傅維佳, 胡曉霞， 王麗炳， 黃愛杰， 高 磊， 倪 雄， 陳 莉， 章衛(wèi)平， 王健民， 楊建民

海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院血液科，中國人民解放軍血液病研究所，上海 200433

費城染色體陽性急性淋巴細(xì)胞白血病(philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia, Ph+ALL)是一種伴重現(xiàn)性細(xì)胞遺傳學(xué)異常的急性淋巴細(xì)胞白血病，發(fā)病率隨年齡增長而升高，在兒童急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)中占5%[1]，在成人ALL中約占25%[2]。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)聯(lián)合化療緩解率達(dá)90%；患者經(jīng)TKI治療后總生存率為40%～60%[2-3]。隨著TKI使用時間延長，可發(fā)生耐藥，而ABL激酶區(qū)突變是TKI耐藥最常見的原因，已報道的突變類型超過100種[4-7]。而國內(nèi)報道多集中在TKI耐藥的慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia, CML)[4-5]。本研究回顧性分析了我中心收治的38例發(fā)生TKI耐藥的Ph+ALL患者的臨床特征、預(yù)后、分子遺傳學(xué)以及ABL激酶區(qū)突變的特征，并探討異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)在TKI耐藥Ph+ALL患者中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本中心2010年1月至2019年3月收治Ph+ALL患者共99例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2016版WHO造血與淋巴組織腫瘤分類[8]，除外混合表型急性白血病及CML急性淋巴細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)變。99例患者中，發(fā)生TKI耐藥38例。

1.2 分子生物學(xué)檢測 BCR/ABL融合基因檢測：采用實時熒光定量PCR技術(shù)(RQ-PCR)檢測BCR/ABL P190和P210的轉(zhuǎn)錄本水平。ABL激酶區(qū)突變檢測：早期采用RQ-PCR檢測ABL激酶區(qū)突變；后期應(yīng)用二代測序技術(shù)(NGS)，采用Ion Torrent測序平臺對ABL激酶區(qū)相關(guān)的基因突變進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域PCR富集和高通量測序。

1.3 治療方法 誘導(dǎo)和鞏固治療方案以Hyper-CVAD/MA(環(huán)磷酰胺+蒽環(huán)類+長春堿+地塞米松/甲氨蝶呤+阿糖胞苷)和CHALL-01方案為主，共8個療程。CHALL-01方案是以VDP(長春堿+柔紅霉素+地塞米松)為基礎(chǔ)制定的化療方案，包括誘導(dǎo)化療、6個療程鞏固治療(Block 1～6)及維持治療三部分(表1)。采用三聯(lián)藥物(甲氨蝶呤+阿糖胞苷+地塞米松)鞘內(nèi)注射預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)白血病。

至少鞏固2個療程后，僅接受化療的患者采用POMP(長春新堿+6-巰基嘌呤+甲氨蝶呤+強(qiáng)的松)維持治療2年，并長期口服TKI；有合適供體時行allo-HSCT，預(yù)處理和預(yù)防移植物抗宿主病(GVHD)方案見參考文獻(xiàn)[9-10]。接受allo-HSCT者從移植后第3個月開始，血小板計數(shù)>50×109/L且中性細(xì)胞絕對值>1×109/L時開始使用TKI，1年后停用。

表1 CHALL-01 方案

所有Ph+ALL患者均在診斷1周內(nèi)給予TKI治療，根據(jù)血液學(xué)不良反應(yīng)調(diào)整劑量。出現(xiàn)TKI耐藥時，換用其他TKI，并行ABL激酶區(qū)突變檢測，同時進(jìn)行骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)檢測。

1.4 評估指標(biāo) 療效評估標(biāo)準(zhǔn)參見文獻(xiàn)[11-12]。完全分子學(xué)緩解(complete molecular remission，CMR)：BCR/ABL融合基因檢測為陰性；主要分子學(xué)緩解(major molecular remission，MMR)：BCR/ABL融合基因拷貝數(shù)較基線下降3個數(shù)量級或以上，但是不符合CMR標(biāo)準(zhǔn)?？偵嫫?overall survival，OR)2指從發(fā)現(xiàn)TKI耐藥日至患者死亡日或隨訪截止日期。無復(fù)發(fā)生存期(relapse free survival, RFS)2指TKI原發(fā)耐藥的患者達(dá)完全緩解(complete remission，CR)日至第1次復(fù)發(fā)、死亡或隨訪截止之日，或失去MMR或CMR的患者再次達(dá)到MMR或CMR日至第2次復(fù)發(fā)、死亡或隨訪截止之日，或血液學(xué)復(fù)發(fā)的患者再次達(dá)到CR日至第2次復(fù)發(fā)、死亡或隨訪截止。

