李靜，吳東明， 喻葉，王越峰，許穎

610500 成都，成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科

腹盆腔惡性腫瘤是發(fā)生率最高的惡性腫瘤之一，放射療法在腹盆腔惡性腫瘤患者治愈和姑息治療中扮演重要角色[1]。盡管隨著放射物理學(xué)和技術(shù)的發(fā)展，放療在“物理精準(zhǔn)”上已經(jīng)取得了很大進(jìn)步，但“物理精準(zhǔn)”方法仍然無(wú)法徹底解決輻射對(duì)正常組織毒性作用的問(wèn)題[2]。在放射治療腹內(nèi)或盆腔惡性腫瘤時(shí)，輻射場(chǎng)不可避免地會(huì)包括健康腸道，引發(fā)不良后果，隨后表現(xiàn)為輻射誘導(dǎo)的腸損傷[3]。據(jù)報(bào)道，接受腹內(nèi)或盆部放療后的患者，約60%～80%會(huì)出現(xiàn)急性消化道不適癥狀，其中，約50%的患者會(huì)出現(xiàn)不同程度的慢性腸功能障礙[3]。放射性腸損傷過(guò)程復(fù)雜，發(fā)生機(jī)制尚不明確。近年來(lái)，越來(lái)越多的證據(jù)表明炎癥在放射性腸損傷中起重要作用[3-4]。細(xì)胞焦亡是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種依賴半胱天冬酶活化的促炎程序性細(xì)胞死亡方式，以細(xì)胞腫脹裂解并伴隨大量促炎因子釋放為主要表現(xiàn)形式[5],但胱天蛋白酶1 (cysteinyl aspartate specific protease 1,Caspase-1) 介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡是否參與放射性腸炎的發(fā)生發(fā)展，至今尚少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究擬結(jié)合動(dòng)物和細(xì)胞水平探討Caspase-1信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在放射性腸炎中的作用，為開(kāi)發(fā)預(yù)防或緩解性治療提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

6～8周齡，雌性BALB/c小鼠，體重(18±2)g，購(gòu)于達(dá)碩動(dòng)物科技有限公司，動(dòng)物飼養(yǎng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。正常人腸上皮細(xì)胞株(normal human intestinal epithelial cells，HIEC)為本課題組保存。gasdermin D的N末端(GSDMD-N)、含pyrin結(jié)構(gòu)域核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體家族3[nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptor family,pyrin domain containing 3，NLRP3]抗體、胱天蛋白酶1特異性抑制劑(Z-YVAD-FMK，YVAD)購(gòu)自Abcam公司。Caspase1、含CARD結(jié)構(gòu)域凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、白細(xì)胞介素18(interleukin-18,IL-18)、IL-1β、Caspase1-p20抗體購(gòu)自CST公司。GAPDH抗體，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG購(gòu)自Proteintech公司。Caspase-1活性檢測(cè)試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)釋放檢測(cè)試劑盒、CCK-8試劑盒、蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)公司。免疫組化試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色液購(gòu)于北京中杉金橋。本實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞96孔板、六孔板、培養(yǎng)皿均購(gòu)于Corning公司。MEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶購(gòu)于hyclone公司，胎牛血清、青-鏈霉素購(gòu)于Gbico公司。RNA提取試劑盒購(gòu)于北京索萊寶生物公司。逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于BIO-RAD公司。ELISA試劑盒購(gòu)自貝塞維斯(深圳)生物科技公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本收集及處理 隨機(jī)將10只健康小鼠分為對(duì)照組(n=5)和輻射組(n=5)。輻射組小鼠經(jīng)麻醉后仰臥固定，腹部輻射野30mm×50mm，X線一次性輻射15Gy[6]，對(duì)照組麻醉后不做處理。輻射7d后，取對(duì)照組和輻射組血清用于ELISA檢測(cè)，然后斷頸處死，迅速切開(kāi)腹腔取小鼠小腸，取部分置于100g/L甲醛溶液中固定，部分存放于-80℃。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 將復(fù)蘇的HIEC細(xì)胞用含有15%的FBS，100μg/mL鏈霉素和100U/mL青霉素的MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到70%～80%匯合時(shí)，分為對(duì)照組、電離輻射(ionizing radiation，IR)組和YVAD+IR組。IR組采用X線一次性輻照15Gy,YVAD+IR組用YVAD(100μM)處理后[7]，X線一次性輻照15Gy[6]，輻照后繼續(xù)培養(yǎng)24h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 細(xì)胞活力測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板上，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜。處理后24h，根據(jù)制造商說(shuō)明書檢測(cè)細(xì)胞活力。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4 Caspase-1活性分析 將達(dá)到70%～80%匯合的細(xì)胞分為對(duì)照組、IR組和YVAD+IR組。IR組采用X線一次性輻照15Gy;YVAD+IR組用YVAD(100μM)處理后[7]，X線一次性輻照15Gy[6]，輻照后繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞。輻射處理小鼠后，收集對(duì)照及輻射組小鼠腸組織，根據(jù)制造商說(shuō)明書檢測(cè)Caspase-1活性。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5 LDH釋放測(cè)定 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜。處理后24h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。根據(jù)制造商說(shuō)明書檢測(cè)LDH水平。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-18含量 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5 000個(gè)細(xì)胞/孔接種到96孔培養(yǎng)板，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，培養(yǎng)過(guò)夜，處理后24h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液。輻射處理小鼠后，收集對(duì)照及輻射組小鼠血清，根據(jù)制造商說(shuō)明書檢測(cè)IL-1β、IL-18含量。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡分析 使用RIPA裂解液裂解處理后的小鼠腸組織與細(xì)胞，使用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白質(zhì)含量水平，隨后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1h，將膜與一抗4℃搖床孵育過(guò)夜。次日用TBST洗10min×3次，然后二抗室溫孵育2h，TBST洗10min×3次，顯影、成像。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR) 檢測(cè)腸組織和HIEC中IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β、IL-18的mRNA水平，引物由上海生工生物公司合成(表1、2)。參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取各組RNA，用BIO-RAD逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，分別將2μg的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。利用BIO-RAD的SYBR-Green PCR Mix試劑盒檢測(cè)mRNA表達(dá)水平，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

