周文菲,劉芙蓉,姚甄業(yè),龔春梅

(西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌712100)

干旱缺水是中國西北荒漠地區(qū)尤為突出的生態(tài)問題[1]，也是影響植物生長發(fā)育和限制植物分布的重要因素[2]。植物光合作用對環(huán)境因子的變化高度敏感，因此植物受到干旱脅迫時表現(xiàn)出由氣孔限制或非氣孔限制包括光合結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、光合關(guān)鍵酶等活性下降所致[3]的凈光合速率下降[4]。此時C3植物會通過關(guān)閉氣孔的方式來保持植物體內(nèi)的水分，導(dǎo)致細胞內(nèi)CO2吸收受阻，促進核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(ribulose bisphosphate carboxylase oxygenase, Rubisco)與氧氣結(jié)合，使光呼吸加強，而這一提高光呼吸或者降低CO2濃度的氣孔限制會誘導(dǎo)C4光合的出現(xiàn)[5]。C4植物更適應(yīng)水分脅迫和高溫等逆境[6]而獲得比C3植物更高的光合速率[7]?？磥砀珊狄鸬臍饪缀头菤饪紫拗拼龠M了C4光合的發(fā)生，是C4途徑進化的外部動力和環(huán)境因素。隨著解剖結(jié)構(gòu)和酶活生理研究的深入，越來越多的證據(jù)表明隨干旱加劇首先要求解剖結(jié)構(gòu)發(fā)生更利于C4光合進行的變化[8-11]，隨后C4關(guān)鍵酶活性相應(yīng)增強。C3植物發(fā)展出的C4途徑是環(huán)境調(diào)控的產(chǎn)物，是對逆境的適應(yīng)性進化結(jié)果，研究干旱地區(qū)植被的光合途徑演化有利于對干旱地區(qū)植被的適應(yīng)性機理進行深入剖析[12]。

C3、C3-C4和C4植物的生長適應(yīng)性是光合途徑進化的直觀表現(xiàn)，因而對光合適應(yīng)性的研究開始受到關(guān)注，樸河春等[13-14]對C3和C4植物的土壤的營養(yǎng)元素進行探究，陳宇琪等[15]對C3和C4植物種子的出苗和幼苗的生長等進行研究，王玉魁[16]對不同光合型物種的抗旱生理進行研究，但這些研究還不夠全面系統(tǒng)深入。對干旱地區(qū)具有不同光合型的同屬物種進行生長適應(yīng)性研究非常有必要，這為完善C4光合進化理論提供了生理生態(tài)特征變化證據(jù)。豬毛菜屬(Salsola)是藜科(Chenopodiaceae)中較為進化的螺胚亞科中的豬毛菜族，是該族中的原始屬[17]。目前對豬毛菜屬植物在種子生理、養(yǎng)分條件、光合指標等多個方面進行了環(huán)境適應(yīng)性研究[18-21]，包括對適應(yīng)鹽堿生境的先鋒植物費爾干豬毛菜(Salsolaferganica)等的經(jīng)濟和生態(tài)價值研究[22]。當前國內(nèi)外研究進展和本實驗室的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬毛菜屬植物中存在著不同的光合型[23-26]，如蒿葉豬毛菜(S.abrotanoides)和天山豬毛菜(S.junatovii)為C3光合型，松葉豬毛菜(S.laricifolia)和白枝豬毛菜(S.arbusculiformis)為C3-C4中間光合型，木本豬毛菜(S.arbuscula)和東方豬毛菜(S.orientalis)為C4光合型，這些植物多生活在干旱荒漠及鹽堿土地區(qū)，逐漸形成了適應(yīng)干旱的形態(tài)特征和生理機制。因此豬毛菜屬植物為研究不同光合型荒漠植物適應(yīng)干旱環(huán)境的策略提供了理想材料，對促進荒漠植被恢復(fù)、改善生態(tài)環(huán)境具有重要的生態(tài)價值和社會價值。鑒于對荒漠生境不同光合型植物的抗逆生長適應(yīng)特征還缺乏更全面深入的比較研究，而結(jié)合C4進化對豬毛菜屬植物進行生長適應(yīng)性的研究有必要進一步完善。

