鄧 巍,王家亮,劉李蕾,房以好,劉碩然,楊曉燕,*,肖 文

1 大理大學東喜瑪拉雅研究院, 大理 671003 2 阜陽市人民醫(yī)院醫(yī)院感染管理科, 阜陽 236000 3 大理大學農(nóng)學與生物科學學院, 大理 671003 4 云南省高校洱海流域保護與可持續(xù)發(fā)展研究重點實驗室, 大理 671003

微生物是一類重要的生物類群,是地球各生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)的紐帶,并在土壤圈、生物圈、大氣圈、水圈、巖石圈生物地球化學循環(huán)中扮演著不可或缺的角色[1- 4]。長期以來,人們認為微生物是呈隨機分布的[5- 6],但隨著研究的深入人們發(fā)現(xiàn)微生物類群的分布特征與其所處生境的空間異質(zhì)性呈相關關系,微生物存在空間分布并受到環(huán)境篩選作用的影響[7]。此前關于微生物空間分布格局是由當代環(huán)境條件(溫度、降水、光照、土壤養(yǎng)分和pH)還是歷史因素(地理阻隔、物理屏障、擴散限制等)決定的爭論,一直存在很大的分歧。如今的研究普遍開始認為環(huán)境條件和歷史因素共同決定微生物的分布格局,但兩者的相對貢獻率仍存在很多爭議[8- 11],對微生物空間分布的驅(qū)動機制也仍未有清晰的定論。

坡向是十分重要的地理地形因子,也是影響生物群落空間分布的重要因素,坡向通過影響地面接收太陽輻射以及地面與盛行風的交角導致光、熱、水、土壤礦物質(zhì)等環(huán)境因子產(chǎn)生差異[12]。這些環(huán)境因子差異導致不同坡向間形成微型氣候梯度,生物群落結構的漸變也隨之產(chǎn)生[13]。目前坡向?qū)ι锶郝浞植几窬钟绊懙难芯恐饕杏谥参镱惾?微生物類群的研究較少,僅有少量學者對土壤細菌和叢枝根菌進行過描述性的報道,已有研究大都基于單一尺度坡向開展[14- 15]。

捕食線蟲真菌是一類既可以營腐生生活又可以營養(yǎng)菌絲特化形成捕食器官(產(chǎn)黏性菌網(wǎng)的Arthrobotrys屬,產(chǎn)黏性球、黏性分枝的Dactylellina屬,產(chǎn)收縮環(huán)的Drechslerella屬)來捕捉線蟲的兼性菌。由于這類真菌在形態(tài)和功能上的特殊性以及在線蟲生物防治中的潛在價值,一直受到國內(nèi)外真菌學研究者的重視,并已經(jīng)在菌種資源、分類、生態(tài)、分子與遺傳、生理生化和生防菌劑開發(fā)與應用等方面開展了系統(tǒng)的研究[16]。研究資料顯示捕食線蟲真菌廣泛分布于全球的土壤、水體和動物腸道甚至溫泉等各類生境中[17]。由于捕食線蟲真菌分離和純化較為容易,種類較少(共3屬,97種),形態(tài)差異明顯易于觀察和鑒定[16],因此捕食線蟲真菌是研究微生物分布格局的理想對象。

鑒于微生物空間分布格局形成的機制尚不清晰,坡向尺度差異對微生物分布格局的影響尚不明確,本次研究以環(huán)境異質(zhì)性較強、坡向尺度多樣的大理蒼山為研究區(qū)域,以捕食線蟲真菌為研究對象,探究不同尺度坡向?qū)Σ妒尘€蟲真菌空間分布格局的影響。研究結果將有助于對微生物分布格局理論的完善,促進對微生物多樣性分布格局形成和維持機制的理解,同時也有利于捕食線蟲真菌資源的系統(tǒng)調(diào)查和種質(zhì)資源的充分挖掘。

1 研究方法

1.1 研究區(qū)域

蒼山地處99°54′30″—100°12′12″E和25°33′30″—25°59′48″N之間,由十九座山峰自北而南組成。自北而南的主要走向?qū)⑸n山劃分為東、南、西、北 4個主要坡向,同時十九峰中每一座山峰也將其劃分為南、北兩個次級坡向。蒼山位于國家級自然保護區(qū)屬橫斷山脈云嶺山系,處于南亞熱帶和中亞熱帶的交匯處,形成了明顯的垂直地帶性和東西差異性[18- 19]。蒼山東西坡氣溫有明顯差異,形成一山分四季,十里不同天的氣候特征,其植被類型多樣,生物多樣性極為豐富、獨特,并具有明顯的植物垂直分布帶譜[20],使蒼山成為南北生物交匯過渡帶,以及生物的分布和分化中心,為生物多樣性最為豐富的地區(qū)之一。