TKI耐藥診斷標(biāo)準(zhǔn)[13-14]：當(dāng)患者出現(xiàn)下述表現(xiàn)之一即診斷為TKI耐藥：(1)用藥后3個月未達(dá)到CR(原發(fā)耐藥)；(2)失去MMR或CMR；(3)血液學(xué)復(fù)發(fā)。

1.5 隨 訪 主要采用病案查詢、門診及電話進(jìn)行隨訪。所有患者隨訪至2019年5月31日，中位隨訪時間為55(3～109)個月。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。連續(xù)變量采用秩和檢驗，分類變量采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗并繪制生存曲線。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 患者一般特征 結(jié)果(表2)顯示：99例Ph+ALL患者中，男性54例(54.55%)、女性45例(45.45%)，診斷時中位年齡44(14～76)歲，中位白細(xì)胞計數(shù)(WBC) 39.7(1.3～329.0)×109/L，中位血紅蛋白(HGB) 98(30～174)g/L，中位血小板計數(shù)(PLT) 41(1～316)×109/L。86例患者有核型數(shù)據(jù)，其中伴有附加染色體異常29例(29/86，33.72%)。P190陽性69例(69/99，69.70%)，P210陽性30例(30/99，30.30%)。

TKI耐藥的Ph+ALL患者共38例(38/99，38.38%)，初診時WBC較未耐藥組高(P=0.014)；耐藥組與未耐藥組患者性別、年齡，初診時HGB、PLT、骨髓原始細(xì)胞比例、染色體核型、BCR/ABL融合基因、移植情況等差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 預(yù)后分析

2.2.1 患者總體預(yù)后 所有Ph+ALL患者均在診斷1周內(nèi)給予TKI治療，其中95例予伊馬替尼，起始劑量400 mg/d，4例予達(dá)沙替尼，起始劑量100 mg/d，根據(jù)血液學(xué)不良反應(yīng)調(diào)整劑量。1～2個誘導(dǎo)療程的CR率為91.92%(91/99)；50例患者(50.51%)3個月內(nèi)達(dá)到MMR，34例(34.34%)達(dá)到CMR。99例患者的中位OS為33.8(0.6～106.5)個月，5年OS率為(49.0±5.4)%。91例CR患者中位RFS為15.8(0.3～105.9)個月，5年RFS率(40.6 ±5.8)%。至隨訪截止日期共47例患者死亡，主要死亡原因為疾病復(fù)發(fā)(21例，44.68%)、感染(8例，17.02%)。

2.2.2 耐藥患者預(yù)后 結(jié)果(圖1)顯示：38例TKI耐藥患者的中位耐藥時間為治療后8(1～64)個月，其中31例同時出現(xiàn)血液學(xué)復(fù)發(fā)。4例患者(10.53%)伊馬替尼原發(fā)性耐藥；28例患者(73.68%)在鞏固治療過程中出現(xiàn)耐藥(26例伊馬替尼，2例達(dá)沙替尼)；6例患者(15.79%)移植后出現(xiàn)伊馬替尼耐藥且疾病復(fù)發(fā)。

2.2.3 耐藥組與非耐藥組患者預(yù)后比較 結(jié)果(表2)顯示：TKI耐藥組患者3個月內(nèi)達(dá)到MMR者占34.21%(13/38)，顯著低于未耐藥組(60.66%，37/61；P=0.010)。結(jié)果(圖2)顯示：TKI耐藥組與未耐藥組的中位OS率分別為22個月和未達(dá)到，預(yù)計5年OS分別為(34.2±8.0)%和(61.4±6.7)%(P=0.044)；TKI耐藥組與未耐藥組中位RFS分別為8個月和未達(dá)到，預(yù)計5年RFS率分別為(6.7±4.5)%和(68.6±6.8)%(P<0.001)。