本研究利用DNA條形碼技術(shù)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，選擇豬毛菜屬具有各自地理分布的3種不同光合型木本類豬毛菜(C3蒿葉豬毛菜、C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜)作為研究對象，測定其葉和種子形態(tài)結(jié)構(gòu)特征、土壤和植物營養(yǎng)(C、N、P)、干旱響應(yīng)指標[丙二醛(malondialdehyde,MDA)、可溶性糖(soluble sugar)、脯氨酸(proline)]，并進行主成分分析，通過比較不同光合型植物在各自生境干旱脅迫下的生理響應(yīng)，以期為更好理解C4進化提供生理生態(tài)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗以2016年采集的西北荒漠廣泛分布的C3型蒿葉豬毛菜、C3-C4中間型松葉豬毛菜和C4型東方豬毛菜為研究對象，采集上述豬毛菜鮮葉樣品液氮速凍帶回至實驗室-80 ℃保存進行生理生態(tài)相關(guān)指標測定。采樣同時收集的3個物種所在的自然保護區(qū)生境概況如表1所示，隨著光合型從C3經(jīng)由C3-C4向C4過渡3個物種的生境年降水量依次減少，干旱程度加劇。

表1 豬毛菜屬C3、C3-C4和C4光合型物種采集地的生境概況Table 1 The habitat profile of the C3, C3-C4 and C4 species of Salsola genus

1.2 試驗方法

條形碼基因rps16-trnQ參考Schussler等[26]的方法進行測定，采用SDS(sodium dodecyl sulfate)法提取植物DNA，參考Schussler等[26]的方法設(shè)計條形碼基因rps16-trnQ的引物并進行PCR反應(yīng)，送至擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序獲得序列，結(jié)合NCBI(national center for biotechnology information)下載序列，并利用Mega構(gòu)建NJ(neighbor-joining)進化樹,采用戊二醛固定液對葉片解剖結(jié)構(gòu)固定后用半薄切片機進行切片分析[26]，采用體式顯微鏡(Nikon SMZ 25)進行拍照獲得種子形態(tài)，種子重量在萬分之一天平上進行測定。

采用硫代巴比妥酸法測定MDA含量[27]，稱取0.1 g植物樣品，加入20%三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)研磨沖洗并定容至2.5 mL，離心后取上清液放入離心管，再加入2 mL 0.5%硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)，混勻后在100 ℃水浴煮10 min，離心后取上清液測定450、532和600 nm處的吸光值；采用蒽酮法測定可溶性糖含量[28]，稱取0.1 g植物樣品，定容到7 mL水中，吸取200 μL提取液，加入800 μL蒸餾水和5 mL蒽酮試劑，在沸水浴中煮沸10 min，620 nm處測定吸光度值；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸含量[27]，稱取0.1 g植物樣品，用3 mL磺基水楊酸溶液，在沸水中提取10 min，吸取2 mL提取液，加入2 mL 冰醋酸和2 mL酸性茚三酮，在沸水浴中加熱30 min，冷卻后加入4 mL 甲苯，搖蕩30 s，取上清液至10 mL離心管中，520 nm處測吸光度值。

土壤樣品過0.180 mm篩子、植物葉片過0.250 mm篩子，以備用于對碳氮磷含量的分析。采用重鉻酸鉀外加熱法測定葉片和土壤有機碳含量[29]，稱取0.02 g左右的葉樣和0.5 g左右的土樣進行測定；采用半微量凱氏定氮法測定葉片和土壤全氮含量[30]，稱取0.2 g左右的葉樣和1 g左右的土樣消煮后測定；采用鉬銻抗比色法測定葉片和土壤全磷含量[31]，稱取0.2 g左右的葉樣和0.7 g左右的土樣消煮后進行測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用MEGA 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，利用ImageJ2x計算葉片和種子的直徑和面積等指標，土壤碳氮磷比值通過土壤養(yǎng)分測定的數(shù)據(jù)計算化學(xué)計量比。采用GraphPad Prism 5對數(shù)據(jù)進行分析和作圖，利用SPSS 17.0和RStuido軟件進行主成分分析并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于DNA條形碼的豬毛菜屬種系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

