鄧學(xué)文，盧進(jìn)，張禮，照沼裕

135-0051 東京，日本生物治療研究所(鄧學(xué)文)；610041 成都，四川省腫瘤醫(yī)院·研究所，四川省癌癥防治中心，電子科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院 腫瘤內(nèi)科中心(盧進(jìn)、張禮)；100-0004 東京，東京診所(照沼裕)

1 腫瘤免疫治療

手術(shù)、化療和放療作為腫瘤三大標(biāo)準(zhǔn)治療方法，在提高腫瘤病人生存率、延長生存時間方面發(fā)揮著重要作用。但是，根治腫瘤之路依然任重道遠(yuǎn)，迫切需要開發(fā)新的治療方法。2013年，美國科學(xué)雜志發(fā)布腫瘤免疫治療時代來臨[1]。近年來，免疫治療作為腫瘤第四治療方法，正在快速發(fā)展并受到極大關(guān)注。免疫治療不同于傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)治療直接殺傷癌細(xì)胞，而是通過激活機(jī)體免疫系統(tǒng)來驅(qū)除和消滅癌細(xì)胞。

目前，免疫治療包括以CTLA-4和PD-1為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑和免疫細(xì)胞治療。研究CTLA-4的美國人詹姆斯·艾莉森和研究PD-1的日本人本庶佑獲得2018年諾貝爾生理學(xué)/醫(yī)學(xué)獎，這不僅是對他們研究成績的肯定，更充分證明了腫瘤免疫治療的前景和價值。有人把CTLA-4和PD-1在腫瘤治療領(lǐng)域的成功與抗菌素史上發(fā)現(xiàn)青霉素比肩，預(yù)示著免疫治療腫瘤的新紀(jì)元。因此，我們可以大膽預(yù)測，今后將會出現(xiàn)越來越多利用免疫原理的抗腫瘤藥物。免疫細(xì)胞治療包括多種不同細(xì)胞類別。目前，美國食品藥品管理局已批準(zhǔn)了樹突狀細(xì)胞疫苗(Sipuleucel-T)治療前列腺癌和CAR-T細(xì)胞治療小兒B細(xì)胞白血病和淋巴瘤。隨著研究的進(jìn)展，將會開發(fā)出更多腫瘤免疫治療的細(xì)胞制劑。

2 自然殺傷(natural killer,NK)細(xì)胞

NK細(xì)胞是淋巴細(xì)胞的一種，發(fā)現(xiàn)于二十世紀(jì)七十年代中期，因不需要預(yù)先致敏直接殺傷癌細(xì)胞而命名[2]。NK細(xì)胞是自然免疫的重要成分，通過直接攻擊應(yīng)急的、感染的和變質(zhì)的細(xì)胞，對機(jī)體保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮著重要作用[3-4]。

NK細(xì)胞占外周血淋巴細(xì)胞的10%～20%[5]，其表現(xiàn)型為CD3-CD14-CD19-CD56+CD16+。目前，一般通過流式細(xì)胞儀測定NK細(xì)胞(圖1)。NK細(xì)胞根據(jù)CD56分子發(fā)現(xiàn)強(qiáng)度和CD16分子表達(dá)又可進(jìn)一步分為功能不同的兩個亞型[6-7]。CD56dimCD16+NK細(xì)胞占外周血液和脾臟NK細(xì)胞的90%，主要以細(xì)胞殺傷功能為主，CD56brightCD16dim/-NK細(xì)胞主要分布在淋巴結(jié)，以產(chǎn)生細(xì)胞因子、免疫調(diào)節(jié)功能為主[6,8]。

