李春筱，劉婷婷，劉玉珊，劉 麗

(昆明理工大學生命科學與技術學院，云南 昆明 650500)

噬藻體(Cyanophage)是一類能夠特異性感染藍藻的雙鏈DNA病毒類群，廣泛存在于海洋、淡水等自然環(huán)境中，是水生微生物群落的重要組成部分，能在不同時間和空間范圍內感染藍藻，具有豐富的遺傳多樣性[1]。作為水生態(tài)系統(tǒng)中的重要活躍因子，噬藻體與宿主藍藻的新陳代謝和生命循環(huán)密切相關，具有重要的生態(tài)地位；在調控藍藻種群結構及多樣性、水體初級生產力、生物地球化學循環(huán)以及介導微生物之間水平基因轉移等方面起到了重要的作用[2-4]。

噬藻體是高度差異性的病毒類群，尚未發(fā)現其基因中存在類似原核生物16SrDNA或真核生物18SrDNA的共有保守序列，因而缺乏廣泛通用的遺傳標記基因。基于噬藻體的分離純化及全基因組測序研究發(fā)現部分種的噬藻體中存在個別共有保守基因，如g20基因[5-6]、psbA光合基因[7]和pol基因[8]等。g20基因編碼肌尾噬藻體衣殼組裝蛋白主要存在于肌尾科噬藻體中。pol基因編碼DNA聚合酶主要存在于短尾科噬藻體。psbA基因是編碼光合系統(tǒng)Ⅱ反應中心D1蛋白的基因，在肌尾科和短尾科噬藻體均有發(fā)現[9]。許多噬藻體中都包含編碼光合系統(tǒng)Ⅱ中D1蛋白的psbA基因，88%的感染海洋聚球藻和原綠球藻的噬藻體都含有psbA基因[10]，全球海洋表層水中60%的psbA基因來源于病毒[11]。SULLIVAN等[12]根據光合基因的保守序列設計引物，對噬藻體的遺傳多樣性進行了研究，發(fā)現噬藻體的核酸序列具有相當豐富的多樣性。作為噬藻體的一種新型靶標基因，光合作用基因psbA不僅可用于揭示噬藻體的遺傳多樣性，還可利用它探索噬藻體與其宿主藍藻之間的關系[2]。

目前，國內對噬藻體遺傳多樣性的研究主要集中在中國近海海域[13]、東北稻田水體[14]、武漢東湖[15]等，有關淡水湖泊噬藻體多樣性的相關報道仍十分有限。該研究主要是運用以PCR技術為核心的分子生物學方法對云南高原富營養(yǎng)化湖泊異龍湖春季和秋季水樣噬藻體psbA基因的多樣性進行研究，分析異龍湖水樣中噬藻體的遺傳多樣性，為噬藻體基因多樣性研究提供依據，并豐富富營養(yǎng)化湖泊微型生態(tài)系統(tǒng)的理論體系。

1 材料與方法

1.1 水樣的采集及預處理

異龍湖水樣采集于2015年4月(春季)與2015年9月(秋季)。參照HJ 495—2009《水質 采樣方案設計技術規(guī)定》，使用采水器采集表層水樣(距水體表面約0.5 m處)和底層水樣(距水體表面約2 m處)各1.5 L，現場測定水溫、pH值和透明度。采集水樣后立即帶回實驗室，將水樣混合后經0.75 μm孔徑濾紙、0.45和0.22 μm孔徑微孔濾膜〔上海市新亞凈化器件廠微孔濾膜(滬Q/YY8-1-88)〕過濾，將過濾后的水樣用6萬分子量的中空纖維膜組件進行超濃縮，濃縮比例為200∶1，濃縮液分裝后于-20 ℃ 冰箱避光保存待用。

1.2 水樣中噬藻體基因組提取及PCR擴增

1.2.1水樣中游離藍藻DNA的去除

為了去除濃縮水樣中游離的藍藻DNA片段，采用DNaseI處理濃縮水樣，并進一步用藍藻16S-23SrDNA ITS基因[16-18]進行PCR擴增，若為陰性結果，則去除完全，陽性則要使用DNaseI進行再處理。

ITS基因由引物[19]ITS-F(5′-TGTACACACCGCCCGTCACACCA-3′)和ITS-R(5′-GTGGATAC-CTAGGCACACAGAG-3′)進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×Premix Taq (TAKARA)10 μL，F-Primer(10 μM) 1 μL，R-Primer (10 μM) 1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL，總體積20 μL。陰性對照無菌ddH2O為模板。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.2.2水樣中病毒基因組提取及psbA基因的PCR擴增

