夠高的缺陷，鄭高偉等通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬分析發(fā)現(xiàn)位于該酶底物通道loop上的92位苯丙氨酸與175位催化酪氨酸形成π-π堆積作用，阻礙底物與催化殘基的結(jié)合?；诮Y(jié)構(gòu)分析尋找到了兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行突變驗(yàn)證，最終獲得一種活性顯著提高的突變體對(duì)28種結(jié)構(gòu)多樣性的羰基底物的催化活性均得到顯著提高，可成功用于多種藥物手性中間體的擴(kuò)大制備(圖1)[40]。除此之外，課題組分析了羧酸酯酶rPPE的野生型和有益突變體中底物結(jié)合模式的區(qū)別，揭示了突變體酶的催化活力、熱穩(wěn)定性和對(duì)映選擇性提高的結(jié)構(gòu)機(jī)理。綜合分析酶的底物結(jié)合模式、氨基酸位置及序列保守性來(lái)尋找潛在敏感的關(guān)鍵氨基酸，預(yù)測(cè)候選氨基酸突變對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和酶活力的影響程度。虛擬篩選出兩個(gè)潛在的突變體經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證催化活力較母本均有顯著提高，大幅度改善了酶促合成藥物關(guān)鍵中間體的催化效率[41]。針對(duì)胺脫氫酶底物譜較窄的問(wèn)題，許建和課題組采用計(jì)算機(jī)輔助的蛋白質(zhì)工程技術(shù)，確定了酶活性口袋中影響酶與大位阻底物結(jié)合的關(guān)鍵殘基，通過(guò)將其突變成分子最小的甘氨酸，實(shí)現(xiàn)了對(duì)口袋的“裁剪”，拓展了活性口袋的“體積”。將酶催化的底物范圍由最長(zhǎng)6個(gè)碳鏈的脂肪酮拓展至長(zhǎng)達(dá)10個(gè)碳鏈的脂肪酮(如2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮)，顯著地拓寬了該酶催化的底物范圍。此外，這兩個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基的突變?cè)诹硗鈨蓚€(gè)同源胺脫氫酶的改造中也具有類(lèi)似的效果，為其他胺脫氫酶的底物譜拓展提供了有益的參考(圖2)[42]。

圖1 羰基還原酶CgKR1對(duì)多種羰基底物的催化活性均顯著提高[40]

1.3 立體選擇性設(shè)計(jì)

具有對(duì)映選擇性的酶作用于一些前手性底物上，可以精確地生成所需的光學(xué)純的對(duì)映體產(chǎn)物。生物催化劑的立體選擇性是由底物結(jié)合、反應(yīng)能壘等多種因素組合而產(chǎn)生的。通過(guò)對(duì)酶分子構(gòu)象的研究可以發(fā)現(xiàn)，酶的底物結(jié)合口袋呈現(xiàn)出一種穩(wěn)定構(gòu)象，使得其僅適應(yīng)生成一種特定的對(duì)映體。另一方面，可以通過(guò)引入突變改變酶的能量圖景，使其能更優(yōu)先形成所需的對(duì)映體，實(shí)現(xiàn)立體選擇性的逆轉(zhuǎn)[43]。

圖2 胺脫氫酶的底物結(jié)合口袋改造前后結(jié)構(gòu)對(duì)比[42]