表1 小鼠基因PCR引物

Table 1. PCR Primer of Mouse Genes

Gene (mouse) PrimerSequence length (bp)IL-1βForward 5′-TGAAATGCCACCTTTTGACAGTGAT-3′ 120Reverse 5′-AGCTGGATGCTCTCATCAGGA-3′ IL-18 Forward 5′-ACTTTGGCCGACTTCACTGT-3′125Reverse 5′-GGGTTCACTGGCACTTTGAT-3′β-actin Forward 5′-GGGTTCACTGGCACTTTGAT-3′ 174Reverse 5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3IL-6Forward 5′-GGGAAATCGTGGAAATGAGA-3′ 131Reverse 5′-TCCAGTTTGGTAGCATCCATC-3′IL-8 Forward 5′-CTAGGCATCTTCGTCCGTCC-3′200Reverse 5′-TTCACCCATGGAGCATCAGG-3′TGF-αForward 5′-GCCAACGGCATGGATCTCAA-3′181Reverse 5′-TCTTGACGGCAGAGAGGAGG-3′

TGF-α: Transforming growth factor alpha.

表2 人源基因PCR引物

Table 2. PCR Primer of Human Genes

Gene(automatic)PrimerSequence length(bp)IL-1βForward 5′-GCGGCATCCAGCTACGAATCTC-3′101Reverse 5′-AACCAGCATCTTCCTCAGCTTGTC-3′ IL-18 Forward 5′-TGGCTGCTGAACCAGTAGAAG-3′ 180Reverse 5′-GAGGCCGATTTCCTTGGTCA-3′ β-actin Forward 5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′144Reverse 5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3IL-6Forward 5′-TTCAATGAGGAGACTTGCCT-GGTG-3′127Reverse 5′-TTGTACTCATCTGCACAGCTC TGG-3′

Gene(automatic)PrimerSequence length(bp)IL-8 Forward 5′-GGACCACACTGCGCCAACAC-3′93Reverse 5′-AACCCTCTGCACCCAGTTTTCC-3′TGF-αForward 5′-AGCTGGTGGTGCCATCAGAGG-3′ 124Reverse 5′-TGGTAGGAGACGGCGATGCG-3′

TGF-α: Transforming growth factor alpha.

1.2.9 免疫組織化學(xué)染色 將對(duì)照組和輻射組小鼠腸組織石蠟包埋、切片，脫蠟、水化，用檸檬酸緩沖液高壓10分鐘修復(fù)抗原，待自然冷卻，30mL/L H2O2室溫避光封閉15min，PBS洗滌5min×3次，山羊血清37℃封閉30min，4℃過(guò)夜孵育NLRP3抗體、Caspase-1抗體、ASC抗體。次日，PBS洗滌5min×3次，37℃孵育30min生物素化山羊抗兔IgG，PBS洗滌5min×3次，37℃孵育30min辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記鏈親和素，PBS洗滌5min×3次，DAB顯色，流水沖洗15min，復(fù)染蘇木素1min后，流水沖洗30min，待返藍(lán)色后，脫水封片，于顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.10 HE染色 將對(duì)照組和輻射組小鼠腸組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，根據(jù)凱基生物HE染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色,于顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結(jié) 果

2.1 輻射引起腸組織形態(tài)改變

由HE染色結(jié)果可見(jiàn)：與對(duì)照組小鼠相比，輻射組小鼠腸組織隱窩結(jié)構(gòu)破壞，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，絨毛萎縮(圖1)。

圖1 小鼠腸組織病變情況(HE染色,×200)

Figure1.IntestinalTissueLesionsinMice(HEStaining,×200)

Con: The control group; IR: The ionizing radiation group.