取經處理的水樣，使用病毒基因組提取試劑盒Viral DNA Kit(OMEGA)提取噬藻體DNA。從GenBank中下載噬藻體psbA基因序列進行BALST比對，采用Primer 5.0和Oligo 6分析評價，針對psbA基因設計巢式引物：psbA-F1(5′-GARTGGYTNTAYAAYGGNG-3′)和psbA-R1(5′-CCRTTNAGGTTRAANGCCA-3′)，psbA-F2(5′-CAYTTCTAYCCNATYTGG-3′)和psbA-R2(5′-TCYN GACTGGTTGAAGTTGA-3′)進行PCR擴增。PCR擴增體系：2×Premix Taq (TaKaRa) 10 μL，F-Primer(10 μM) 1 μL，R-Primer (10 μM) 1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL，總體積20 μL。陰性對照無菌ddH2O為模板。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；退火30 s(psbA147 ℃，psbA250 ℃)；72 ℃ 延伸90 s；35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

1.3 膠回收、TA克隆及序列測定

從w=2.0%的凝膠上切取580 bp左右的PCR產物，用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN)進行膠純化，目的DNA片段連接至pEASY-T1 Cloning Vector，轉化大腸桿菌JM109感受態(tài)細胞。無菌條件下挑取Amp+的LB平板上50個樣品克隆，再用通用引物M13F、M13R對菌液進行陽性重組子的菌落PCR快速鑒定，退火溫度55 ℃，循環(huán)數30。選陽性克隆的培養(yǎng)過夜菌液，送至測序公司(昆明碩擎生物科技)進行一代測序。

1.4 psbA基因的系統(tǒng)進化分析

待測序完成后，對異龍湖水域水樣中psbA環(huán)境序列的單克隆序列分別用Chromas、BioEdit(Ver 7.0.0)進行序列校正、編輯。使用BLAST將得到的序列與數據庫中收錄的噬藻體psbA基因進行初步的比對分型，用MEGA 6.0軟件繪制系統(tǒng)進化樹，根據系統(tǒng)進化樹來分析異龍湖中噬藻體的遺傳多樣性。噬藻體序列標注為“YL年月S+第幾條序列”。該研究獲得的psbA序列已提交至NCBI網站，其序列號為MH822090-MH822104。

2 結果與分析

2.1 異龍湖水樣噬藻體psbA基因的PCR擴增及克隆測序

將采集的異龍湖水樣經0.75 μm孔徑濾紙，0.45和0.22 μm微孔濾膜過濾和超濃縮后，DNase處理去除濃縮水樣中藍藻DNA，并用藍藻16S-23SrDNA ITS基因進行PCR擴增，從結果為陰性的樣品中提取噬藻體DNA；PCR擴增psbA基因于580 bp位置有明顯亮帶(圖1)，經膠回收獲取目的基因，樣品經克隆篩選，將陽性克隆送測序公司測序，共獲得15條不同的psbA基因，其中4月(春季)水樣中獲得3條，9月(秋季)水樣中獲得12條psbA環(huán)境序列。

圖1 異龍湖水樣中噬藻體psbA基因的PCR擴增及陽性克隆檢測Fig.1 PCR amplification and positive clone of psbA gene from cyanophage in Yilong Lake

2.2 異龍湖水樣中psbA基因親緣序列分析

異龍湖水樣中擴增出的psbA基因長度為580 bp(引物除外)，可翻譯成186個氨基酸殘基。對獲得的psbA基因序列進行BLAST比對后，剔除部分非噬藻體源的psbA基因序列。該研究從異龍湖水樣中獲得15條psbA基因環(huán)境序列，經NCBI網站上基于氨基酸水平進行BLAST比對發(fā)現(表1)：有4條psbA基因序列(YL04S-1～3和YL09S-6)與哈薩克斯坦淡水中噬藻體psbA序列(KZ5-52073/3)相似性最高，相似率為99%；有10條psbA基因序列(YL09S-1～5，YL09S-7～8，YL09S-10～12)與中國東北稻田水體克隆(PW-DA-II-21 ，PW-MDJ-II-4，PW-DA-II-35)具有最高的相似性，相似率在98%～99%之間；僅有1條psbA基因序列(YL09S-9)與日本稻田克隆(NoF6)具有最高的相似性，相似率為98%。

表1 異龍湖水體psbA基因與NCBI數據庫在氨基酸水平的同源性比較

Table 1 Comparison of homology at amino acid level betweenpsbAgene and NCBI database in Yilong Lake