QM/MM和MD模擬可以從分子水平上分析調(diào)控酶對(duì)映選擇性的關(guān)鍵因素[44]。大多數(shù)的計(jì)算研究都是分析在整個(gè)MD模擬過(guò)程中，底物分子和關(guān)鍵催化氨基酸之間的距離和角度，從而定量分析底物分子在催化中心形成可催化的pro-() 或者pro-() 構(gòu)象的頻率[45-46]。van der Kamp等模擬解析了酮還原酶Ⅱ型聚酮合成酶actKR和兩個(gè)關(guān)鍵突變體中影響立體選擇性的3種潛在因素：利用經(jīng)典分子動(dòng)力學(xué)評(píng)估形成pro-或pro-反應(yīng)姿勢(shì)的頻率；采用MM/PBSA自由能方法比較pro-或pro-朝向的結(jié)合親和力；通過(guò)QM/MM MD模擬與傘形采樣評(píng)估它們生成-1-decalol反應(yīng)能壘的差異[47]。檸檬烯環(huán)氧水解酶LEH突變體可以催化環(huán)戊烯氧化物和環(huán)己烯氧化物等環(huán)氧化物的水解不對(duì)稱化，不同突變體具有不同的(,)-或()-立體選擇性。Reetz等解析了相關(guān)突變體對(duì)不同底物的特異選擇性和立體選擇性催化的分子機(jī)制。根據(jù)計(jì)算出的各種途徑的活化能，作者發(fā)現(xiàn)了有利反應(yīng)的潛在立體化學(xué)機(jī)制。由于活性口袋具有顯著的靈活性，親核水分子和環(huán)戊烯氧化物之間無(wú)法形成催化構(gòu)象。相反，在催化環(huán)己烯氧化物的立體選擇性反應(yīng)時(shí)卻容易形成反應(yīng)構(gòu)象[48]。相關(guān)的研究證明了酶催化中立體選擇性的復(fù)雜性以及基于原子的模擬方法在分析這類(lèi)問(wèn)題中的重要作用，同時(shí)研究結(jié)果也為立體選擇性的理性設(shè)計(jì)提供了理論基礎(chǔ)。

設(shè)計(jì)具有立體選擇性的酶的一種途徑是降低它們的活性位點(diǎn)體積，使底物只能以特定的方向結(jié)合。亦有研究表明，利用MD模擬進(jìn)行酶結(jié)構(gòu)靈活性分析可用于識(shí)別底物結(jié)合口袋附近的關(guān)鍵環(huán)結(jié)構(gòu)[49]。通過(guò)調(diào)節(jié)這些環(huán)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象動(dòng)力學(xué)也可以實(shí)現(xiàn)酶分子對(duì)映選擇性的逆轉(zhuǎn)[50]。Janssen和Baker通過(guò)計(jì)算與MD模擬相結(jié)合的手段設(shè)計(jì)了環(huán)氧化物水解酶的活性位點(diǎn)，成功地獲得對(duì)映選擇性增強(qiáng)的有益突變[12]。針對(duì)環(huán)氧水解酶EH1和EH2在催化對(duì)硝基苯乙烯類(lèi)氧化物的水解過(guò)程中立體選擇性不夠完善，造成環(huán)氧對(duì)映體匯聚反應(yīng)沒(méi)有達(dá)到100%的理論收率的問(wèn)題。郁惠蕾等在解析EH2高分辨的酶分子及其與底物復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，借助于計(jì)算機(jī)模擬準(zhǔn)確鎖定了酶分子中控制底物結(jié)合構(gòu)象的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)。通過(guò)建立了一個(gè)小巧型突變體酶庫(kù)成功靶向到調(diào)控酶催化不同對(duì)映體區(qū)域選擇性反應(yīng)的關(guān)鍵位點(diǎn)。并且發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的調(diào)控作用具有一定程度的普適性，這為同源環(huán)氧水解酶的區(qū)域選擇性改造提供了新思路和新方向(圖3)[51]。

圖3 綠豆環(huán)氧水解酶區(qū)域選擇性改造后實(shí)現(xiàn)近乎完美的對(duì)映匯聚[51]

1.4 提高酶的熱穩(wěn)定性

工業(yè)過(guò)程所需的酶催化劑需要承受在其自然環(huán)境中通常不會(huì)遇到的反應(yīng)條件，例如高溫、極端pH、高鹽、高底物濃度、存在有機(jī)溶劑等。酶的穩(wěn)定性依賴于通過(guò)一定的分子內(nèi)相互作用使其能維持特定功能結(jié)構(gòu)。提高蛋白質(zhì)的內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性可以提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性、溶劑耐受性等。

