龔嬌芳，胡娟，魯兵，何元勇，黃翠萍

437000湖北 咸寧，咸寧市第一人民醫(yī)院 呼吸內(nèi)分泌科(龔嬌芳、胡娟、魯兵、何元勇)； 437000湖北 咸寧，湖北省科技學(xué)院(黃翠萍)

肺癌為臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率均較高。隨著分子生物學(xué)研究進(jìn)展，新的腫瘤標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)為肺癌的診斷和治療提供了全新的方向[1]。

微小RNA(microRNAs, miRNA)是一類非編碼RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄水平對所調(diào)控基因發(fā)揮抑制或促進(jìn)其表達(dá)的作用。近年來，miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)研究成為熱點(diǎn)[2]。研究顯示，miRNA在不同組織中表達(dá)具有特異性，癌基因可高表達(dá)miRNA來發(fā)揮控制細(xì)胞分化和凋亡的作用，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。例如miR-372對抑癌基因LATS2的抑制作用[3]；反之，抑癌基因在腫瘤中低表達(dá)miRNA，通過抑制癌基因或控制細(xì)胞分化和凋亡的基因來阻止腫瘤的發(fā)展，如let-7對原癌基因RAS的負(fù)調(diào)控。有研究證實(shí)，miR-199a-3p與非小細(xì)胞肺癌骨轉(zhuǎn)移有明顯的相關(guān)性[4]。本研究擬探討miR-199a-3p在肺癌中的表達(dá)及臨床意義，并在細(xì)胞學(xué)水平分析miR-199a-3p對肺癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力的影響。

大量研究證明，色素框同源蛋白7(pigment box homologous protein 7,CBX7)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系，但是CBX7與腫瘤惡性程度的關(guān)系在不同的腫瘤中表現(xiàn)不同。在前列腺癌中，前列腺癌細(xì)胞與正常細(xì)胞中均高表達(dá)CBX7[5]；在膀胱癌以及甲狀腺腫瘤中，隨著腫瘤惡性程度的增加，CBX7的表達(dá)水平下調(diào)[6]。有學(xué)者在研究中證實(shí)，恢復(fù)CBX7表達(dá)能夠增加人肺癌細(xì)胞對化療藥物治療的敏感性[7]。 生物信息軟件預(yù)測提示CBX7是miR-199a-3p可能作用的靶基因， 本研究探討了CBX7與miR-199a-3p的調(diào)控關(guān)系，以及CBX7對肺癌發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及標(biāo)本來源

肺癌細(xì)胞株NCI-H460、NCL-H1975、hLAMP、HCL-H358、A549、NCL-H1299及正常人肺支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B，購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，液氮中保存。

組織標(biāo)本來源于2015年12月至2018年6月咸寧市第一人民醫(yī)院收治的非小細(xì)胞肺癌患者的肺癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣大于5cm)，共134 例。其中男性72例，女性62例，平均年齡(60.07±13.56)歲，均經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)。患者術(shù)前未接受化療或放療，均知情同意。TNM分期I期17例，II期20例，III期37例，IV期60例；腫瘤直徑>5cm者79例，≤5cm者55例。所有組織標(biāo)本采集后-80℃冰箱備用。

1.2 細(xì)胞復(fù)蘇

取出凍存于液氮罐中的肺癌細(xì)胞株NCI-H460、NCL-H1975、hLAMP、HCL-H358、A549、NCL-H1299及正常人肺支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B，迅速放入37℃預(yù)培育箱中，融化后加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)液)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

肺癌細(xì)胞株NCI-H460、NCL-H1975、hLAMP、HCL-H358、A549、NCL-H1299及正常人肺支氣管上皮細(xì)胞株BEAS-2B放入DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)(10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素-鏈霉素)。

1.4 細(xì)胞傳代

細(xì)胞融合85%左右時開始傳代。PBS沖洗3次，加入胰蛋白酶(1mL 0.25%)消化后，置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)2min，顯微鏡觀察細(xì)胞突起消失后，終止消化，離心(1 000r/min, 5min)后棄上清液，重新加入培養(yǎng)液，制備單細(xì)胞懸液，計數(shù)，按照1:3比例在原培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。重復(fù)上述步驟傳代。