本研究在大理蒼山東、西坡向上的次級南、北坡向展開(圖1)。

圖1 采樣點地圖Fig.1 Sampling point map

1.2 樣品采集

土樣采自大理蒼山東、西坡及其次級南、北坡4個坡向的裸露區(qū)。以海拔2100 m為起始每升高100 m設置一個采樣點直至3500 m,共設置60個采樣點。每個采樣點對角線5點取樣(5—30 cm深土層)充分混勻取約200 g裝于塑料封口袋,帶回實驗室低溫密封保存。共采集300份土樣,其中東、西坡分別采集150份土樣,次級南、北坡各75份。

1.3 培養(yǎng)基的制備

參照文獻[21],配制玉米瓊脂培養(yǎng)基(Corn meal agar medium，CMA),用于分離捕食線蟲真菌；土豆培養(yǎng)基(Potato dextrose agar medium，PDA),用于菌株測序時的富營養(yǎng)培養(yǎng)。

1.4 誘餌線蟲的制備

用貝爾曼氏法制備全齒復活線蟲(Panagrellusredivivus)幼蟲懸液(每毫升約含線蟲5000條)備用[17]。

1.5 分離純化

誘餌平板法[21]：在CMA平板上撒入0.5—1 g土樣,加入約5000條誘餌線蟲。每份樣品設置3個平行,再將平板放置于(25±2)℃的環(huán)境中進行培養(yǎng)。三周后使用體視顯微鏡開始鏡檢,同時使用無菌牙簽轉(zhuǎn)接捕食線蟲真菌單個分生孢子到60 mm CMA平板上,置于(26.5±1)℃溫箱中培養(yǎng)7 d,如此重復3—5次,直至捕食線蟲真菌純培養(yǎng)物的獲得。

1.6 捕食線蟲真菌形態(tài)觀察和捕食器官的誘導

用透明膠帶黏取捕食線蟲真菌孢子和孢子梗,放置在滴有呂氏美藍染色液的載玻片上,加蓋蓋玻片,制成臨時裝片,顯微鏡(40×)下鏡檢,確定分生孢子和菌絲形態(tài)及分生孢子梗的類型。

用無菌刀在CMA培養(yǎng)基上挖一個2 cm×2 cm的觀察室,將菌株接入,(25±2)℃培養(yǎng)5—7 d,待菌絲長滿觀察室后加入誘餌線蟲,12—24 h后觀察捕食器官產(chǎn)生情況。

1.7 捕食線蟲真菌的鑒定

通過菌株形態(tài)特征及捕食器官類型進行形態(tài)學鑒定[21]。同時用PDA培養(yǎng)基富營養(yǎng)培養(yǎng),提取真菌總DNA并進行PCR擴增[22],將產(chǎn)物委托上海鉑尚生物技術有限公司進行純化和測序。通過ITS(Internal transcribed spacer region of the ribosomal RNA gene,核糖體RNA上的非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))和TUB(β-tubulin gene,微管蛋白編碼基因)基因序列同源性分析進行分子生物學鑒定[23]。結合形態(tài)學和分子生物學確定種屬。

1.8 數(shù)據(jù)處理

檢出率(Occurrence frequency, OF)=某個種出現(xiàn)的土樣數(shù)/總土樣數(shù)×100%。

總檢出率=檢出菌的土樣數(shù)/總的土樣數(shù)×100%。

式中,S為物種數(shù)目；N為所有物種的個體數(shù)之和；Ni為第i個種個體數(shù)量。

非參數(shù)檢驗(Nonparametric tests)：以200 m為梯度將研究區(qū)域分為4個海拔段,對各坡向捕食線蟲真菌物種數(shù)進行非參數(shù)檢驗。

運用EXCEL和SPSS對原始數(shù)據(jù)進行整理分析。

2 實驗結果

2.1 不同坡向捕食線蟲真菌的物種組成與分布

本次研究于蒼山共分離和鑒定出3屬12種57株捕食線蟲真菌,其中蒼山東坡共分離到2屬8種24株,次級南、北坡分別分離到8種15株和5種9株；在西坡共分離到3屬11種33株,次級南、北坡分別分離到8種19株和8種14株(圖2)。