圖1流式細(xì)胞儀測定的外周血NK細(xì)胞

從外周血中分離單個核白細(xì)胞，用CD3熒光抗體和CD56熒光抗體染色后，BECKMAN COULTER FC500流式細(xì)胞儀測定，CYTOMICS CXP軟件分析NK細(xì)胞及其亞型。橫軸為CD3抗體熒光強(qiáng)度，縱軸為CD56抗體熒光強(qiáng)度。在淋巴細(xì)胞集團(tuán)中，CD3陰性CD56陽性細(xì)胞集團(tuán)為NK細(xì)胞。NK細(xì)胞中CD56熒光表達(dá)弱的細(xì)胞集團(tuán)為CD56dimNK細(xì)胞亞型；CD56熒光表達(dá)強(qiáng)的細(xì)胞集團(tuán)為CD56brightNK細(xì)胞亞型。

NK細(xì)胞的功能活動取決于NK細(xì)胞表面活性化受體和抑制性受體刺激信號的強(qiáng)弱對比，當(dāng)活性化信號強(qiáng)于抑制性信號時，NK細(xì)胞就活性化，反之就處于抑制狀態(tài)。每個NK細(xì)胞表面至少發(fā)現(xiàn)有一個抑制性受體，這些抑制性受體主要包括Killer-Ig-Like Receptors(KIRs)和CD94-NKG2A異聚體，它們分別認(rèn)識細(xì)胞表面的組織相容性抗原HLA-Ⅰ和HLA-E，以保護(hù)正常細(xì)胞不受NK細(xì)胞傷害[9-10](圖2)。NK細(xì)胞通過抑制性受體識別靶細(xì)胞，同時，抑制性信號在NK細(xì)胞成熟過程中給與其功能訓(xùn)練[11-12]。沒有受到抑制性信號刺激的NK細(xì)胞是低反應(yīng)細(xì)胞。只有經(jīng)過自己組織相容性抗原抑制性信號刺激的NK細(xì)胞才賦予其功能[13-14]。因此，NK細(xì)胞識別癌細(xì)胞，病毒感染細(xì)胞主要是由于這些細(xì)胞的組織相容性抗原MHC-Ⅰ表達(dá)減弱或消失(圖2)。當(dāng)然，僅有MHC-Ⅰ表達(dá)減弱或消失還不足以活化NK細(xì)胞[14]。

NK細(xì)胞活性化受體包括NKG2D，以及自然活性受體(natural cytoxicity receptors, NCRs)NKp46，NKp44和NKp30等[15]。當(dāng)NKG2D與靶細(xì)胞表面的糖蛋白MICA、MICB或ULBPs結(jié)合，或NCRs與硫酸肝素結(jié)合時，就會啟動NK細(xì)胞內(nèi)活性信號[16-17]。癌變細(xì)胞表面活性化受體表達(dá)增強(qiáng)就會激活NK細(xì)胞發(fā)揮免疫監(jiān)視效應(yīng)，使之發(fā)現(xiàn)和清除新發(fā)生的癌細(xì)胞。特別是當(dāng)癌細(xì)胞MHC-Ⅰ表達(dá)降低并同時表達(dá)活性受體，NK細(xì)胞識別癌細(xì)胞并活性化，進(jìn)而釋放穿孔素和顆粒酶，啟動癌細(xì)胞凋亡和殺傷機(jī)制[18]。同時，活性化的NK細(xì)胞還會釋放IFNγ、TNFα等細(xì)胞因子，不但協(xié)同殺傷癌細(xì)胞，還可以活化其它免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫防御能力(圖2)。

圖2 NK細(xì)胞識別正常細(xì)胞和癌細(xì)胞

上圖，正常細(xì)胞表達(dá)抑制性受體配體MHC-I而無活性受體配體表達(dá)，因此，NK細(xì)胞功能被抑制，不會殺傷正常細(xì)胞。下圖，癌細(xì)胞抑制性受體配體MHC-I表達(dá)消失并且表達(dá)活性受體配體，因此，NK細(xì)胞活性化，直接殺傷癌細(xì)胞，同時釋放細(xì)胞因子活性化免疫反應(yīng)。