1.5 qRT-PCR檢測miR-199a-3p、CBX7基因mRNA的表達(dá)

采用qRT-PCR檢測肺癌患者癌組織、癌旁組織、各肺癌細(xì)胞株及正常人肺支氣管上皮細(xì)胞株中miR-199a-3p、CBX7基因 mRNA的表達(dá)。RNA提取后合成cDNA，進(jìn)行PCR反應(yīng)(各實(shí)驗(yàn)步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行)。每個樣本重復(fù)3次。引物序列：

miR-199a-3p-F：5’-ACACCAGCTGGGTACAGT-AGTCTGCACA-3’

miR-199a-3p-R：5’-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3’

U6-F： 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’

U6-R： 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’

CBX7-F： 5’-GCGTGCGGAAGGGTAAAGT-3’

CBX7-R： 5’-GCTTGGGTTTCGGACCTCTC-3’

GAPDH-F： 5’-AGAAGGCTGGGGCTCArTTG-3’

GAPDH-R： 5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’

1.6 Western Blot檢測CBX7蛋白的表達(dá)

Western Blot檢測肺癌組織、癌旁正常組織、肺癌細(xì)胞株中CBX7蛋白的表達(dá)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染48h后，提取蛋白用于Western blot分析。40ug蛋白加入SDS-PAGE孔槽里，轉(zhuǎn)于Hybond nitrecellulose膜(GE Healhcare)。5%脫脂牛奶封閉，anti-CAMKK2(兔抗，ab96531，稀釋倍數(shù)1:150)或anti-β-actin(兔抗，sc-7210)一抗孵育。SuperSignal West PICO熒光顯像試劑盒(pierce biotechnology)檢測蛋白條帶大小。

1.7 熒光素酶報告基因法檢測miR-199a-3p 與靶基因CBX7的結(jié)合

利用microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-199a-3p與CBX7可能的作用位點(diǎn)。構(gòu)建CBX7野生型3’-UTR熒光素酶質(zhì)粒pMIR-WT和突變型質(zhì)粒pMIR-Mut。將pMIR-WT、pMIR-Mut與CBX7模擬物和negative control miRNA mimics共轉(zhuǎn)染進(jìn)A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后，去除培養(yǎng)基，PBS清洗3次，棄凈PBS，每孔加入100μL被動裂解液(passive lysis buffer,PLB)，室溫下將培養(yǎng)板置于平板搖床上，輕微晃動15分鐘。待細(xì)胞裂解后，將20μL樣本轉(zhuǎn)移至發(fā)光用96孔板上，并置于超級酶標(biāo)儀的檢測板上，設(shè)置自動進(jìn)樣器1和2分別分裝100μL的LARII和Stop&Glo試劑。測量時，使用1～2s延遲和5～10s讀數(shù)。如此循環(huán)操作直至所有樣本檢測完畢。使用酶標(biāo)儀配套軟件進(jìn)行結(jié)果分析。相對熒光素酶活性(relative luciferase activity)=螢火蟲熒光素酶活性(firefly luciferase activity)/海腎熒光素酶活性(renilla luciferase activity)。

1.8 CCK8檢測細(xì)胞增殖

用培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔1 000～10 000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積200μL。培養(yǎng)12h、24h、48h及72h后，每孔加CCK8溶液20μL。繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。2×103個細(xì)胞培植于96孔板，培養(yǎng)24、48及72h后，細(xì)胞由20μL的CCK8溶液孵育4小時。采用酶標(biāo)儀檢測495nm波長的吸光光度值(optical density,OD),判定細(xì)胞的活力，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示細(xì)胞活力的相對表達(dá)水平。

1.9 流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞周期

采用直徑為10厘米的培養(yǎng)皿收集細(xì)胞，70%乙醇固定，40攝氏度下過夜。染色前，重新收集細(xì)胞、PBS靜置，propidium Iodide(PI)溶液染色細(xì)胞，37℃下孵育15分鐘。采用流式細(xì)胞儀獲取數(shù)據(jù)(BD FACSVerse TMSystem，BD Biosciences)，軟件分析數(shù)據(jù)(BD FACSuite TM software)。采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示S期細(xì)胞比值。