2.2.4 耐藥組移植與未移植患者預(yù)后比較 結(jié)果(圖3)顯示：32例患者移植前發(fā)生TKI耐藥，其中13例接受allo-HSCT，移植患者與未移植患者中位OS2率分別為未達(dá)到和3個月(P<0.001)。移植后患者全部達(dá)到血液學(xué)CR，其中10例達(dá)到CMR，CR與CMR患者中位RFS2率分別為未達(dá)到和16個月。移植患者與未移植患者的1年OS2率分別為(68.4±13.1)%和(17.8±9.2)%(P<0.001)，PFS2率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 Ph+ALL患者一般情況

實驗室指標(biāo)均為初診時數(shù)據(jù). WBC：白細(xì)胞計數(shù)；HGB：血紅蛋白；PLT：血小板計數(shù)；MMR：完全分子緩解；CMR：部分分子緩解

圖1 TKI耐藥Ph+ALL患者的治療過程

圖2 Ph+ALL患者的生存曲線

圖3 TKI耐藥患者的生存曲線

2.3 TKI耐藥Ph+ALL患者ABL激酶區(qū)突變分布 結(jié)果(表3)顯示：38例患者中，20例(52.63%)存在ABL激酶區(qū)突變，共10個位點12種突變類型。9例患者發(fā)現(xiàn)T315I突變，占突變患者的45.00%，其次為E255K/V和Y253H/F，分別占突變患者的40.00%(8/20)和15.00%(3/20)。4例患者(4/20，20.00%)同時檢測出多重突變(出現(xiàn)1種以上ABL激酶區(qū)突變)。

T315I突變的9例患者中，1例患者于誘導(dǎo)化療過程中同時出現(xiàn)T315I和E255K突變，CART-19細(xì)胞免疫治療后達(dá)血液學(xué)CR，行allo-HSCT；1例患者于鞏固化療過程中發(fā)生T315I突變，采用HVP(高三尖杉酯堿+長春地辛+地塞米松)方案化療后再次血液學(xué)CR，后行allo-HSCT，持續(xù)隨訪；余7例患者均復(fù)發(fā)死亡。T315I突變組(9例)與未發(fā)生T315I突變組(29例)3年OS分別為(14.8±13.3)%和(39.3±9.2)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.739)。

表3 20例ABL激酶區(qū)突變Ph+ALL患者的突變分布

3 討 論

TKI是治療Ph+ALL和CML重要的靶向藥。目前國內(nèi)常用的TKI包括一代TKI伊馬替尼、二代TKI尼洛替尼和達(dá)沙替尼。TKI可能的耐藥機(jī)制包括：(1)BCR/ABL依賴機(jī)制，即ABL激酶區(qū)突變[6-7]、BCR/ABL融合基因的過表達(dá)和擴(kuò)增[15]；(2)BCR/ABL非依賴機(jī)制，即激活替代信號通路，如Scr激酶家族[16]、克隆演化[17]；(3)藥物的吸收與外排機(jī)制，即人類有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運蛋白1(hOCT-1)介導(dǎo)的藥物內(nèi)流減少[18]、多藥耐藥基因(MDR1)介導(dǎo)的藥物外流增加[19]；(4)呈相對靜止?fàn)顟B(tài)的白血病干細(xì)胞介導(dǎo)的耐藥等[20]。

伊馬替尼耐藥的Ph+ALL患者中約70%可檢測到ABL激酶區(qū)突變，目前發(fā)現(xiàn)與耐藥有關(guān)的突變超過100種，其中T315I突變發(fā)生率最高[13-14]。研究[13]對189例發(fā)生伊馬替尼耐藥的Ph+ALL患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)69.3%(131/189)檢測出ABL激酶區(qū)突變，其中T315I突變占突變患者的37.4%(49/131)，其次為E255K和Y253H，均為19.08%(25/131)；10.69%(14/131)出現(xiàn)多重突變。本組38例TKI耐藥Ph+ALL患者中，共檢測到52.63%(20/38)發(fā)生ABL激酶區(qū)突變，其中T315I突變比例最高，占突變患者的45.0%(9/20)，其次為E255K/V 40.0%(8/20)和Y253H/F 15.0%(3/20)。本組檢測出的ABL激酶區(qū)突變比例較以往研究報道稍低。造成該差異的原因可能為：一方面可能由于本中心早期采用RQ-PCR技術(shù)檢測ABL激酶區(qū)突變，共檢測6個位點13種突變類型(Y253H、E255K/V、V299L、T315A/I、F317V/I/C/L、F359V/C/L)，突變檢出率較低；另一方面可能由于國外研究中多對已經(jīng)復(fù)發(fā)的患者進(jìn)行ABL激酶區(qū)突變檢測，與本組患者的納入標(biāo)準(zhǔn)不一致。