B-FIT方法針對(duì)蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)中B因子較大的靈活氨基酸殘基，通過(guò)穩(wěn)定這些靈活的氨基酸來(lái)穩(wěn)定整個(gè)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。利用B-FIT方法，Reetz等獲得了來(lái)自枯草芽孢桿菌的脂肪酶A (LipA)的突變體，其解鏈溫度m增加了45 ℃，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定化提高與整個(gè)蛋白分子上增加的氫鍵網(wǎng)絡(luò)以及新的帶電氨基酸殘基相關(guān)[52]。Bommarius將基于結(jié)構(gòu)的共義性分析方法和B-FIT方法結(jié)合起來(lái)，成功地將來(lái)源于野油菜黃單胞菌的氨基酯水解酶的m值提高了8 ℃，d,obs值提高了13倍[53]。FRESCO方法將可能的單點(diǎn)突變庫(kù)減少到1 634個(gè)，對(duì)突變庫(kù)進(jìn)行人工檢查后，將突變減少到64個(gè)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)篩選。最終獲得紅色紅球菌的檸檬烯環(huán)氧化物水解酶的最優(yōu)突變體在35 ℃時(shí)m為85 ℃，同時(shí)動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性增加了250倍[13]。許建和課題組利用突變作用的加和性和協(xié)同性同時(shí)提高了羰基還原酶CR的熱穩(wěn)定性和催化活性。突變殘基主要位于靠近活性中心的靈活loop環(huán)上，熱穩(wěn)定性提高的突變體中引入了新的氫鍵，并提高了蛋白內(nèi)部的疏水作用力，從而增強(qiáng)了活性口袋周?chē)`活loop環(huán)的剛性。分子對(duì)接結(jié)果表明，活性提高的突變點(diǎn)雖然與底物沒(méi)有直接接觸，卻導(dǎo)致酶和底物之間氫鍵作用的增加，從而提高了酶對(duì)底物的親和性，穩(wěn)定了蛋白與底物結(jié)合的作用力。此外，熱穩(wěn)定性提高的突變和活性提高的突變位于兩個(gè)獨(dú)立的區(qū)域，證實(shí)突變作用的加和性為熱穩(wěn)定性和活性的同時(shí)提高提供了可能。最終作者成功將反應(yīng)放大，實(shí)現(xiàn)了阿托伐他汀前體6-氰基-3,5-二羥基己酸叔丁酯的規(guī)模生物制備(圖4)[54]。

通過(guò)定向進(jìn)化發(fā)現(xiàn)的熱穩(wěn)定的酶也具有增加的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性，如果糖二磷酸醛縮酶[55]、枯草芽孢桿菌脂肪酶A[56]、葡萄糖脫氫酶等[57]。繪制T50與C50的關(guān)系圖發(fā)現(xiàn)溫度穩(wěn)定性和有機(jī)溶劑穩(wěn)定性之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性[58]。方柏山等利用基因工程手段構(gòu)建了甲酸脫氫酶超分子自組裝體系，組裝的功能片段和融合蛋白形成三維層狀結(jié)構(gòu)。將其用于輔酶再生系統(tǒng)時(shí)表現(xiàn)出比未組裝結(jié)構(gòu)更高的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和NAD (H)再循環(huán)效率。利用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究超分子組裝的構(gòu)型演變，發(fā)現(xiàn)FDH的C末端的結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)聚合物的形成中起著重要作用[59]。另外一方面，熱容變化是解釋酶催化反應(yīng)速率的溫度依賴性的重要參數(shù)，對(duì)酶動(dòng)力學(xué)、熱適應(yīng)性和進(jìn)化等方面研究都具有重要意義。Arcus等結(jié)合計(jì)算和實(shí)驗(yàn)手段對(duì)類(lèi)固醇異構(gòu)酶二聚體和α-葡糖苷酶分別進(jìn)行熱容的計(jì)算分析，研究發(fā)現(xiàn)活性位點(diǎn)周?chē)鷏oop環(huán)結(jié)構(gòu)的固定、酶的能量波動(dòng)的變化以及遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的遠(yuǎn)端區(qū)域?qū)崛葑兓季哂兄匾挠绊?。相關(guān)研究證實(shí)可以通過(guò)原子水平的分子動(dòng)力學(xué)模擬預(yù)測(cè)催化反應(yīng)的活化熱容變化，為理性改造酶的最適反應(yīng)溫度提供可行的思路[60]。

圖4 羰基還原酶LbCR的熱穩(wěn)定性和催化活性同時(shí)提高[54]

1.5 輔酶依賴性反轉(zhuǎn)