1.10 Transwell實(shí)驗(yàn)

無血清培養(yǎng)基包被Transwell小室底部膜上室，風(fēng)干，加入無血清培養(yǎng)基，制備細(xì)胞懸液，終止消化，無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度后加入Transwell小室中，應(yīng)用含胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，接種后伊紅染色。

1.11 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)

收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，調(diào)整其濃度至500/mL，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2mL，即1 000個細(xì)胞/孔，培養(yǎng)板中預(yù)先加入經(jīng)37℃預(yù)溫的培養(yǎng)液，接種后輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)板，使細(xì)胞分散均勻，置于37℃，5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7天，期間適時更換新的培養(yǎng)液。經(jīng)常觀察細(xì)胞克隆出現(xiàn)日期及細(xì)胞生長情況，去上清，終止培養(yǎng)，并用1×PBS漂洗3次，每孔加甲醇1mL，搖床振蕩，固定10min，將培養(yǎng)板倒置，并鋪一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)每個格的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕视嬎愎綖椋?形成的克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，非正態(tài)分布資料組間比較采用秩和檢驗(yàn)，多組數(shù)值比較采用WILCOXON法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 qRT-PCR檢測miR-199a-3p的表達(dá)

肺癌組織中miR-199a-3p的相對表達(dá)量(1.45±0.20)顯著高于癌旁正常組織(1.00±0.01)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 不同臨床特征患者肺癌組織中miR-199a-3p的表達(dá)比較

參考文獻(xiàn)中的方法[8]，將肺癌患者中位miR-199a-3p 表達(dá)水平設(shè)為分界值，低于平均水平為低表達(dá)，等于或高于平均水平為高表達(dá)。TNM分期III+IV期miR-199a-3p高表達(dá)的比率明顯高于TNM分期I+II期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 miR-199a-3p在肺癌中的表達(dá)量與臨床特征的關(guān)系

Table 1. Relationship between MiR-199a-3p Expression in Lung Cancer and Clinical Characteristics of Patients

CharacterNMiR-199a-3pLow[n(%)]High[n(%)]χ2PGenderMale729(12.5)63(87.5)0.0460.830Female627(11.3)55(88.7)Age (years)>60638(12.7)55(87.3)0.0650.799≤60718(11.3)63(88.7)TNM stageI+II3710(27.0)27(73.0)9.1710.001III+IV976(6.2)91(93.8)Diameter of tumor >5cm799(11.4)70(88.6)0.0550.815≤5cm557(12.7)48(87.3)DifferentiationGood or moderate10112(11.9)89(88.1)0.0740.971Poor or no differentiation334(12.1)29(87.9)

2.3 肺癌組織和癌旁組織中CBX7 mRNA及蛋白的表達(dá)

qRT-PCR檢測肺癌組織中CBX7 mRNA的相對表達(dá)量(0.58±0.06)顯著低于癌旁組織(1.00±0.02)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。通過Western blot檢測肺癌組織中CBX7蛋白的表達(dá)水平比癌旁正常組織顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 Western blot檢測肺癌腫瘤組織和癌旁正常組織中CBX7蛋白的表達(dá)

Figure1.ExpressionofCBX7inLungCancerTissueandNon-TumorTissueDetectedbyWesternBlot

2.4 熒光素酶報告結(jié)果

通過生物信息軟件預(yù)測與miR-199a-3p相互作用的靶基因，發(fā)現(xiàn)CBX7的mRNA 3’UTR區(qū)域存在miR-199a-3p 可能互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，提示CBX7是miR-199a-3p可能作用的靶基因。熒光素酶報告基因分析結(jié)果如圖2，在肺癌細(xì)胞株A549中共轉(zhuǎn)染CBX7野生型3’-UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒pMIR-Wt或突變型報告基因質(zhì)粒pMIR-Mut以及miR-199a-3p mimic或miR-NC，采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-199a-3p是否能直接靶向作用于CBX7。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染pMIR-Wt和miR-199a-3p mimic時，熒光素酶活性明顯降低(P<0.01)，而共轉(zhuǎn)染pMIR-Mut和miR-199a-3p mimic時，熒光素酶活性無明顯變化，提示：CBX7的3’-UTR區(qū)域存在位點(diǎn)與miR-199a-3p互補(bǔ)結(jié)合。