3 NK細(xì)胞與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展

動物模型研究表明，癌癥發(fā)生率在缺失NK細(xì)胞的鼠比野生鼠更高[19-20]。使用缺失獲得性免疫功能的鼠模型證明，NK細(xì)胞具有腫瘤免疫監(jiān)視和免疫編輯作用[21]。日本研究人員Imai等[22]對3625名日本居民隨訪11年發(fā)現(xiàn)，NK細(xì)胞活性低的人群比中或高人群患癌風(fēng)險明顯增高。我們對乳腺癌的研究也表明，乳腺癌病人的NK細(xì)胞活性明顯低于健康人，有轉(zhuǎn)移的乳腺癌病人NK細(xì)胞活性進(jìn)一步降低[23]。胃癌[24]、大腸癌[25]和腎癌[26]等的臨床病理研究表明，癌組織中NK細(xì)胞浸潤的多寡與病人預(yù)后有關(guān)，NK細(xì)胞浸潤越多預(yù)后越好。因此，NK細(xì)胞在癌癥的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用。

4 外科手術(shù)與NK細(xì)胞功能

手術(shù)作為實(shí)體瘤的主要治療方法，在腫瘤治療中發(fā)揮著重要作用。但是，腫瘤病人手術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響病人長期生存的事實(shí)不可否認(rèn)，并早已引起廣泛關(guān)注[27-28]。Demichi等回顧分析了1 173名接受了手術(shù)治療的乳腺癌病人和250名非手術(shù)乳腺癌病人的生存時間，發(fā)現(xiàn)手術(shù)病人有兩個死亡高峰，分別出現(xiàn)在第3年和第8年，而非手術(shù)病人只有一個死亡高峰出現(xiàn)在第4年[29-30]。因此，部分病人甚至可能因?yàn)槭中g(shù)而加速腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致病人生存時間縮短。動物研究表明，手術(shù)促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，降低生存率[31-32]，其原因部分與手術(shù)本身有關(guān)。近年研究表明，免疫細(xì)胞功能障礙與手術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[33-34]。

NK細(xì)胞作為先天性免疫細(xì)胞，在外傷、手術(shù)以及危重狀態(tài)時會出現(xiàn)嚴(yán)重的功能障礙[33,35-36]。NK細(xì)胞功能障礙的程度和時間與損傷強(qiáng)度有關(guān)。NK細(xì)胞功能障礙可以是一過性的，但其生物學(xué)影響則可能長期持續(xù)，包括對感染和損傷修復(fù)的影響[37-38]。研究表明，手術(shù)切除實(shí)體瘤可能增加腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移甚至死亡風(fēng)險[39-40]。早在1913年就已觀察到腫瘤手術(shù)切除與轉(zhuǎn)移的關(guān)系[27]，但是直到近年的研究才發(fā)現(xiàn)細(xì)胞免疫功能障礙在其中所扮演的角色[33-34]。特別是圍手術(shù)期NK細(xì)胞功能障礙與腫瘤手術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[33-34]。研究表明，NK細(xì)胞功能在手術(shù)后第1天已經(jīng)降低，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移程度相關(guān)[31]。腫瘤病人復(fù)發(fā)率也與術(shù)后NK細(xì)胞功能障礙程度密切相關(guān)[41]。因此，在圍手術(shù)期使用增強(qiáng)免疫功能的細(xì)胞因子，如IL-2、GM-CSF、TNFα、IFNα等可以降低手術(shù)后腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[42-43]。鑒于這些細(xì)胞因子都有增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的功能，進(jìn)一步驗(yàn)證了NK細(xì)胞在防御腫瘤手術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中的作用。

手術(shù)后NK細(xì)胞功能障礙的機(jī)制復(fù)雜，涉及手術(shù)后血液高凝狀態(tài)，釋放抗炎性反應(yīng)因子和免疫抑制性細(xì)胞增加等[44]。對這些機(jī)制的深入研究，將有利于開發(fā)腫瘤圍手術(shù)期免疫治療的新方法，降低腫瘤手術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，提高腫瘤病人治療效果和預(yù)后。