2.2 輻射引起腸組織炎性因子的 mRNA 水平增加

與對(duì)照組小鼠相比，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻射組小鼠中IL-8、TNF-α、IL-6、IL-18、IL-1β的mRNA水平增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.001，圖2)。

圖2 輻照引起腸組織炎性因子的 mRNA 水平增加

Figure2.AnIncreaseinthemRNALevelofIntestinalInflammatoryFactorsCausedbyIrradiation

Panel A and B show the mRNA levels of IL-8, TNF-α, IL-1β, IL-18 and IL-6 in two groups detected by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction. *P<0.05,**P<0.01, ***P<0.001,n=3. Con: The control group; IR: The ionizing radiation group.

2.3 輻射引起 NLRP3 激活并誘導(dǎo)腸組織發(fā)生細(xì)胞焦亡

免疫組化結(jié)果顯示：與對(duì)照組小鼠相比，輻射引起NLRP3、Caspase-1、ASC在輻射組小鼠腸組織中表達(dá)增強(qiáng)(圖3A)。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，輻射組小鼠腸組織中IL-1β、IL-18、Casp1-p20、GSDMD-N表達(dá)增強(qiáng)(圖3B)。ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組小鼠相比，輻射組小鼠血清中IL-1β、IL-18含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3C)。Caspase-1活性檢測(cè)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，輻射組小鼠腸組織中Caspase-1活性明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖3D)。

圖3 輻照引起 NLRP3 激活并誘導(dǎo)腸組織發(fā)生細(xì)胞焦亡

Figure3.NLRP3ActivatedandIntestinalTissuePyroptosisInducedbyIrradiation

Panel A shows the expression of NLRP3, Caspase-1, ASC in mouse intestinal tissue (immunohistochemical staining, ×200); Panel B shows the detection of IL-1β, IL-18, GSDMD-N in mouse intestinal tissue detected by Western blotting, and N-terminal, Casp1-p20 protein level; Figure C shows the levels of IL-1β and IL-18 in serum of mice determined by enzyme-linked immunosorbent assay; Figure D shows the activity of Caspase-1 in mouse intestinal tissue. **P<0.01, ***P<0.001,n=3. Con: The control group; IR: The ionizing radiation group.

2.4 YVAD抑制輻射性細(xì)胞焦亡的發(fā)生

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與IR組細(xì)胞相比，IR+YVAD組細(xì)胞中Caspase-1、caspa1-p20、GSDMD-N、IL-1β、IL-18蛋白表達(dá)降低(圖4A)；Caspase-1活性檢測(cè)試驗(yàn)顯示IR+YVAD組細(xì)胞中Caspase-1活性明顯低于IR組細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4B)；ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與IR組細(xì)胞培養(yǎng)液相比，IR+YVAD組細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β、IL-18含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖4C-D)。

2.5 YVAD減輕放射性炎性損傷

與IR組細(xì)胞相比，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)IR+YVAD組細(xì)胞中TNF-α、IL-18、IL-8、IL-6、IL-1β的 mRNA水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5A-E)。LDH釋放檢測(cè)與CCK-8活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與IR組細(xì)胞相比，IR+YVAD組細(xì)胞中LDH釋放水平明顯降低，細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖5F-G)。

圖4 YVAD抑制輻射性細(xì)胞焦亡的發(fā)生

Figure4.OccurrenceofRadioation-InducedPyroptosisInhibitedbyYVAD

Panel A shows the levels of Caspase-1, IL-1β, IL-18, GSDMD-N, and Casp1-p20 protein in each group of cells detected by Western blotting; Panel B shows the activity of Caspase-1 in each group of cells; Panel C and D show the levels of IL-1β and IL-18 in the culture medium of each group determined by enzyme-linked immunosorbent assay. The IR group and the control group, **P<0.01, ***P<0.001,n=3; the IR+YVAD group and the IR group, #P<0.05, ##P<0.01,n=3. Con: The control group; IR: The ionizing radiation group.

圖5 YVAD減輕放射性炎性損傷

Figure5.RadiationInflammatoryInjuryReducedbyYVAD

Panel A, B, C, D, E, F, and G show the mRNA levels of TNF-α, IL-18, IL-8, IL-6, and IL-1β in each group detected by quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction. Panel F shows the release of LDH in each group. Panel G shows the activity level of cells in each group measured by cell counting kit-8 assay. The IR group and the control group, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001,n=3; the IR+YVAD group and the IR group, #P<0.05, ##P<0.01,n=3. Con: The control group; IR: The ionizing radiation group.