克隆名稱序列比對最近親緣序列序列編號同源性/%序列來源序列提交者YL04S-1185/186KZ5-52073/3AQT1911399哈薩克斯坦淡水ALEXYUK等,2016YL04S-2185/186KZ5-52073/3AQT1911399哈薩克斯坦淡水ALEXYUK等,2016YL04S-3185/186KZ5-52073/3AQT1911399哈薩克斯坦淡水ALEXYUK等,2016YL09S-1184/186PW-DA-II-21AJO7061299中國稻田水WANG等,2015YL09S-2185/186PW-DA-II-21AJO7061299中國稻田水WANG等,2015YL09S-3185/186PW-DA-II-21AJO7061299中國稻田水WANG等,2015YL09S-4185/186PW-DA-II-21AJO7061299中國稻田水WANG等,2015YL09S-5185/186PW-DA-II-21AJO7061299中國稻田水WANG等,2015YL09S-6185/186KZ5-52073/3AQT1911399哈薩克斯坦淡水ALEXYUK等,2016YL09S-7185/186PW-DA-II-21AJO7061299中國稻田水WANG等,2015YL09S-8184/186PW-DA-II-21AJO7061299中國稻田水WANG等,2015YL09S-9182/186NoF6BAH2318698日本稻田水WANG等,2009YL09S-10183/186PW-MDJ-II-4AJO7065198中國稻田水WANG等,2015YL09S-11183/186PW-DA-II-35AJO7062698中國稻田水WANG等,2015YL09S-12184/186PW-DA-II-21AJO7061298中國稻田水WANG等,2015

2.3 異龍湖水樣psbA基因系統(tǒng)進化樹分析

psbA基因存在光合作用生物中，因此區(qū)分psbA基因是否為病毒來源至關重要。SHARON等[20]通過統(tǒng)計分析發(fā)現，psbA基因編碼D1蛋白的氨基酸序列模型R/KETTXXXSQ/H中可變的三肽元件XXX的變化可以反映出不同噬藻體所處的分類地位，其中EQE、ENE、EEV、EEE、EDV、EVE、EQV和EDE型等幾種三肽元件更易來自于病毒D1亞基，而在宿主藍藻中極少發(fā)現。SULLIVAN等[12]發(fā)現，聚球藻噬藻體的基因組序列中鳥嘌呤和胞嘧啶所占的比例(GC含量)比聚球藻的GC含量少10%左右，即噬藻體GC含量低于宿主藻的GC含量。

從異龍湖濃縮水樣中獲得的15條psbA基因環(huán)境系列，構建進化樹(圖2)，可將psbA基因序列劃分成3簇，分別命名為ClusterⅠ～Cluster Ⅲ，對psbA基因序列的GC含量和編碼D1蛋白的氨基酸序列中三肽元件R/KETTXXXSQ/H的變化進行分析發(fā)現，ClusterⅠ中GC含量為47.9%～50.0%，序列中三肽元件全部為EEV型，ClusterⅠ中包括的10條序列為病毒來源，即來源于噬藻體；Cluster Ⅱ中只含1條序列，GC含量為48.8%，序列中三肽元件為ETE型；Cluster Ⅲ中GC含量為44.5%～44.6%，4條序列中三肽元件全部為ETE型。研究發(fā)現，在聚球藻菌株及感染聚球藻的肌尾和短尾科噬藻體中均存在三肽元件ETE型[8]，結合水樣處理方法、GC含量及序列的系統(tǒng)進化位置及氨基酸同源性比較，推測ClusterⅡ和Cluster Ⅲ的psbA基因來自于噬藻體。因此，該研究獲得的15條psbA基因序列均來自于噬藻體。

圖2 異龍湖噬藻體psbA序列進化關系、GC含量及D1蛋白氨基酸三肽元件模型Fig.2 Phylogenetic relationship, GC content and the amino acid tripletsequences from D1 protein motifs of cyanophage psbA gene in Yilong Lake