2.5 qRT-PCR檢測各株肺癌細(xì)胞系中miR-199a-3p、CBX7 mRNA的表達(dá)

各肺癌細(xì)胞株中miR-199a-3p的表達(dá)量均顯著高于BEAS-2B，CBX7 mRNA的表達(dá)量均顯著低于BEAS-2B，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖3、4)。

2.6 qRT-PCR檢測A549 細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)

A549 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-199a-3p mimics后miR-199a-3p的相對表達(dá)水平(11.26±1.15)顯著高于陰性對照組(1.19±0.23)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-199a-3p inhibitor后miR-199a-3p的相對表達(dá)水平(0.32±0.05)顯著低于陰性對照組(1.22±0.13)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 熒光素酶報告分析實(shí)驗(yàn)檢測miR-199a-3p與CBX7 mRNA 的作用位點(diǎn)

Figure2.ActionSitesofMiR-199a-3pandCBX7mRNAdetectedbyLuciferaseReporterAssay(ComparedwithmiR-NCgroup, **P<0.01)

圖3 qRT-PCR各株肺癌細(xì)胞系中miR-199a-3p表達(dá)的比較

Figure3.ExpressionofMiR-199a-3pinEachLungCancerCellLineDetectedbyqRT-PCR(ComparedwithBEAS-2B, **P<0.01)

圖4 qRT-PCR各株肺癌細(xì)胞系中CBX7 mRNA的表達(dá)比較(與BEAS-2B細(xì)胞株比較，**P<0.01)

Figure4.ExpressionofCBX7mRNAinEachLungCancerCellLineDetectedbyqRT-PCR(ComparedwithBEAS-2B,**P<0.01)

2.7 miR-199a-3p轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞A549中的CBX7 mRNA及蛋白表達(dá)情況

miR-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染組CBX7的mRNA表達(dá)水平明顯低于陰性對照組[(0.61±0.08)vs(1.00±0.10)]，CBX7蛋白表達(dá)水平也顯著低于陰性對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖5)。

圖5 Western blot檢測過表達(dá)miR-199a-3p可抑制肺癌細(xì)胞A549中的CBX7蛋白表達(dá)

Figure5.WesternBlotShowingtheExpressionofCBX7inA549InhibitedbytheOverexpressionofMiR-199a-3p

2.8 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測miR-199a-3p抑制CBX7促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549增殖

CCK8實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，miR-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染組的OD值(2.45±0.30)顯著高于正常對照組(1.72±0.22)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而miR-199a-3p mimics+CBX7轉(zhuǎn)染組的OD值(1.41±0.16)顯著低于miR-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染組(2.45±0.30)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖6)。

圖6 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測miR-199a-3p抑制CBX7促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549增殖

Figure6.CCK8AssayShowingCBX7InhibitedandtheProliferationofA549PromotedbyMiR-199a-3p

2.9 流式細(xì)胞法檢測miR-199a-3p抑制CBX7促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549周期S期的聚集

將培養(yǎng)好的肺癌細(xì)胞A549分為miR-NC組、miR-199a-3p mimics組、miR-199a-3p mimics+CBX7組，分別轉(zhuǎn)染negative control miRNA mimics、miR-199a-3p mimics、miR-199a-3p mimics+CBX7。流式細(xì)胞法檢測結(jié)果顯示miR-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值(22.04±2.30)顯著高于miR-NC組(16.03±1.77)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；miR-199a-3p mimics+CBX7轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞比值(7.85±0.82)顯著低于miR-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染組(22.04±2.30)和miR-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.10 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-199a-3p抑制CBX7促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549侵襲與遷移能力

將negative control miRNA mimics (miR-NC), miR-199a-3p mimics和CBX7轉(zhuǎn)染進(jìn)A549細(xì)胞，采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞侵襲與遷移能力的改變，結(jié)果顯示，A549細(xì)胞中miR-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)及遷移能力顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而miR-199a-3p mimics+CBX7轉(zhuǎn)染組穿膜細(xì)胞數(shù)及遷移能力顯著低于miR-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖7)

圖7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測miR-199a-3p抑制CBX7促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549侵襲與遷移能力(**P<0.01)

Figure7.TranwellAssayShowingCBX7InhibitedandtheInvasionandMigrationofA549PromotedbyMiR-199a-3p(**P<0.01)

Transwell cell invasion assay found that the invasion (Panel A) and migration (Panel B) ability of the miR-199a-3p mimics+CBX7 transfection group significantly decreased.

