高其忠， 高 翔， 劉 芬， 葛曉松*

1. 江南大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，無(wú)錫 214062 2. 江南大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，無(wú)錫 214062 3. 江南大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤研究所，無(wú)錫 214062

胃癌(gastric cancer，GC)是消化系統(tǒng)高發(fā)腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率已分別躍居癌癥相關(guān)第4位和第2位[1]。我國(guó)每年新增近68萬(wàn)GC患者[2-3]，約占全世界GC新發(fā)病例的一半；同時(shí)，我國(guó)每年大約49.8萬(wàn)人死于GC。GC患者5年存活率非常低[4-6]，超過(guò)80%的病例在診斷時(shí)已是晚期[7-8]。盡管我國(guó)GC患者年齡標(biāo)準(zhǔn)化的死亡率近年來(lái)降低[9]，但是其仍然嚴(yán)重威害患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因此，亟需闡明GC的發(fā)病機(jī)制，尋找可以診斷GC惡性腫瘤的標(biāo)志分子和預(yù)測(cè)患者存活的預(yù)后預(yù)測(cè)因子。

C19orf28也稱PP3501、MFSD12，是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤相關(guān)基因[10]。目前，關(guān)于C19orf28蛋白表達(dá)與GC預(yù)后和生存的相關(guān)性鮮見(jiàn)報(bào)道。本文擬通過(guò)免疫組化(IHC)方法，探討C19orf28是否可以作為GC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 納入2013-12-31至2014-12-30在江南大學(xué)附屬醫(yī)院(無(wú)錫市第四人民院)進(jìn)行根治性手術(shù)的141例GC石蠟樣本及其癌旁組織樣本(距癌組織5 cm)。141例患者中，男性112例，女性29例；年齡34～84歲，平均年齡65歲；高/中分化腺癌32例，中低/低分化腺癌109例；TNM Ⅰ～Ⅱ期25例、Ⅲ～Ⅳ期116例，N049例、N1～392例。患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)原發(fā)灶標(biāo)本為GC，所有標(biāo)本術(shù)后均經(jīng)2名病理醫(yī)師復(fù)核證實(shí)；(2)術(shù)前未接受放、化療；(3)有完整的臨床、病理和隨訪資料；(4)死亡原因僅為腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。本研究經(jīng)江南大學(xué)附屬醫(yī)院(無(wú)錫市第四人民院)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意；患者知情同意并填寫(xiě)知情同意書(shū)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 C19orf28多克隆抗體(Cat：bs-9680R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，組織芯片空白蠟塊(UNITMA Quick-Ray UB06-1, 韓國(guó))，GTVesionTM Ⅲ 抗鼠/兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒[GK500705，基因科技(上海)股份有限公司]。

1.3 免疫組化檢測(cè)結(jié)腸癌組織中C19orf28蛋白表達(dá) 采用細(xì)針打孔方法，分別選取141例胃癌組織及癌旁組織蠟塊中的1 mm圓柱形癌組織或者癌旁組織，制備組織芯片蠟塊。切片并轉(zhuǎn)移到免疫組化專用載玻片上制成組織芯片。IHC染色步驟如下：常規(guī)脫蠟水化；0.01 mol/L檸檬酸納緩沖液(pH 6.0)進(jìn)行熱修復(fù)10 min；3%雙氧水室溫孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性；滴加C19orf28多克隆抗體(1∶600)，4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次，每次3 min；滴加A液，室溫孵育30 min，PBS沖洗；滴加新鮮配制的DAB工作液，室溫孵育5～10 min；蘇木精復(fù)染；無(wú)水乙醇脫水封片。以PBS液替代一抗或二抗作為陰性對(duì)照。

1.4 染色結(jié)果判斷 C19orf28陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)，其表達(dá)按染色強(qiáng)度評(píng)為：無(wú)(0分)、弱(1分)、中(2分)和強(qiáng)(3分)；按陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)為：<1%(1分)、1%～10%(1分)、10%～33%(3分)、33%～67%(4分)，>67%(5分)。總體評(píng)分值=染色強(qiáng)度+陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分，評(píng)分：≤2分為低表達(dá)；>2分為高表達(dá)。結(jié)果由病理科2位醫(yī)師獨(dú)立雙盲讀片評(píng)定。

1.5 隨 訪 對(duì)全部患者進(jìn)行術(shù)后定期隨訪，記錄其完整的臨床相關(guān)資料，隨訪截止日期為2018年10月31日。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 16.0進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Kaplan-Meier方法分析，影響生存的多因素分析采用Cox回歸方法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 C19orf28在GC組織中的表達(dá) IHC結(jié)果(圖1)顯示：所測(cè)GC組織均C19orf28蛋白陽(yáng)性(陽(yáng)性率為100%)，癌旁組織均未檢測(cè)到C19orf28蛋白；GC組織C19orf28陽(yáng)性評(píng)分為(1.972±0.675)分，與癌旁組織差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 C19orf28在胃癌組織中的表達(dá)