還原酶的催化需要輔酶NADPH的參與，然而額外添加昂貴的輔酶NADPH，會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)成本過(guò)高，限制了工業(yè)化應(yīng)用。因此，基于將昂貴NADPH替換成相對(duì)廉價(jià)NADH的目的，研究者們?cè)噲D通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段改造還原酶的輔酶依賴性。

目前有多種方法被成功用于反轉(zhuǎn)還原酶的輔因子特異性，如：使用結(jié)構(gòu)信息或使用不同輔酶依賴性的酶同源序列進(jìn)行多序列比對(duì)，來(lái)尋找有益突變。Turner課題組基于結(jié)構(gòu)和序列比對(duì)的方法，在ADH中成功構(gòu)建了突變體G198D可以將輔助因子由NADP+到NAD+約1 353倍的反轉(zhuǎn)。最終利用NADH依賴型的最優(yōu)突變體成功實(shí)現(xiàn)了將外消旋仲醇高效地轉(zhuǎn)化生成手性胺[61]。針對(duì)輔酶依賴性反轉(zhuǎn)的改造通常會(huì)導(dǎo)致酶的催化效率整體下降。2018年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)獲得者Arnold團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種計(jì)算工具(CSR-SALAD) 來(lái)尋找輔酶結(jié)合關(guān)鍵位點(diǎn)，可用于簡(jiǎn)化酶的輔酶NAD+或NADP+依賴性逆轉(zhuǎn)的過(guò)程，該策略同時(shí)可以設(shè)計(jì)出恢復(fù)催化活力的半理性突變庫(kù)。該方法被成功用于4種結(jié)構(gòu)不同的NADP依賴性的酶(乙醛酸還原酶、肉桂醇脫氫酶、木糖還原酶和含鐵醇脫氫酶) 的輔酶特異性反轉(zhuǎn)，輔酶依賴性的反轉(zhuǎn)變化達(dá)33?4 900倍，證實(shí)了該策略的有效性[62]。

針對(duì)改變羥甾脫氫酶7-HSDHs輔酶偏好性的研究，李春秀等提出了一種輔酶特異性反轉(zhuǎn)-小巧突變庫(kù)的設(shè)計(jì)策略(CSR-SaSLiD)，理性地設(shè)計(jì)了一個(gè)包含5個(gè)突變子的小巧定點(diǎn)突變庫(kù)，快速地篩選到輔酶偏好性反轉(zhuǎn)且活性較高的突變體。相較于母本，突變體實(shí)現(xiàn)了輔酶偏好性由NADPH到NADH約953 000倍的反轉(zhuǎn)，活性提高223倍。最后，作者利用分子動(dòng)力學(xué)模擬揭示了輔酶偏好性反轉(zhuǎn)及活性提高的分子機(jī)制，并將CSR-SaSLiD策略成功應(yīng)用于另外兩個(gè)7-HSDHs的輔酶偏好性反轉(zhuǎn)和活性提升，表明CSR-SaSLiD是一種有效的改造策略(圖5)[63]。

2 新的研究方法

2.1 基于定量構(gòu)效關(guān)系的研究

定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR) 方法被廣泛應(yīng)用于藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域，目前利用QSAR研究底物結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的方法已經(jīng)逐漸延伸到生物催化領(lǐng)域，成為新的研究熱點(diǎn)。酶催化不同底物時(shí)將具有不同的催化活力，可以利用定量構(gòu)效關(guān)系方法對(duì)酶催化底物譜進(jìn)行分析，構(gòu)建合理的酶催化活力的定量構(gòu)效關(guān)系模型，揭示不同底物結(jié)構(gòu)與相應(yīng)催化活力的關(guān)系。

