王玲仙，王 波，付 堅，邢佳鑫，肖素勤，張敦宇，鐘巧芳，柯 學(xué)，陳 玲，殷富有，蔣 聰，程在全

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，云南 昆明 650205)

野生稻資源是現(xiàn)代水稻育種中新基因的一個重要來源。特別是非AA染色體組野生稻這一次級基因庫中有利基因的利用前景更為誘人，并已有成功的報道[1]。野生稻長期處于野生狀態(tài)，經(jīng)受各種病蟲害和不利環(huán)境的自然選擇，具有豐富的遺傳多樣性，是天然的基因庫。在目前還不能大規(guī)模人工創(chuàng)造新基因的條件下，天然的野生稻資源在水稻育種中，特別是在抗病蟲、抗逆性育種中具有巨大的利用價值[2]。同時野生稻還具有優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)含量高、功能葉片耐衰老、特強的再生性、良好的茂盛性及生長優(yōu)勢，這些優(yōu)良特性已被廣泛用于水稻常規(guī)育種和雜交育種中，并取得了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益[3]。

緊穗野生稻Oryzaeichingeri經(jīng)查證，認為O.eichingeri實際上是二倍體稻種， 有學(xué)者將其染色體組定為CC。它與栽培稻親緣關(guān)系較遠，同樣具有許多優(yōu)良特性，但緊穗野生稻結(jié)實率不高，種子落粒性強，萌發(fā)率低，基本不能用種子進行繁殖，嚴重妨礙了緊穗野生稻的保存保護、繁殖和利用。目前，緊穗野生稻的繁殖手段主要是莖稈扦插和分根移栽，其繁殖率低、繁殖時間長。研究中發(fā)現(xiàn)，緊穗野生稻種子種皮堅硬，有一層釉質(zhì)包裹，種子極難吸水膨脹，造成種子萌發(fā)率極低，利用常規(guī)的浸泡和高溫催芽處理也很難提高緊穗野生稻種子的發(fā)芽率，利用種子誘導(dǎo)愈傷效率和成苗率也極低。本研究利用緊穗野生稻的幼胚活力強的特點，應(yīng)用不同植物激素組合和培養(yǎng)條件變化對其進行誘導(dǎo)分化，成功地誘導(dǎo)出了緊穗野生稻幼胚愈傷組織，并得到分化生根苗，為今后野生稻的資源保存、利用和雜交育種提供了技術(shù)支持和充分保障。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

緊穗野生稻種質(zhì)材料從斯里蘭卡引進。

1.2 實驗試劑

2,4-D、6-BA、NAA、IAA、KT、ZT、TDZ與各類組織培養(yǎng)所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 幼胚采集 田間采集緊穗野生稻幼胚，用紙袋裝好，曬干，儲存于干燥通風的地方。

1.3.2 幼胚處理 將曬干幼胚剝?nèi)ぃ糜跍缇男″F形瓶內(nèi)，在超凈工作臺內(nèi)用蒸餾水清洗，再用75%的酒精表面滅菌1 min，加入0.1%的氯化汞分別處理15、10 min，用無菌水清洗4～5遍，將種子用濾紙吸干水分，待用。

1.3.3 胚性愈傷誘導(dǎo) 將待用幼胚接入不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，置于人工氣候箱28 ℃暗培養(yǎng)，35 d后，長出帶有粘液的胚性愈傷，換培養(yǎng)基一次，繼續(xù)培養(yǎng)10～16 d，使愈傷長至直徑0.2 cm時，N6和MS愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：N6和MS+2,4-D 3.0～15.0 mg/L+植物凝膠2.8 g/L+蔗糖30%, pH值6.0。

1.3.4 胚性愈傷繼代培養(yǎng) 將直徑0.2 cm的胚性愈傷從胚上分離下來，接入繼代培養(yǎng)基中，置于人工氣候箱中28 ℃暗培養(yǎng)，每20 d換培養(yǎng)基一次，繼代2～3次后愈傷組織由白色變成淡黃色的緊實顆粒。愈傷繼代培養(yǎng)基為：N6+2,4-D 3.0 mg/L+植物凝膠2.8 g/L+蔗糖30%, pH值6.0。