3 討 論

放療是腹盆腔惡性腫瘤患者治療的重要組成部分，對(duì)于原發(fā)、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移病灶均有確切療效[1]。然而，放療在損傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，不可避免會(huì)損害機(jī)體正常細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)多種并發(fā)癥[8-9]。據(jù)報(bào)道，世界上每年接受腹、盆部放療的腫瘤患者高達(dá)50萬(wàn)，其中約70%～80%的患者會(huì)出現(xiàn)急性腸道癥狀，嚴(yán)重影響患者治療進(jìn)展和生存質(zhì)量[3，10-11]。因此，迫切需要更好地理解放射性腸損傷的疾病機(jī)制，以便為尋求新的治療、預(yù)防方法提供新的見(jiàn)解。

RE是腹部或盆腔照射后的一種常見(jiàn)并發(fā)癥，可發(fā)生于任何節(jié)段腸道，約有5%～17%的發(fā)生率[3,11]。有研究發(fā)現(xiàn)RE本質(zhì)上是一種炎癥，在放射性腸損傷過(guò)程中有多個(gè)炎性相關(guān)基因被上調(diào)，并通過(guò)不斷募集炎癥細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞間炎癥反應(yīng)被不斷放大[12-14]。本研究通過(guò)X射線一次性輻射小鼠腹部15Gy模擬放射性腸損傷，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，輻射組小鼠腸組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，IL-6等炎性因子的mRNA水平明顯升高。這些結(jié)果，提示輻射導(dǎo)致的放射性腸損傷的主要表現(xiàn)為炎性損傷，RE動(dòng)物模型構(gòu)建成功[5]。

細(xì)胞焦亡是近期發(fā)現(xiàn)的一種高度依賴于Caspase-1活化的促炎程序性細(xì)胞死亡方式[15-16]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡與痛風(fēng) 、阿爾茨海默病等多種炎癥相關(guān)疾病的進(jìn)展關(guān)系密切[17-20]。 因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞焦亡相關(guān)標(biāo)志物在腸組織中的表達(dá)，探討RE的炎性反應(yīng)過(guò)程是否有NLRP3炎性體誘導(dǎo)的Caspase-1依賴性細(xì)胞焦亡參與。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，輻射組小鼠腸組織中NLRP3炎性體與GSDMD-N、Caspsae1-p20等焦亡標(biāo)志蛋白表達(dá)明顯增加；Caspase-1活性增強(qiáng)；且輻射組小鼠血清中的IL-18、IL-1β含量水平均高于未照射的正常小鼠，提示NLRP3炎性體誘導(dǎo)的Caspase-1依賴性細(xì)胞焦亡可能參與放射性腸損傷的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

由于細(xì)胞焦亡是一種炎癥性細(xì)胞死亡方式，它有通過(guò)釋放炎性因子促進(jìn)清除病原體的作用，但也有研究表明，發(fā)生腫脹破裂的焦亡細(xì)胞，繼而會(huì)釋放內(nèi)容物引發(fā)級(jí)聯(lián)放大的炎癥反應(yīng)，可能會(huì)加重疾病進(jìn)展[21-22]。為了進(jìn)一步明確Caspase-1信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在RE中的作用，我們進(jìn)行了體外細(xì)胞相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IR+YVAD組細(xì)胞中的焦亡水平、IL-6等炎性因子的mRNA水平及LDH釋放水平明顯低于IR組細(xì)胞，細(xì)胞活力明顯高于IR組細(xì)胞，提示抑制細(xì)胞焦亡的發(fā)生可以減弱輻射誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)，從而減輕放射性損傷。

綜上，本實(shí)驗(yàn)成功建立了RE動(dòng)物模型，并檢測(cè)了輻射后腸組織中NLRP3炎性小體的激活情況及Caspsae1-p20等焦亡相關(guān)指標(biāo)，得出NLRP3誘導(dǎo)的Caspase-1依賴性細(xì)胞焦亡參與了RE的發(fā)病。接著我們通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)YVAD處理后輻射的焦亡水平及炎性損傷情況，得出Caspase-1信號(hào)通路介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡可能在RE發(fā)生發(fā)展中具有一定的致病作用。本研究結(jié)果為揭示RE這一復(fù)雜疾病的發(fā)病機(jī)制及尋求有效途徑預(yù)防治療提供了一定的理論基礎(chǔ)。 但NLRP3炎性小體是被怎樣的途徑激活及如何抑制細(xì)胞焦亡的具體下游成分來(lái)達(dá)到治療RE的目的，仍需深一步的研究。

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