Tomic′課題組提出根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用3D-QSAR方法構(gòu)建描述符，實(shí)現(xiàn)了底物專(zhuān)一性常數(shù)cat/m值的定量預(yù)測(cè)，并利用這一方法成功實(shí)現(xiàn)了來(lái)源于洋蔥伯克霍爾德菌酯酶立體選擇性的量化預(yù)測(cè)[64]。Paier課題組構(gòu)建3D-QSAR模型分析的環(huán)氧化物酶催化反應(yīng)的立體選擇性，分別采用了CoMFA和 CoMSIA兩種統(tǒng)計(jì)算法，兩種方法得到的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示它們都具有較好的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性[65]。Braiuca小組利用實(shí)驗(yàn)測(cè)得的cat/m數(shù)據(jù)構(gòu)建回歸模型，模型能夠準(zhǔn)確快速地預(yù)測(cè)出青霉素酰胺酶的選擇性[66]。于洪巍課題組利用分子對(duì)接和定量構(gòu)效關(guān)系相結(jié)合的方法，構(gòu)建了具有較高準(zhǔn)確性的南極假絲酵母脂肪酶B (CALB) 立體選擇性的量化預(yù)測(cè)模型，分別考慮了酰基供體以及5個(gè)因素(立體、靜電、疏水、氫鍵供體和受體) 對(duì)模型的影響，證實(shí)了?；w的重要性[67]。郁惠蕾等采用3D-QSAR方法構(gòu)件了羰基還原酶YtbE的定量構(gòu)效關(guān)系模型。通過(guò)分子力場(chǎng)輪廓圖考察了底物分子取代基團(tuán)對(duì)活力的影響，證實(shí)靜電作用和疏水作用在分子力場(chǎng)中起到重要作用。進(jìn)一步地利用該模型對(duì)ZINC15小分子數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行虛擬篩選，最終成功地篩選到了具有催化活力的化合物，拓展了酶的底物譜[68]。

圖5 CSR-SaSLiD策略改變羥甾脫氫酶7β-HSDHs的輔酶偏好性[63]

2.2 基于氨基酸殘基網(wǎng)絡(luò)的研究

氨基酸殘基網(wǎng)絡(luò)理論將每個(gè)氨基酸定義為一個(gè)結(jié)點(diǎn)、殘基間的互相關(guān)系數(shù)為邊。結(jié)合網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)、氨基酸相互作用、底物結(jié)合能等分析，對(duì)酶分子整體結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，可以實(shí)現(xiàn)酶分子結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的解析。該方法已被成功用于疾病相關(guān)蛋白的特異性識(shí)別、蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性等方面的研究。

蒲雪梅等發(fā)現(xiàn)單點(diǎn)突變導(dǎo)致β2AR蛋白結(jié)構(gòu)中部分螺旋、loop區(qū)及整體結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)相關(guān)性的強(qiáng)弱發(fā)生變化，同時(shí)也改變了底物結(jié)合口袋和信號(hào)傳導(dǎo)通路的密度，特別是催化氨基酸所在的通路，進(jìn)而影響藥物作用[69]。Osuna課題組對(duì)一逆醛縮酶活性位點(diǎn)附近和遠(yuǎn)離活性中心的氨基酸突變所引起的構(gòu)象變化進(jìn)行了系統(tǒng)分析和評(píng)估。研究表明，酶的構(gòu)象狀態(tài)在不同突變體中發(fā)生了顯著改變，一些較遠(yuǎn)距離的氨基酸突變會(huì)顯著影響酶的催化活力[70]。利用氨基酸殘基相互作用網(wǎng)絡(luò)分析酯酶Est1母本和突變體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。許建和課題組研究發(fā)現(xiàn)突變體中形成更多的氫鍵、范德華、π-π堆積等相互作用，氨基酸間相互作用的增加穩(wěn)定了酶的結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性?；跈C(jī)理分析，結(jié)合氨基酸保守性、氨基酸殘基相關(guān)性和氨基酸間相互作用，對(duì)酶的活力、選擇性、熱穩(wěn)定性進(jìn)行了一系列的理性設(shè)計(jì)和改造研究[71]。付偉課題組采用動(dòng)態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析方法解析了纖維素酶Cel12A突變體熱穩(wěn)定顯著提高的結(jié)構(gòu)機(jī)理，并找到與突變點(diǎn)具有強(qiáng)相關(guān)性的關(guān)鍵氨基酸殘基，提出了酶熱穩(wěn)定性改造的新策略[72]。

2.3 基于機(jī)器學(xué)習(xí)的方法

機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)可以用來(lái)識(shí)別所有特征變量中的關(guān)鍵特征量，并構(gòu)建預(yù)測(cè)模型精確地預(yù)測(cè)目標(biāo)參數(shù)。研究結(jié)果表明機(jī)器學(xué)習(xí)方法能顯著提高蛋白質(zhì)工程中的篩選通量及有益突變的序列空間的質(zhì)量和多樣性[73]。