將從異龍湖水樣中獲得的噬藻體psbA序列與具有代表性的藍藻、綠藻、噬藻體分離株及噬藻體psbA環(huán)境序列等參考序列在核苷酸水平構建系統(tǒng)進化樹。如圖3所示，所有的序列在進化樹結構上可將其劃分為10個進化簇(Cluster A～Cluster J)。該研究獲得的15條異龍湖噬藻體psbA序列全部分布在Cluster A和C中。其中，Cluster A包括來自中國東北稻田[21]和日本稻田水體psbA序列[22]和該研究得到的11條異龍湖序列；Cluster B主要來自海洋[23]的噬藻體分離株；Cluster C單獨成簇，包括該研究得到的4條異龍湖序列；Cluster D主要來自于北冰洋[24]和海洋原綠球藻(Prochlorococcus)及其噬藻體類群；Cluster E和F主要來自于日本稻田水體及奧杜藻屬(Odontellarhomboides)的噬藻體psbA序列類群[25]；Cluster G主要來自于淡水伊利湖的噬藻體類群[26]；Cluster H、I和J包括來自藍藻[27]、淡水湖[28]、原綠球藻、海洋聚球藻(Synechococcus)、日本稻田水體及其噬藻體分離株的psbA序列。

圖3 異龍湖與稻田生態(tài)系統(tǒng)及其他環(huán)境psbA序列構建的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Neighbor-joining phylogenetic tree showing the relationship of psbA amino acid sequence from Yilong Lake, paddy floodwater ecosystems and other environments

Cluster A的克隆來自稻田生態(tài)系統(tǒng)和該研究的11條序列，形成6個進化亞簇，分別為來自中國東北稻田水體中的psbA基因序列形成的4個進化亞簇A2、A3、A4和A6；1個來自日本稻田水體的psbA基因序列形成的進化亞簇A5；其中該研究獲得的9條異龍湖psbA基因序列形成一個進化小亞簇(YLW-1)，與中國東北稻田水體亞簇的psbA序列進化距離相近，和日本稻田水體共同形成進化亞簇A1；1條異龍湖序列YL09S-9與中國東北稻田水體psbA基因序列同處于A4亞簇；還有1條異龍湖序列YL09S-10與中國東北稻田水體psbA基因序列形成的A6進化亞簇處于同一進化亞簇。Cluster C包括該研究得到的4條異龍湖序列(YL04S-1、YL04S-2、YL04S-3和YL09S-6)，形成一個相對獨立的進化簇YLW-2，與Cluster D～J在進化距離上相隔較遠，推測為新的噬藻體psbA基因類群。

結合圖2可知，Cluster A中的異龍湖psbA基因的氨基酸序列可變的三肽元件除序列YL09S-10之外均為EEV型；且YL09S-9與其他序列進化距離較遠，所以其余9條序列聚在一簇。在Cluster C中，4條異龍湖序列氨基酸序列可變的三肽元件均為ETE型，并且單獨成簇；與Cluster D～H中所包含的海洋、稻田等psbA序列的進化距離相隔較遠。云南高原湖泊異龍湖水樣中psbA基因序列和Cluster G中其他淡水湖泊(北美洲伊利湖)中的psbA基因序列在系統(tǒng)進化樹上的進化距離表明，雖都是淡水湖，但兩者進化歷史相互獨立，僅存在有限的基因交流。此外，大部分異龍湖psbA克隆都在Cluster A中，且與中國東北稻田的psbA序列相隔較近，這表明異龍湖噬藻體psbA基因的分布狹窄，遠離其他淡水湖泊和海洋的分布，與海洋、國外淡水湖和日本稻田水體不同，與中國東北稻田的生態(tài)類群進化距離較近，進化相對獨立。從異龍湖不同季節(jié)春季和秋季采集水樣中分別獲得的3條和12條psbA基因序列，秋季水樣中psbA序列分布于Cluster A和Cluster C這2個進化簇中，春季的3條psbA基因序列分布于Cluster C中，顯示秋季噬藻體psbA基因序列的遺傳多樣性更為豐富。

3 討論與結論

在該研究中，采用光合作用基因psbA作為靶標基因，光合作用基因在噬藻體內廣泛存在且十分保守。此前的研究中曾用到g20基因，但是相對于psbA基因來說，g20基因只局限存在于肌尾病毒科噬藻體，對于短尾病毒科的噬藻體，g20無法檢測出來，因此，使用g20作為研究噬藻體遺傳多樣性的分子標記有一定的局限性。CHENARD[24]在研究淡水和海洋中噬藻體的多樣性時使用psbA基因作為分子標記的靶標基因；該研究主要參照上述文獻的實驗技術方法，選用psbA基因作為研究異龍湖噬藻體多樣性的分子標記基因，結果證明psbA基因能很好地揭示噬藻體的遺傳多樣性。