西坡捕食線蟲真菌檢出數(shù)大于東坡,東、西坡的次級南坡捕食線蟲真菌檢出數(shù)大于次級北坡。產(chǎn)黏性菌網(wǎng)的Arthrobotrys屬和產(chǎn)黏性球、黏性分枝的Dactylellina屬在東、西坡及其次級南、北坡均有分布,但Arthrobotrys屬要分布于東坡,Dactylellina屬主要分布于西坡,而Drechslerella屬僅在西坡有分布(圖2)。

東坡的次級南、北坡少孢節(jié)叢孢(Arthrobotrysoligospora)檢出率高于其他種,為東坡的優(yōu)勢種,而橢圓單頂孢(Dactylellinaellipsosporum)在西坡的次級南、北坡的檢出率最高,為西坡的優(yōu)勢種。少孢節(jié)叢孢(A.oligospora)、彎孢節(jié)叢孢(Arthrobotrysmusiformis)、圓錐節(jié)叢孢(Arthrobotrysconoides)和橢圓單頂孢(Dac.ellipsosporum)坡向分布范圍最廣,其在東、西坡的次級南、北坡均有分布。紡錘單頂孢(Arthrobotrysfusiformis)的坡向分布范圍次之,其主要分布于東坡的次級南、北坡和西坡的次級北坡。掘氏單頂孢(Dactylellinadrechsleri)和細頸單頂孢(Dactylellinaparvicolle)主要分布于東、西坡的次級南坡。泡環(huán)單頂孢(Drechslerellaaphrobrochum)只分布于西坡。貴州節(jié)叢孢(Arthrobotrysguizhouensis)、強力節(jié)叢孢(Arthrobotrysrobusta)和小舟單頂孢(Arthrobotrysmicroscaphoide)要分布于西坡,其中強力節(jié)叢孢(A.robusta)和小舟單頂孢(A.microscaphoide)主要分布于西坡的次級南坡,貴州節(jié)叢孢(A.guizhouensis)主要分布于西坡的次級北坡。而奇妙單頂孢(Arthrobotrysthaumasium)主要分布于東坡的次級南坡(圖2)。

圖2 不同坡向捕食線蟲真菌的物種組成與分布Fig.2 Species composition and distribution of nematode-trapping fungi from different slopes Drechslerella：小掘氏孢屬；Dactylellina：亞隔指孢屬；Arthrobotrys：節(jié)叢孢屬；Dre.aphrobrochum：泡環(huán)單頂孢；Dac.parvicolle：細頸單頂孢；Dac.drechsleri：掘氏單頂孢；Dac. ellipsosporum：橢圓單頂孢；A. guizhouensis：貴州節(jié)叢孢；A. microscaphoide：小舟單頂孢；A. thaumasium：奇妙單頂孢；A. robusta：強力節(jié)叢孢；A. fusiformis：紡錘單頂孢；A. conoides：圓錐節(jié)叢孢；A. musiformis：彎孢節(jié)叢孢；A. oligospora少孢節(jié)叢孢

2.2 不同坡向捕食線蟲真菌的檢出率和多樣性指數(shù)

對不同坡向分布區(qū)的捕食線蟲真菌多樣性指數(shù)和檢出率進行比較,結果顯示西坡捕食線蟲真菌的檢出率、Shannon-Wiener指數(shù)均大于東坡。而對次級南、北坡進行比較,結果顯示次級南坡捕食線蟲真菌的檢出率、Shannon-Wiener指數(shù)均大于次級北坡(圖3)。

2.3 不同坡向間群落相似程度

蒼山東、西坡及其次級南、北坡間捕食線蟲真菌物種組成均存在差異性(Z=-1.98,P=0.046;Z=-2.38,P=0.017)。計算不同坡向Jaccard指數(shù),比較群落相似程度。結果顯示蒼山次級南、北坡間的群落差異大于東、西坡間(0.5<0.58)；西坡次級南、北坡間的群落差異最大(0.45)；東坡次級南坡與西坡次級南坡間Jaccard指數(shù)為0.54；東坡次級北坡與次級南坡(0.63)、東坡次級北坡與西坡次級北坡(0.71)間的群落較為相似。

圖3 各坡向捕食線蟲真菌的檢出率和多樣性指數(shù)Fig.3 Detection rate and diversity index of nematode-trapping fungi in different slopes