Umetsu等提出將分子進(jìn)化與機(jī)器學(xué)習(xí)相結(jié)合的蛋白質(zhì)改造方法。利用第一輪的突變文庫(kù)構(gòu)建機(jī)器學(xué)習(xí)模型來(lái)指導(dǎo)第二輪的突變。該方法被成功用于綠色熒光蛋白的改造[74]。Arnold課題組利用已發(fā)表的GB1結(jié)合蛋白的大量數(shù)據(jù)分析，證實(shí)基于機(jī)器學(xué)習(xí)的定性進(jìn)化方法可以比其他方法發(fā)現(xiàn)更優(yōu)的突變體。利用這一策略，作者成功地對(duì)雙加氧酶NOD催化新型卡賓Si-H插入反應(yīng)生成兩種對(duì)映體產(chǎn)物進(jìn)行改造，僅通過(guò)兩輪突變就找到了優(yōu)勢(shì)突變體[75]。Tidor等提出了將機(jī)器學(xué)習(xí)與路徑采樣相結(jié)合的新策略來(lái)理性尋找影響催化性能的重要區(qū)域，并成功地用于酮酸還原異構(gòu)酶KARI的研究。作者利用計(jì)算統(tǒng)計(jì)方法，對(duì)過(guò)渡態(tài)采樣來(lái)模擬反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)，并將其與機(jī)器學(xué)習(xí)方法相結(jié)合。確定了與反應(yīng)性能相關(guān)的重要特征并構(gòu)建了反應(yīng)軌跡的預(yù)測(cè)模型。研究發(fā)現(xiàn)，利用單一的描述符就可以準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)催化活力，準(zhǔn)確度超過(guò)85%。除此以外，研究發(fā)現(xiàn)酶-底物復(fù)合物中會(huì)存在一個(gè)重要區(qū)域，當(dāng)這個(gè)區(qū)域的構(gòu)象增多時(shí)反應(yīng)性能大幅增加。相關(guān)研究不僅證實(shí)了在酶-底物復(fù)合物的構(gòu)象空間中存在能促進(jìn)反應(yīng)性能的區(qū)域，同時(shí)開(kāi)發(fā)了用于鑒定和驗(yàn)證這些特別區(qū)域的方法，這將大大提高酶分子設(shè)計(jì)改造的速率[76]。

2.4 從頭設(shè)計(jì)及人工智能的方法

從頭設(shè)計(jì)的思路是針對(duì)一些天然酶無(wú)法催化的化學(xué)反應(yīng)，設(shè)計(jì)全新的蛋白質(zhì)，使之具有特定的空間結(jié)構(gòu)和預(yù)期的功能。從頭設(shè)計(jì)的原則是通過(guò)計(jì)算獲得具有特定空間結(jié)構(gòu)中最低自由能狀態(tài)下的氨基酸序列。

美國(guó)華盛頓大學(xué)David Baker團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的Rosetta算法平臺(tái)能夠從期望的功能反向推測(cè)出合適的結(jié)構(gòu)，再計(jì)算出最合理的氨基酸序列。利用這一方法，Baker課題組已成功地實(shí)現(xiàn)從頭創(chuàng)制逆-醛縮酶[77]以及催化Kemp消除反應(yīng)[78]和Diels-Alder反應(yīng)的酶[79]。近期該課題組從頭設(shè)計(jì)了熒光蛋白β桶結(jié)構(gòu)[80]、自組裝螺旋狀蛋白纖維[81]、IL2和IL15受體激動(dòng)蛋白[82]、抗癌蛋白Neo-2/15[83]、pH環(huán)境變化響應(yīng)蛋白[84]、通過(guò)誘導(dǎo)構(gòu)象改變來(lái)調(diào)節(jié)功能的開(kāi)關(guān)蛋白質(zhì)[85]等多個(gè)復(fù)雜的功能蛋白。利用從頭設(shè)計(jì)獲得全新的蛋白質(zhì)為合成生物學(xué)和細(xì)胞工程的研究提供了新穎的催化元件。