為區(qū)分環(huán)境樣品中獲得的psbA基因是噬藻體來源還是宿主來源，目前國內外相關研究中JING等[11]、SHARON等[20]均采用了CHENARD等[24]建議的方法：(1)將采集的水樣先經濾紙過濾，再分別經0.45和0.22 μm孔徑的濾膜過濾以除去藻類宿主等細胞型生物，濾液通過超濾濃縮，對濃縮液進行psbA基因的PCR擴增前，先用DNase處理以除去濃縮水樣中可能含有的游離藍藻DNA，用藍藻ITS基因序列擴增結果為陰性后，再提取濃縮水樣中的DNA；(2)基于噬藻體和宿主的psbA基因序列的GC含量分析表明，噬藻體的GC含量低于其宿主的GC含量；(3)基于編碼D1蛋白的氨基酸序列模型R/KETTXXXSQ/H中三肽元件XXX變化的區(qū)分方法表明,該方法從采集水樣的處理、已有噬藻體和宿主的psbA基因序列的GC含量以及基于編碼D1蛋白的氨基酸序列模型R/KETTXXXSQ/H中三肽元件XXX變化的統(tǒng)計分析后提出，可以區(qū)分出環(huán)境樣品中獲得的psbA基因來源。

在對高原湖泊異龍湖中噬藻體psbA基因多樣性進行研究時發(fā)現，與淡水、海洋環(huán)境比較，異龍湖噬藻體序列與來自中國東北稻田水體中噬藻體psbA基因群集更為相似，與其他淡水湖泊、海洋噬藻體psbA基因進化距離較遠；不同環(huán)境水域中噬藻體含有其獨特的類型，顯示不同自然環(huán)境中噬藻體psbA基因組成存在一定差異，psbA基因的分布與其存在的環(huán)境有很大的關系。ZHONG等[29]對法國的安納西湖和布爾熱湖的噬藻體多樣性進行分析，發(fā)現這2個湖泊中的噬藻體psbA存在著一定的差異。

CHENARD等[24]對海洋和淡水中不同地點的噬藻體psbA基因進行擴增，并通過構建噬藻體psbA基因的系統(tǒng)進化樹發(fā)現，海洋中的克隆劃分為7個類群，淡水中的克隆則為2個來自不同湖泊的獨立類群，表明海洋和淡水中的噬藻體存在著較大的差異。WANG等[22]對日本稻田水中的噬藻體多樣性進行了研究，利用PCR擴增得到37條不同的噬藻體psbA序列，發(fā)現噬藻體的遺傳多樣性與其宿主有關，其群落結構的豐富度與藍藻多樣性呈正比。荊瑞勇等[8]在對中國東北稻田水體的研究中獲得17條噬藻體psbA序列，并發(fā)現其中存在新的psbA基因類群。該研究對富營養(yǎng)化湖泊異龍湖水體的研究得到的結果與上述結果相似，并發(fā)現其中也存在新的psbA基因類群；從2015年春季(4月)及秋季(9月)采集的水樣中分別獲得3條和12條psbA環(huán)境系列及其在進化樹中的分布，顯示異龍湖秋季噬藻體psbA基因遺傳多樣性更加豐富，表明異龍湖噬藻體psbA基因序列在不同季節(jié)的水樣中存在差異；這可能與不同季節(jié)異龍湖的水溫、pH值等環(huán)境因素的變化有關。水溫是影響浮游藻類生長的重要因子，適宜的水溫有利于浮游藻類的生長[30]，即在一定的溫度范圍內，水溫升高可促進藻類光合作用。異龍湖春季(4月)水溫(20.2 ℃)較低，秋季(9月)水溫為23.9 ℃，秋季水溫較高對浮游藻類的生長更加有利，同時異龍湖秋季水樣pH值(8.6)較春季水樣(7.8)高，弱堿性的水體也適宜藻類生長，而噬藻體群落結構的豐富度與藍藻的多樣性呈正比，從而也影響了異龍湖噬藻體種類的不同，顯示異龍湖噬藻體隨季節(jié)、溫度等環(huán)境因素的變化而導致的主要基因型的差異，表明異龍湖噬藻體基因遺傳多樣性與環(huán)境水質參數有一定的關系。

綜上所述，以psbA基因為靶標基因，對高原湖泊異龍湖中噬藻體類群的分析研究表明，異龍湖水體中噬藻體psbA基因類群與海洋、其他淡水湖和日本稻田水體psbA基因類群不同，與中國東北稻田的生態(tài)類群進化距離較近，進化相對獨立，存在新的噬藻體psbA基因類群，并且在不同季節(jié)的水樣中噬藻體psbA基因序列存在差異，秋季其遺傳多樣性更加豐富。