聯(lián)合TKI治療使Ph+ALL的療效得到顯著提高，CR率達(dá)91.92%，3個月內(nèi)達(dá)到MMR達(dá)50.51%，5年OS率(49.0±5.4)%，5年RFS (40.6 ±5.8)%，與國外報道[2-3]相似。發(fā)生TKI耐藥的患者預(yù)后較未耐藥者顯著下降(P<0.001)?；颊甙l(fā)生TKI耐藥后接受allo-HSCT亞組與未移植亞組1年OS2率分別為(68.4±13.1)%和(17.8±9.2)%(P<0.001)。國內(nèi)也有學(xué)者[21]報道，當(dāng)患者發(fā)生ABL激酶區(qū)突變后行allo-HSCT組中位OS為29個月，顯著較單純化療聯(lián)合TKI組長(17個月，P=0.034)。該結(jié)果表明，發(fā)生TKI耐藥后，allo-HSCT是可靠的治療選擇。

本組4例(4/20，20%)患者同時檢測出多重突變，且多伴有T315I突變。本研究中T315I突變患者(9例)與未發(fā)生T315I突變患者(29例)3年OS率分別為(14.8±13.3)%和(39.3±9.2)%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與部分患者接受了CART治療和入組病例數(shù)較少有關(guān)。既往有報道指出高三尖杉酯堿通過下調(diào)抗凋亡蛋白髓細(xì)胞白血病因子-1(MCL-1)的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且不依賴BCR/ABL機(jī)制[22]。本組中2例患者于鞏固治療過程中疾病復(fù)發(fā)，1例合并多重突變(T315I、E255K、E255V、E355G)，Ponatinib聯(lián)合HVP方案化療未達(dá)CR，于骨髓抑制期因合并肺部感染死亡；1例合并T315I突變，HVP方案化療再次CR后行allo-HSCT，持續(xù)隨訪。對于含T315I突變的患者，高三尖杉酯堿或許是一種治療選擇，但仍需要積累更多的經(jīng)驗。Ponatinib能抑制所有攜帶ABL激酶區(qū)單一突變(包括T315I突變)的BCR/ABL酪氨酸激酶活性，是美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)認(rèn)證的唯一對T315I敏感的TKI藥物[23]。而Ponatinib對不同復(fù)合突變的療效不一，T315I和E255V的復(fù)合突變對ponatinib高度耐藥[23-24]。本組1例多重突變(T315I、E255K、E255V、E355G)患者Ponatinib治療失敗，可能與同一克隆的復(fù)合突變及基因組的穩(wěn)定性進(jìn)一步減弱有關(guān)，其機(jī)制還需更深入的研究。此外，Zabriskie等[24]報道了1例伴T315I突變的Ph+ALL患者的治療過程，予ponatinib治療后獲得完全細(xì)胞遺傳學(xué)應(yīng)答，但7個月后病情進(jìn)展，ABL激酶區(qū)突變檢測發(fā)現(xiàn)I315M突變。

本研究表明，Ph+ALL患者不同ABL激酶區(qū)突變具有不同水平的TKI抗性，檢測對TKI耐藥的突變對確定新的治療策略至關(guān)重要。發(fā)生TKI耐藥時，allo-HSCT是可靠選擇，在部分病例中還可以選擇細(xì)胞免疫治療，包括CART、單克隆抗體、雙特異性抗體、抗腫瘤藥物與單克隆抗體螯合制劑治療等[25]以優(yōu)化臨床結(jié)果，但仍需要更多的臨床研究證實。此外，ABL激酶區(qū)突變并不能解釋所有TKI耐藥機(jī)制，其耐藥機(jī)制有待進(jìn)一步研究。