2.11 Western blot 檢測CBX7蛋白表達(dá)水平

將培養(yǎng)好的肺癌細(xì)胞A549分為miR-NC組、CBX7組，分別轉(zhuǎn)染negative control miRNA mimics+ miR-199a-3p inhibitor、CBX7 siRNA +miR-199a-3p inhibitor，使用Western blot 檢測A549細(xì)胞中CBX7 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A549細(xì)胞中CBX7組CBX7 蛋白表達(dá)水平與miR-NC組相比顯著降低[(0.42±0.05)vs(1.39±0.22)]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖8)。

2.12 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

將培養(yǎng)好的肺癌細(xì)胞A549分為miR-NC組、CBX7組，分別轉(zhuǎn)染negative control miRNA mimics+ miR-199a-3p inhibitor、CBX7 siRNA +miR-199a-3p inhibitor。通過平板克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果顯示，CBX7組細(xì)胞形成克隆相對數(shù)與miR-NC組相比顯著升高[(3.34±0.32)vs(1.00±0.12)]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

圖8 Western blot 檢測CBX7蛋白表達(dá)水平

Figure8.ExpressionLevelofCBX7DetectedbyWesternBlot

3 討 論

近年來隨著新的生物信息學(xué)方法和技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，miRNA被更多的人關(guān)注和研究，使miRNA成為基因診斷和治療研究的新熱點(diǎn)。許多研究表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，具有重要的作用[9-13]。研究顯示，肺癌組織中miR-21的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，miR-21能夠?qū)Φ鞍桌野彼崃姿崦?phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)基因發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。Liu等[15]在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-31能夠?qū)σ至龌騆ATS2和PPP2R2A發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和小鼠肺癌移植瘤成瘤，發(fā)揮類似原癌基因的效應(yīng)。Kong 等[16]通過研究證實(shí)miR-155在肺癌中通過對轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)信號通路的促進(jìn)作用，發(fā)揮誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間葉組織轉(zhuǎn)化的效應(yīng)，起到類似癌基因的功能。miRNA已成為一種新興的腫瘤標(biāo)志物，為研究惡性腫瘤的發(fā)病機(jī)制、治療提供了新的靶點(diǎn)，因此對miRNA與腫瘤的關(guān)系進(jìn)行深入廣泛的研究，具有非常重要的臨床意義。

研究證實(shí)十余種miRNA通過參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞程序性死亡、相關(guān)基因調(diào)控等環(huán)節(jié)，發(fā)揮促進(jìn)或抑制肺癌發(fā)生發(fā)展的作用[17-18]。多種miRNA也成為肺癌診斷和治療的新靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中miR-199a-3p的相對表達(dá)量比癌旁正常組織顯著升高，肺癌細(xì)胞株中miR-199a-3p的表達(dá)量均顯著高于正常肺細(xì)胞。以上結(jié)果提示miR-199a-3p的高表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。研究還發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p高表達(dá)與患者腫瘤 TNM分期有一定關(guān)系。推測miR-199a-3p在臨床上將有可能成為輔助肺癌的診斷和判斷預(yù)后的重要因素。