除此之外，谷歌公司DeepMind推出新的人工智能項(xiàng)目AlphaFold，利用經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的深度神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，可以從基因序列出發(fā)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)和三維結(jié)構(gòu)[86]?；谏疃葘W(xué)習(xí)的AlphaFold大大縮短了傳統(tǒng)計(jì)算機(jī)模擬計(jì)算蛋白質(zhì)折疊的時(shí)間。隨著深度學(xué)習(xí)和人工智能技術(shù)的進(jìn)步，這些技術(shù)未來(lái)可用于更高效的新酶發(fā)掘、更深入的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系分析及更快速的新藥虛擬篩選。

3 總結(jié)

越來(lái)越多的計(jì)算分析方法被用于酶的催化反應(yīng)機(jī)理解析，基于酶分子的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的深入解析，對(duì)結(jié)構(gòu)中特定區(qū)域進(jìn)行理性重構(gòu)，可以實(shí)現(xiàn)高效的定向設(shè)計(jì)與改造，推動(dòng)酶的工業(yè)應(yīng)用。理性設(shè)計(jì)方法用計(jì)算替代部分實(shí)驗(yàn)室工作，降低了實(shí)驗(yàn)的成本和工作量，目的性更強(qiáng)，更加迅速有效。

針對(duì)計(jì)算本身具有的局限性，發(fā)展更快、更高效、更準(zhǔn)確的計(jì)算方法是未來(lái)的技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)。合理地應(yīng)用這些計(jì)算方法，將有助于提高工業(yè)酶的開(kāi)發(fā)效率，推動(dòng)生物制造產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

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Computational analysis of structure-activity relationship of industrial enzymes

Qi Chen, Chunxiu Li, Gaowei Zheng, Huilei Yu, and Jianhe Xu

School of Biotechnology, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China

Industrial enzymes have become the core "chip" for bio-manufacturing technology. Design and development of novel and efficient enzymes is the key to the development of industrial biotechnology. The scientific basis for the innovative design of industrial catalysts is an in-depth analysis of the structure-activity relationship between enzymes and substrates, as well as their regulatory mechanisms. With the development of bioinformatics and computational technology, the catalytic mechanism of the enzyme can be solved by various calculation methods. Subsequently, the specific regions of the structure can be rationally reconstructed to improve the catalytic performance, which will further promote the industrial application of the target enzyme. Computational simulation and rational design based on the analysis of the structure-activity relationship have become the crucial technology for the preparation of high-efficiency industrial enzymes.This review provides a brief introduction and discussion on various calculation methods and design strategies as well as future trends.

industrial protein, enzyme, structure-activity relationship, molecular simulation, rational design

10.13345/j.cjb.190329

許建和 教授、博士生導(dǎo)師，華東理工大學(xué)長(zhǎng)江學(xué)者特聘教授。2006–2017年擔(dān)任生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任，現(xiàn)任上海生物制造產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心主任。長(zhǎng)期從事生物催化、酶工程及合成生物技術(shù)研究。在、、、、等期刊發(fā)表SCI論文300余篇。授權(quán)中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利50項(xiàng)、美國(guó)發(fā)明專(zhuān)利1項(xiàng)。國(guó)際期刊主編。榮獲全國(guó)優(yōu)秀教師、談家楨生命科學(xué)創(chuàng)新獎(jiǎng)、杜邦杰能科中國(guó)酶工程杰出貢獻(xiàn)獎(jiǎng)、2018年上海市技術(shù)發(fā)明一等獎(jiǎng) (第一完成人)。

陳琦, 李春秀, 鄭高偉, 等. 工業(yè)蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的計(jì)算生物學(xué)解析. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(10): 1829–1842.

ChenQ, Li CX, Zheng GW, et al. Computational analysis of structure-activity relationship of industrial enzymes. Chin J Biotech, 2019, 35(10): 1829–1842.

July 23, 2019;

September 16, 2019

Supported by: Natural Science Foundation of Shanghai China (No. 19ZR1472900), National Natural Science Foundation of China (Nos. 31971380, 21536004, 21672063, 21776085).

Jianhe Xu.Tel/Fax: +86-21-54250840; E-mail: jianhexu@ecust.edu.cn

上海市自然科學(xué)基金 (No. 19ZR1472900)，國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31971380, 21536004, 21672063, 21776085) 資助。

(本文責(zé)編 陳宏宇)