5 活性化NK細(xì)胞治療

基于NK細(xì)胞的腫瘤免疫作用，特別是不受組織相容性抗原和腫瘤抗原限制直接殺傷癌細(xì)胞的特性，自然會想到使用NK細(xì)胞治療腫瘤[45-46]。由于外周血中NK細(xì)胞數(shù)量少，腫瘤病人NK細(xì)胞活性降低，因此需要在體外擴(kuò)增和活性化NK細(xì)胞[46]。國際上報道了一些NK細(xì)胞活性化培養(yǎng)方法，其中多數(shù)需要使用滋養(yǎng)細(xì)胞刺激培養(yǎng)，為臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用和監(jiān)管帶來了一些難度[46]。日本開發(fā)了一種不使用滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)NK細(xì)胞的技術(shù)，并已做成試劑盒(BINKIT?)在國際上推廣使用[47]。BINKIT?操作簡單，可以從外周血單個核細(xì)胞中直接培養(yǎng)活性化NK細(xì)胞，在2至3周內(nèi)使外周血NK細(xì)胞活性化擴(kuò)增上千倍[48]。BINKIT?培養(yǎng)的NK細(xì)胞高表達(dá)活性受體，并且細(xì)胞因子產(chǎn)生能力比培養(yǎng)前的NK細(xì)胞明顯提高，對癌細(xì)胞的殺傷活性也明顯增強(qiáng)[48]。同時，培養(yǎng)NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷活性明顯強(qiáng)于培養(yǎng)γδT細(xì)胞和培養(yǎng)αβT細(xì)胞[49]。因此，培養(yǎng)NK細(xì)胞是非特異性免疫細(xì)胞治療的首選。培養(yǎng)NK細(xì)胞靜脈注射后可使體內(nèi)免疫活性化，外周血NK細(xì)胞活性增強(qiáng)[47]。使用BINKIT?培養(yǎng)自己NK細(xì)胞開展腫瘤免疫細(xì)胞治療，在日本一般是每2至3周治療1次(圖3)，6次為一個療程。近10年就有超過6萬人次以上NK細(xì)胞治療，除偶有發(fā)熱等不良反應(yīng)外，沒有需要治療的副作用發(fā)生，證明NK細(xì)胞治療的臨床安全性。NK細(xì)胞治療通常與樹突狀細(xì)胞治療，溫?zé)嶂委熀偷蛣┝炕熉?lián)合應(yīng)用，已觀察到可以延長進(jìn)展期胰腺癌的生存時間[50]，以及提高乳腺癌單抗治療效果等作用[51]。隨著治療案例的累積，NK細(xì)胞治療的效果將會得到進(jìn)一步發(fā)揮和體現(xiàn)。

圖3NK細(xì)胞治療流程模式圖

一般1次采取30mL～50mL外周血，從中分離單個核白細(xì)胞，選擇性培養(yǎng)NK細(xì)胞。培養(yǎng)時間為2～3周。經(jīng)過細(xì)菌，真菌，支原體和內(nèi)毒素檢測確定安全性后，靜脈點(diǎn)滴回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)。癌癥病人治療時一般1個療程6次，NK細(xì)胞回輸前采取下次NK細(xì)胞培養(yǎng)的血液。

6 發(fā)揮NK細(xì)胞治療作用的方法和策略

鑒于腫瘤病因/病理機(jī)制的復(fù)雜性，使任何單一腫瘤治療方法都有其局限性。因此，需要揚(yáng)長避短，綜合治療。手術(shù)是實(shí)體瘤的重要治療方法，特別是對減輕腫瘤負(fù)荷具有非常重要的作用[52]。但是，手術(shù)本身以及其對機(jī)體免疫功能的影響，又可能引起和促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[39-40]。特別是圍手術(shù)期NK細(xì)胞功能障礙與術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[33-34]，因此，盡量減少手術(shù)對機(jī)體免疫功能的影響，以及術(shù)后盡早提高和恢復(fù)免疫功能，包括開展NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞治療，對于預(yù)防和控制復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移，提高治療效果具有積極意義[31-33]。