1.3.5 胚性愈傷增殖培養(yǎng) 挑選直徑為0.2～0.5 cm的淡黃色緊實顆粒狀愈傷組織進行增殖，每瓶接入20個愈傷，置于溫度為28 ℃、光照為2000 lx的培養(yǎng)箱中進行弱光培養(yǎng)，每7 d更換一次培養(yǎng)基;21～28 d后；愈傷組織大量增殖覆蓋整個培養(yǎng)基表面，并呈現(xiàn)黃綠色。愈傷增殖培養(yǎng)基為：N6+2,4-D 6.0 mg/L+植物凝膠2.8 g/L+蔗糖30%,pH值6.0。

1.3.6 胚性愈傷組織分化和繼代培養(yǎng) 將黃綠色緊實顆粒狀的愈傷組織分別接入不同分化培養(yǎng)基中，每瓶10～15個，置于溫度為28 ℃、光照為4000 lx的培養(yǎng)箱中進行光照培養(yǎng)，10～12 d后，愈傷組織變?yōu)榈G、深綠色相間，換繼代培養(yǎng)基一次，繼續(xù)培養(yǎng)20～25 d，換增殖培養(yǎng)基一次，25～30 d后，愈傷分化出小苗，待小苗長至2～3 cm長時，進行壯苗培養(yǎng)。分化、繼代、增殖培養(yǎng)基為：N6+6-BA 2.0～12.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+KT 2.0 mg/L+ ZT 2.0 mg/L+植物凝膠2.8 g/L+蔗糖30%,pH值6.0。

1.3.7 壯苗培養(yǎng) 將2～3 cm長的小苗從培養(yǎng)瓶中取出，接入壯苗培養(yǎng)基中，置于28 ℃、4000 lx的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20～27 d，小苗莖稈增粗并長至4～5 cm時，進行生根培養(yǎng)。壯苗培養(yǎng)基為：N6+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L+TDZ 2.0 mg/L+植物凝膠2.8 g/L+蔗糖30%，pH值6.0。

1.3.8 生根培養(yǎng) 將4～5 cm的健壯無根苗分別接入裝有N6與NAA和IAA的生根培養(yǎng)基試管中，每根試管接入6～8株，置于28 ℃、2000 lx的弱光照培養(yǎng)箱中進行生根培養(yǎng)，3 d后根芽露白，培養(yǎng)20～25 d后，根長至5～7 cm，苗長至10～12 cm后進行煉苗；生根培養(yǎng)基分別為：N6+NAA和IAA 0.1～1.2 mg/L+植物凝膠2.8 g/L+蔗糖15 g/L，pH值6.0。

1.3.9 煉苗與栽種 將長至10～12 cm的生根苗揭掉試管膜，培養(yǎng)2 d后，用自來水將苗根部的培養(yǎng)基沖洗干凈，放入試管中，加水淹沒根部，置于28 ℃、2000 lx的光照培養(yǎng)箱中進行苗鍛煉，5 d后，將苗從光照培養(yǎng)箱中移出，定植到購于市場的營養(yǎng)基質(zhì)中，置于溫室進行培養(yǎng)，12 d后，葉片完全展開、新根長出，再移栽至大田，在生長中期注意水、肥管理，后期注意追施一次肥，直至種子成熟。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基對緊穗野生稻幼胚誘導(dǎo)愈傷情況的比較

以N6為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同的2,4-D濃度梯度，緊穗野生稻幼胚誘導(dǎo)愈傷情況如圖1、表1所示。N6基本培養(yǎng)基在不加2,4-D的情況下(對照)，緊穗野生稻幼胚沒有產(chǎn)生胚性愈傷。加入不同濃度2,4-D后，能夠誘導(dǎo)出幼胚愈傷，當2,4-D濃度為5.0 mg/L時，對胚性愈傷誘導(dǎo)率最強，出愈率達到100%(圖2)。此時愈傷顆粒緊實，淺綠，胚性愈傷生長情況最好。當2,4-D濃度為6.0 mg/L時，出愈率達到90%，愈傷顆粒緊實，淡黃、淡綠，胚性愈傷生長情況次之。當2,4-D濃度為15.0 mg/L，出愈率最低，只有26%，愈傷透明，粘性愈傷增多，品質(zhì)下降。結(jié)果說明：2,4-D在一定濃度范圍內(nèi)誘導(dǎo)并促進了緊穗野生稻胚性愈傷組織的生長，但超過一定濃度之后，隨著2,4-D濃度的不斷增高，抑制了胚性愈傷生長，說明較低濃度和高濃度的 2,4-D不利于緊穗野生稻幼胚的愈傷組織誘導(dǎo)。