miRNA通常在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)，在與靶基因結(jié)合時，成熟miRNA 一般與靶基因3′UTR結(jié)合，直接抑制或降解靶基因，使靶基因表達(dá)降低[19]。有研究報道，miR-199a可通過調(diào)控HIF-1α等抑制非小細(xì)胞肺癌的增殖[20]；miR-199a-3p可以通過抑制SMARCA2表達(dá)，下調(diào)SMARCA4表達(dá)，抑制TGF-β表達(dá)，誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移，TGF-β又可調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[21]；在非小細(xì)胞肺癌中，miR-199a-3p可調(diào)控表皮生長因子受體信號通路影響肺癌的轉(zhuǎn)移[22]。本研究發(fā)現(xiàn)CBX7 mRNA 3’UTR的堿基存在miR-199a-3p可能互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，提示CBX7是miR-199a-3p可能作用的靶基因。之后的研究也證實(shí)了miR-199a-3p可與CBX7的mRNA 3’UTR區(qū)域的堿基特異性互補(bǔ)結(jié)合，抑制熒光素酶活性的表達(dá)。A549細(xì)胞miR-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染組中CBX7 mRNA表達(dá)水平及蛋白水平均顯著降低，提示miR-199a-3p能夠通過抑制CBX7 的mRNA翻譯，抑制CBX7 蛋白水平表達(dá)。

CBX7屬于多梳蛋白(polycomb protein group,PcG)家族成員，在多梳蛋白復(fù)合物對靶基因的染色質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后修飾的過程中，CBX7發(fā)揮介導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄抑制的作用，從表觀遺傳學(xué)的角度沉默靶基因，并參與細(xì)胞的增殖、分化、衰老及腫瘤的發(fā)生等多個生物學(xué)過程。大量研究表明，CBX7作為PcG家族成員之一，參與調(diào)控細(xì)胞的衰老、凋亡等生理過程，其異常表達(dá)往往預(yù)示著癌癥的發(fā)生[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中CBX7 mRNA的相對表達(dá)量、CBX7蛋白的表達(dá)水平比癌旁正常組織顯著降低，肺癌細(xì)胞株中CBX7 mRNA的表達(dá)水平均顯著低于正常肺細(xì)胞。提示CBX7的低表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有密切的關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p的細(xì)胞體外增殖能力顯著增強(qiáng)。提示miR-199a-3p能促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的增殖能力。而轉(zhuǎn)染了miR-199a-3p+ CBX7后，miR-199a-3p對肺癌細(xì)胞A549增殖能力的促進(jìn)作用明顯減弱。說明CBX7具有抑制肺癌細(xì)胞增殖的作用。

流式細(xì)胞法檢測結(jié)果提示，miR-199a-3p能促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549周期S期的聚集能力，但CBX7同樣抑制了該效果。本研究中， Transwell實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果提示，在肺癌中miR-199a-3p表達(dá)上升，可能引起CBX7表達(dá)的降低，并最終促進(jìn)了肺癌細(xì)胞A549的侵襲和遷移。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-199a-3p的靶基因，本研究用miR-199a-3p inhibitor 封閉A549細(xì)胞內(nèi)miR-199a-3p的表達(dá)，同時轉(zhuǎn)染CBX7 siRNA 將CBX7的表達(dá)沉默。在細(xì)胞miR-199a-3p表達(dá)水平很低的情況下，利用CBX7 siRNA 封閉CBX7，通過Western blot和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞能否恢復(fù)A549細(xì)胞原有的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中CBX7蛋白表達(dá)水平與轉(zhuǎn)染陰性對照相比明顯降低。進(jìn)而采用平板克隆形成實(shí)驗(yàn)，檢測細(xì)胞形成克隆的能力，發(fā)現(xiàn)CBX7 siRNA與miR-199a-3p inhibitor轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，細(xì)胞形成克隆相對數(shù)與陰性對照相比明顯增高?？梢?，miR-199a-3p inhibitor抑制了A549細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)，而CBX7 siRNA將CBX7 表達(dá)沉默后致A549細(xì)胞中CBX7表達(dá)降低的同時使A549細(xì)胞恢復(fù)了形成克隆的能力。這有力證明了 miR-199a-3p通過負(fù)調(diào)控CBX7促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的增殖。

綜上所述， miR-199a-3p能夠通過對CBX7的負(fù)調(diào)控作用，促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的增殖、侵襲和遷移過程，從而促進(jìn)肺癌的發(fā)生與發(fā)展。推測miR-199a-3p可能成為未來肺癌診斷及治療的新靶點(diǎn)。

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