近年來，分子靶向治療的迅速發(fā)展，為腫瘤病人提供了新的治療手段和希望[53]。靶向藥物包括阻斷癌細(xì)胞表面信號的抗體和細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的藥物?？贵w藥物不僅可以阻斷細(xì)胞表面信號傳遞抑制癌細(xì)胞增殖，還可以通過其Fc激活免疫細(xì)胞，發(fā)揮抗體依存性細(xì)胞毒性活性(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)[54]。NK細(xì)胞表達(dá)CD16分子，可以與抗體Fc結(jié)合，是重要的ADCC效應(yīng)細(xì)胞[54]。我們以表皮生長因子受體表達(dá)陽性的A549肺腺癌細(xì)胞株為靶細(xì)胞測定培養(yǎng)NK細(xì)胞的殺傷活性，即便A549細(xì)胞表達(dá)抑制性受體配體MHCⅠ，培養(yǎng)NK細(xì)胞仍然可以殺傷A549細(xì)胞，當(dāng)同時添加西妥昔單抗時，則顯著提高培養(yǎng)NK細(xì)胞對A549細(xì)胞的殺傷活性(圖4)。因此可以期待，當(dāng)抗體藥物與NK細(xì)胞治療聯(lián)合應(yīng)用時，可以發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。臨床上，我們也觀察到曲妥珠單抗治療耐藥的乳腺癌病人，當(dāng)聯(lián)合NK細(xì)胞治療后，其病情明顯改善[51]。另外，阻斷癌細(xì)胞內(nèi)信號傳遞的靶向藥物，在抑制癌細(xì)胞增殖的同時，也使癌細(xì)胞表面NK細(xì)胞活性化受體表達(dá)增強(qiáng)，有利于NK細(xì)胞發(fā)揮免疫監(jiān)視作用[55]。因此，分子靶向藥物聯(lián)合NK細(xì)胞治療有望提高治療效果，有待今后的臨床研究。

圖4西妥昔單抗增強(qiáng)培養(yǎng)NK細(xì)胞殺傷癌細(xì)胞活性

右圖，靶細(xì)胞A549肺腺癌細(xì)胞株表達(dá)MHC-I和表皮生長因子受體。左圖，橫軸為培養(yǎng)NK細(xì)胞與靶細(xì)胞的比率，縱軸為細(xì)胞殺傷活性。用Calcei-AM染色A549后，按一定比率與培養(yǎng)NK細(xì)胞共同培養(yǎng)。用TERASCAN VP測定培養(yǎng)前/后的熒光量，根據(jù)熒光量的變化計算出細(xì)胞殺傷活性。虛線為培養(yǎng)NK細(xì)胞單獨(dú)殺傷A549的活性，實(shí)線為培養(yǎng)NK細(xì)胞與A549培養(yǎng)時添加西妥昔單抗后的細(xì)胞殺傷活性。西妥昔單抗明顯增強(qiáng)培養(yǎng)NK細(xì)胞對A549的細(xì)胞殺傷活性。

腫瘤治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)在于復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。其中上皮間葉轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是腫瘤轉(zhuǎn)移的重要機(jī)制[56]。雖然EMT可以逃逸T細(xì)胞免疫[57]，但是其表達(dá)NK細(xì)胞活性分子，可以致敏NK細(xì)胞免疫監(jiān)視機(jī)制[58]。因此，增強(qiáng)NK細(xì)胞活性，包括NK細(xì)胞治療，將有助于阻止和預(yù)防腫瘤的轉(zhuǎn)移。

7 總結(jié)與展望

總之，隨著腫瘤免疫研究的進(jìn)展，今后將會有越來越多利用免疫機(jī)制的治療藥物和方法進(jìn)入臨床，造福腫瘤病人。NK細(xì)胞作為可以直接殺傷癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞，如何在腫瘤綜合治療中發(fā)揮作用，特別是對腫瘤微小病變，以及腫瘤復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移中發(fā)揮功效，有待深入臨床研究。