以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同的2,4-D濃度梯度，緊穗野生稻幼胚誘導(dǎo)愈傷情況如圖1、表1所示。MS培養(yǎng)基在不加2,4-D的情況下(對照)，幼胚沒有產(chǎn)生胚性愈傷。當加入不同濃度2,4-D后，MS培養(yǎng)基與2,4-D的組合也能夠誘導(dǎo)出幼胚愈傷，當2,4-D濃度為 7.0 mg/L時，胚性愈傷出愈率最高，達到30%，愈傷成顆粒狀，淡黃淡綠相間；當2,4-D濃度為 15.0 mg/L時，胚性愈傷出愈率最低，只有10%，愈傷透明，粘性增多，說明當2,4-D濃度高時，在MS培養(yǎng)基中同樣抑制了胚性愈傷形成。MS基本培養(yǎng)基與2,4-D配比整體來看，出愈率普遍偏低，愈傷粘性較多，不適合作為胚性愈傷的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

以上結(jié)果說明N6培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更適合誘導(dǎo)緊穗野生稻的胚性愈傷，N6培養(yǎng)基+2,4-D濃度為5.0 mg/L時，愈傷誘導(dǎo)率最高，出愈率達到100%，此時愈傷顆粒緊實，淺綠，胚性愈傷生長情況最好。

圖1 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基下緊穗野生稻幼胚愈傷組織誘導(dǎo)情況

圖2 緊穗野生稻幼胚愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)

表1 緊穗野生稻在不同培養(yǎng)基中胚性愈傷的生長情況

2.2 不同激素配比分化培養(yǎng)基對緊穗野生稻幼胚分化影響比較

不同激素配比分化培養(yǎng)基對緊穗野生稻幼胚分化的影響如圖3、表2所示。以N6為培養(yǎng)基，添加NAA 0.3 mg/L、KT 2.0 mg/L和ZT 2.0 mg/L情況下，設(shè)置不同的6-BA濃度梯度，均能夠分化出苗。當6-BA濃度為4.0 mg/L時，愈傷分化率最高，達到88%(圖4)；綠色凸起愈傷分化苗最多，苗油綠，莖稈粗，叢生苗多，長出新愈傷。當6-BA濃度為2.0 mg/L時，愈傷分化凸起增殖減慢，分化苗生長緩慢，用于分化繼代培養(yǎng)較好。當6-BA濃度為2.0 mg/L時，添加NAA 0.3 mg/L、TDZ 2.0 mg/L，作為壯苗培養(yǎng)基最適合，壯苗后，苗油綠，葉片硬扎，莖稈粗壯，植株矮壯。當6-BA濃度為6.0 mg/L時，愈傷分化漸降，苗綠，而新愈傷和芽增多，作為分化增殖培養(yǎng)最理想；當6-BA濃度為12.0 mg/L時，愈傷分化率最低，只有2%，極少有分化苗，苗色黃綠，莖稈纖細，未見叢生苗和新愈傷長出，愈傷褐化，分化最差，不適合用于分化培養(yǎng)。

圖3 不同激素配比分化培養(yǎng)基下緊穗野生稻幼胚分化情況

2.3 不同培養(yǎng)基對緊穗野生稻幼胚生根影響的比較

不同培養(yǎng)基對緊穗野生稻幼胚生根的影響如圖5、表3所示，以N6為基本培養(yǎng)基，設(shè)置不同的NAA和IAA濃度梯度，均能夠使緊穗野生稻幼胚分化苗生根。N6培養(yǎng)基與IAA的組合搭配，以IAA濃度為0.3 mg/L時，幼胚生根率最高，達到96%；3 d時根芽露白，根芽露白早，主根吸收養(yǎng)分充足，主根、須根生長快，根多、粗壯，用于生根最好(圖6)。以IAA濃度為0.4 mg/L時，幼胚生根率次之，達到82%；3 d時根芽露白，主根粗、生長快，主須根分生次之。以IAA濃度為1.2 mg/L時，生根率最低，只達到15%；9 d以后根芽露白，主根生根減少，須根絨根曲卷，很難利用根系吸收足夠的養(yǎng)分和水分來滿足生根苗的生長需要。也就是說：當IAA濃度為 0.1～0.3 mg/L時，生根率隨著激素濃度的提高而逐漸增高；當IAA濃度為0.3～1.2 mg/L時，生根率隨著激素濃度提高而降低；當IAA濃度為1.0～1.2 mg/L時，由于激素濃度偏高，苗根基部嚴重褐化。