A：GC組織C19orf28 染色強(qiáng)；B: GC組織及癌旁組織IHC評(píng)分比較. Original magnification: ×400；**P<0.01

2.2 GC組織C19orf28表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn)：C19orf28低表達(dá)患者(N=98)與C19orf28高表達(dá)患者(N=43)性別、神經(jīng)和(或)脈管侵犯、TNM分期、人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(HER2)表達(dá)、腫瘤分化程度、腫瘤細(xì)胞增殖狀態(tài)(Ki67)等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 C19orf28表達(dá)與患者臨床病理特征的相關(guān)性

HER2:人類表皮生長(zhǎng)因子受體2

2.3 不同C19orf28表達(dá)患者的生存分析 結(jié)果(圖2)顯示：C19orf28高表達(dá)患者OS短于C19orf28低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000 3)。C19orf28蛋白高表達(dá)患者平均生存期(23.40個(gè)月)短于C19orf28低表達(dá)患者平均生存期(38.35個(gè)月)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖2 C19orf28高表達(dá)患者與低表達(dá)患者的Kaplan-Meier生存曲線

2.4 Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析GC患者的生存危險(xiǎn)因素 Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析結(jié)果(表2)顯示：C19orf28表達(dá)、局部浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、M分期、神經(jīng)和(或)脈管侵犯與GC患者預(yù)后相關(guān)(P<0.05)；C19orf28表達(dá)(HR=2.34, 95% CI 1.30～4.21,P=0.005)是GC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。

表2 Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型生存分析

3 討 論

C19orf28是一種多次跨膜蛋白，屬于主要的促進(jìn)子超家族(the major facilitator superfamily，MFS)。MFS超家族是生物圈中發(fā)現(xiàn)的最大的二級(jí)載體超家族[11]，對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收和腎臟清除過(guò)程中化合物穿過(guò)生物膜起重要作用。編碼C19orf28蛋白的基因位于19號(hào)染色體；由于可變剪接事件，C19orf28蛋白有兩種蛋白亞型。19號(hào)染色體全長(zhǎng)大約6 300萬(wàn)個(gè)堿基，包括1 400多個(gè)基因，約占人類基因組DNA的2%。19號(hào)染色體具有人染色體的最大基因密度，是多種免疫球蛋白超家族成員的遺傳家園，包括殺傷細(xì)胞和白細(xì)胞Ig樣受體、細(xì)胞間黏附分子(ICAMs)、癌胚抗原相關(guān)的細(xì)胞黏附分子(CEACAM)和妊娠特異性糖蛋白家族(PSG)以及Fc受體等。眼睛顏色和頭發(fā)顏色、膚色的關(guān)鍵基因也位于19號(hào)染色體。C19orf28與歐亞大陸人色素沉著、非洲人色素沉著相關(guān)[12-13]，以及與馬的蘑菇毛色[14]、小鼠的灰色毛色[12]和狗的白色毛色[15]有關(guān)。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)C19orf28具有癌基因功能。Wei等[10]發(fā)現(xiàn)，黑素瘤中異常表達(dá)的C19orf28通過(guò)激活PI3K信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；高表達(dá)C19orf28是黑素瘤患者OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。Wang等[16]也證明，丁酸鈉處理神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞后顯著誘導(dǎo)pp3501 (C19orf28)上調(diào)，而pp3501 (C19orf28)抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖，使細(xì)胞周期停滯于G1期。然而，C19orf28是否在胃癌中扮演重要角色目前還不確定。

本研究首次通過(guò)IHC方法證明C19orf28與GC患者預(yù)后顯著相關(guān)。C19orf28蛋白在GC癌組織中高表達(dá)(陽(yáng)性率為100%)。盡管C19orf28蛋白高表達(dá)患者與C19orf28低表達(dá)患者的臨床病理特征不存在有意義的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是，C19orf28高表達(dá)患者OS顯著短于C19orf28低表達(dá)患者OS(P=0.000 3)；C19orf28高表達(dá)患者平均生存期(23.40個(gè)月)顯著短于C19orf28低表達(dá)患者平均生存期(38.35個(gè)月，P<0.01)。Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型顯示，C19orf28表達(dá)是GC患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。因此，C19orf28蛋白表達(dá)在預(yù)測(cè)GC患者預(yù)后中有一定的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本研究通過(guò)IHC方法檢測(cè)GC組織及癌旁組織中C19orf28蛋白的表達(dá)，并結(jié)合患者臨床病理特征及隨訪患者預(yù)后情況，證實(shí)了高表達(dá)C19orf28可能是GC患者不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。