3 分析與討論

3.1 蒼山不同坡向捕食線蟲真菌分布差異

研究表明,坡向會在不同程度上影響土壤的溫度、含水量等理化性質(zhì)[24],其中土壤含水量在不同坡向上的變化最為明顯[25- 26],西坡的土壤含水量通常高于東坡[27],這種不同坡向上微小氣候的不同會導致土壤微生物生物量存在坡向差異[28]。本研究也發(fā)現(xiàn),蒼山東、西坡捕食線蟲真菌的物種豐富度和多樣性均是西坡大于東坡,東、西坡之間捕食線蟲真菌的分布存在差異。蒼山東坡屬于亞熱帶氣候類型,而西坡屬于中亞熱帶氣候類型。西坡立體氣候跨度比東坡大,氣候干濕季分明,雨量充沛,立體氣候明顯,年日照時數(shù)略大于東坡,月平均氣溫均高于東坡[19]。這種水、熱條件的差異是導致東、西坡上捕食線蟲真菌物種豐富度和物種多樣性不同的主要原因。同時,土壤微生物作為土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分循環(huán)的動力,能夠?qū)χ車沫h(huán)境變化迅速做出反應[29],因此,東、西坡向上水、熱條件的差異,勢必會導致不同坡向上土壤中微生物的種群結構發(fā)生改變。這種改變一方面會影響到其他生物種群如線蟲的群落結構,進而影響到捕食線蟲真菌的分布[30]；另一方面則會影響到土壤pH、營養(yǎng)元素(N、P、K)等,從而影響到土壤中的捕食線蟲真菌的種群結構[17]。

3.2 尺度效應與捕食線蟲真菌分布格局

自然界的所有格局和規(guī)律都具有尺度依賴性[31]。Hanson等通過比較一系列微生物生物地理分布格局發(fā)現(xiàn),空間尺度是導致微生物分布格局差異的主要誘因[32]。但是,在研究生物分布格局和生物多樣性時,選取不同的空間尺度所得到的結果存在差異,有的甚至截然相反[33- 35]。本研究結果表明,蒼山捕食線蟲真菌分布格局在較大尺度(東、西坡)和較小尺度(次級南、北坡)均存在差異；小尺度坡向間捕食線蟲真菌群落差異性更大。曹鵬等認為造成不同尺度微生物分布格局差異的原因是群落構建過程不同,在小尺度下擴散過程更容易發(fā)生[36]。這種擴散限制的改變導致小尺度捕食線蟲真菌群落構建過程發(fā)生改變,次級南、北坡間因此產(chǎn)生了更大的群落差異。因此小尺度坡向間地理屏障對捕食線蟲真菌分布格局的影響大于大尺度坡向間環(huán)境異質(zhì)性的作用。在研究捕食線蟲真菌分布格局以及生物多樣性形成和維持機制時,更應該關注諸如次級坡向這樣的小空間尺度。

3.3 坡向因子與群落構建

生態(tài)群落構建即生物多樣性形成和維持機制長期以來是生態(tài)學研究的核心?；诃h(huán)境篩選(確定性過程)的生態(tài)位理論和基于擴散限制(隨機性過程)的中性理論是解釋群落構建機制最為經(jīng)典的理論,同時也是最具有爭議性的理論。傳統(tǒng)的群落構建理論認為,像微生物這樣擴散力強、種群數(shù)量龐大、具有生長迅速和休眠特征的種群群落構建機制主要受到環(huán)境篩選作用的影響[37]。但越來越多學者認為這兩種看似矛盾的理論對于群落構建的解釋并不排斥,生物多樣性形成和維持以及生物地理分布格局是環(huán)境篩選和擴散限制共同作用的結果[38- 39]。有研究認為坡向是影響群落構建過程強有力的環(huán)境篩選因素[40],蒼山不同坡向上的捕食線蟲真菌群落結構明顯不同,這再一次印證了環(huán)境篩選對于群落構建的作用。產(chǎn)收縮環(huán)的Drechslerella屬捕食線蟲真菌僅在蒼山西坡有分布,這也說明東、西坡間存在一定的擴散限制,擴散限制同樣影響到了群落構建的過程。蒼山不同坡向上捕食線蟲真菌的分布格局表明環(huán)境篩選和擴散限制均會影響到捕食線蟲真菌的群落構建過程,基于環(huán)境異質(zhì)性較強的區(qū)域開展不同坡向上微生物群落構建研究將有助于更加準確的理解土壤微生物的生物多樣性形成和維持以及分布格局,也有助于探索環(huán)境篩選和擴散限制在微生物群落構建過程中的相對貢獻。

4 結論

坡向是影響蒼山捕食線蟲真菌空間分布格局的驅(qū)動因子之一。環(huán)境篩選和擴散限制均會影響到捕食線蟲真菌的群落構建過程,從而導致次級坡向間捕食線蟲真菌空間分布格局發(fā)生改變。因此在微生物分布格局及資源調(diào)查的研究中,需要考慮小尺度坡向?qū)θ郝浣Y構造成的影響。