圖4 緊穗野生稻幼胚分化培養(yǎng)

表2 不同6-BA濃度對分化培養(yǎng)基中愈傷分化的影響

N6培養(yǎng)基與NAA的組合搭配，當NAA濃度為0.3 mg/L時，5 d時幼胚根芽露白，主、須根出根增多，主根短，生根率最高，達到82%。當NAA濃度為0.4 mg/L時，7 d后幼胚主根長出，主根短、粗，須根長出、偏少，生根率次之，達到77%。當NAA濃度為1.2 mg/L時，9 d后根芽露白，主根生根減少，須根絨根曲卷，曲卷的須根不利養(yǎng)分和水分的吸收，因而滿足不了根的生長需要，生根率最低，只達到23%。也就是說：當NAA濃度為0.1～0.3 mg/L時，生根率隨著激素濃度的提高而逐漸增高；當NAA濃度為0.4～1.2 mg/L時，生根率隨著激素濃度的增高而逐漸降低；當IAA濃度為1.2 mg/L時，苗根基部同樣出現(xiàn)嚴重褐化。說明以N6為基本培養(yǎng)基時，設(shè)置不同的NAA和IAA的濃度配比，都能使緊穗野生稻幼胚分化苗生根。但是，IAA 較NAA更適合用于緊穗野生稻幼胚生根培養(yǎng)基。

2.4 煉苗、栽種與成活率

生根苗揭膜后，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d，用自來水沖洗掉生根苗根部培養(yǎng)基，加水將根基部淹沒，進行苗鍛煉5 d，定植到營養(yǎng)基質(zhì)中，在溫室培養(yǎng)12 d，待葉片完全展開、新根長出，再移栽至大田生長20 d，統(tǒng)計苗的成活率。苗經(jīng)過煉苗和栽種，組培苗和自然生長苗存在著很多差異，由室內(nèi)環(huán)境過渡到室外，生長環(huán)境由無菌狀態(tài)變成有菌狀態(tài)，培養(yǎng)溫度和光照條件發(fā)生了改變，整個煉苗和栽種，必須是一個逐步適應(yīng)過程，這樣有利于提高生根苗在田間的成活率。

圖5 不同培養(yǎng)基下緊穗野生稻幼胚生根情況

3 結(jié)論

3.1 培養(yǎng)基的選擇對緊穗野生稻幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同的培養(yǎng)基有不同的作用，分別可以誘導(dǎo)細胞分裂、控制愈傷組織生長和分化生根，選擇適合的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中最主要的因素。目前各種培養(yǎng)基無機鹽的含量一般都比較高，對植物組織和細胞的離體培養(yǎng)適用性更好，由Murashige和Skoog設(shè)計的MS培養(yǎng)基各元素比例合理，對雙子葉、單子葉、木本和草本的器官、組織、細胞及原生質(zhì)體培養(yǎng)有良好效果。而N6培養(yǎng)基銨離子濃度較低，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮比例合理，適合禾谷類的組織培養(yǎng)[4]。本研究中，通過N6和MS兩種培養(yǎng)基篩選，確定了緊穗野生稻幼胚愈傷組織誘導(dǎo)以N6為基本培養(yǎng)基效果較好，出愈率高，愈傷顆粒緊實。這與張智奇等認為N6培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更有效地促進水稻幼穗的愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的結(jié)果一致[5]。張堯忠等的研究結(jié)果也表明，愈傷組織在N6分化培養(yǎng)基的再生綠苗率高于MS培養(yǎng)基[6]。

圖6 緊穗野生稻幼胚生根培養(yǎng)

表3 不同NAA和IAA濃度下緊穗野生稻幼胚生根苗的生長情況

3.2 激素對緊穗野生稻幼胚誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響水稻胚性愈傷組織誘導(dǎo)和形成的關(guān)鍵因素之一，其中2,4-D是誘導(dǎo)水稻愈傷組織不可缺少的關(guān)鍵激素。不同植物外植體對2,4-D的濃度要求不同[7-8]。通過對7組不同濃度梯度的2,4-D比對發(fā)現(xiàn)，5.0 mg/L對緊穗野生稻胚性愈傷誘導(dǎo)最強，出愈率最高達到100 %。以2,4-D濃度為3.0 mg/L時用于愈傷繼代培養(yǎng)較好。以2,4-D濃度為6.0 mg/L時用于愈傷增殖培養(yǎng)較好。2,4-D濃度過低和過高對胚芽啟動效果很差，選擇適宜的濃度比才是突破胚芽萌發(fā)的關(guān)鍵。

3.3 激素對緊穗野生稻幼胚分化成苗產(chǎn)生的影響

植物生長調(diào)節(jié)劑是影響愈傷組織再分化的關(guān)鍵性因素之一，細胞分裂素在組織培養(yǎng)中促進細胞分裂和分化，可促進植物細胞的分裂和不定芽的形成，打破頂端優(yōu)勢形成叢生芽，有利于芽的增殖和繼代培養(yǎng)[9-11]。6-BA是誘導(dǎo)水稻愈傷組織再生植株時常用的細胞分裂素[12]。周玲艷等認為，6-BA有利于水稻愈傷組織的分化[13]。本實驗結(jié)果表明：添加6-BA 4.0 mg/L，愈傷綠色凸起最多、分化最繁盛。選擇生長素NAA與一定比例的細胞分裂素誘導(dǎo)腋芽及不定芽的產(chǎn)生，也是相符合的[14]。王力等[15]研究表明：6-BA促進分化而不利于成苗，添加KT、ZT促進成苗而不利于分化。本文通過實驗證明：選擇6-BA、NAA、KT、ZT多激素搭配和最適合的濃度配比，不僅愈傷綠色凸起增多、分化繁盛 ，而且苗油綠，莖稈粗，叢生芽、叢生苗增多，新愈傷長出。實驗得出：利用生長素和幾種細胞分裂素進行最適合的比例配合使用，用來作為緊穗野生稻幼胚分化改良培養(yǎng)基，成功將幼胚愈傷分化出健壯油綠的再生苗和叢生苗，并使分化率得到大幅提高。不同的品種材料在選擇基本培養(yǎng)基及激素搭配和比例配比時，必須對癥下藥，方可見效，以免適得其反。

3.4 激素對緊穗野生稻幼胚生根苗產(chǎn)生的影響

眾所周知，作為生長素的NAA和IAA，其主要作用是誘導(dǎo)愈傷組織的形成、胚狀體的產(chǎn)生以及試管苗的生根，本實驗對NAA和IAA各設(shè)置了9組梯度濃度比較，實驗結(jié)果得出：以IAA 0.3 mg/L對根芽啟動效果最好，對促進主根根粗、主根生長、須根出根率、須根長具有顯著效果。

3.5 煉苗與栽種及田間管理

實驗結(jié)果表明：生根苗從揭膜、定植、煉苗到栽種，經(jīng)歷39 d，由組培苗過渡到自然生長苗，從無菌狀態(tài)變成有菌狀態(tài)，這樣一個循序漸進的過程，苗的田間成活率達到98%。苗在田間的生長過程中，注意水、肥管理及病蟲害防治，后期追施一次肥，直至種子成熟。在本研究中，通過對緊穗野生稻幼胚愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)，篩選出最適合的N6基本培養(yǎng)基，選擇最適宜的激素組合，根據(jù)不同生長時期的要求來確定激素配比和培養(yǎng)基配方，成功地建立起一套高效高質(zhì)量的緊穗野生稻幼胚愈傷誘導(dǎo)、分化、生根培養(yǎng)基的再生體系，并將改良后的培養(yǎng)基在實踐中得到充分應(yīng)用，取得較好效果；突破了野生稻離體保存的關(guān)鍵技術(shù)，為野生稻的培育奠定了扎實基礎(chǔ)。