DNA條形碼技術(shù)是利用一段具有足夠變異的標準化短基因?qū)ξ锓N進行鑒定[32]，分子系統(tǒng)發(fā)育進化樹是通過比較生物分子序列間的關(guān)系而建立的，可以表示各個物種間的進化關(guān)系。植物DNA條形碼技術(shù)有多種可供選擇的基因，本研究利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和試驗獲得的rps16-trnQ序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示C3蒿葉豬毛菜為原始祖先，繼而分別進化出C3-C4型松葉豬毛菜和C4型東方豬毛菜(圖1)。為豬毛菜屬不同光合型植物的進化方向和親緣關(guān)系提供可靠證據(jù)。

圖1 基于rps16-trnQ構(gòu)建的豬毛菜屬不同光合型物種的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree analysis based on nucleotide of rps16-trnQ

2.2 豬毛菜屬3種光合型物種形態(tài)結(jié)構(gòu)適應(yīng)性比較

2.2.1葉片解剖結(jié)構(gòu)的比較 豬毛菜屬植物葉片多呈圓柱形，因而可對葉片直徑進行測量從而反映葉片大小(圖2a～c)。C4東方豬毛菜的葉片直徑顯著低于C3蒿葉豬毛菜和C3-C4松葉豬毛菜，C3-C4松葉豬毛菜的葉片直徑相較于C3蒿葉豬毛菜有變小的趨勢(圖2d)。C3型豬毛菜葉片橫切面的最外層為表皮細胞，葉肉細胞居于中間，向內(nèi)是發(fā)達的貯水薄壁組織細胞，維管束分布在貯水組織中，中央的維管束較大，維管束鞘不發(fā)達；C3-C4松葉豬毛菜與C3蒿葉豬毛菜相比，其葉肉細胞的面積無顯著差異，但有減少的趨勢，出現(xiàn)具備部分功能的不完全花環(huán)結(jié)構(gòu)區(qū)域，即由葉肉細胞和不連續(xù)的維管束鞘細胞組成(圖2e)；C4型豬毛菜具有由葉肉細胞和維管束鞘細胞組成的典型C4“花環(huán)結(jié)構(gòu)”。另外，相較于C3植物，C3-C4植物和C4植物具有較大的貯水組織，且C4植物的貯水組織面積大于C3-C4植物(圖2f)；C3-C4植物和C4植物的柵欄組織更為發(fā)達。

2.2.2種子形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化 豬毛菜屬3種光合型豬毛菜種子均為螺旋胚形(圖3a～i)，不同點在于種子外層覆蓋物和種子大小，相較于C3植物，C3-C4植物和C4植物種子外層覆蓋物更為緊密；C3-C4植物的種子大小和重量都明顯大于C3植物和C4植物(圖3j,k)。圖3a～c分別顯示C3型蒿葉豬毛菜的上下兩面和剝?nèi)ジ采w物后的種子形態(tài)；圖3d～f分別顯示C3-C4植物松葉豬毛菜的上下兩面和剝?nèi)ジ采w物后的種子形態(tài)；圖3g～i分別顯示C4植物東方豬毛菜的上下兩面以及剝?nèi)ジ采w物后的種子形態(tài)。

2.3 豬毛菜屬3種光合型物種生理水平適應(yīng)性比較

C4型東方豬毛菜的丙二醛含量略高于C3-C4型松葉豬毛菜，但都明顯低于C3型蒿葉豬毛菜，說明C3-C4型松葉豬毛菜和C4型東方豬毛菜在干旱環(huán)境下的膜穩(wěn)定性都較高(圖4a)；C3-C4型松葉豬毛菜的可溶性糖含量低于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜(圖4b)；隨著光合型向C4轉(zhuǎn)變，脯氨酸含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(圖4c)。推測可溶性糖在C4東方豬毛菜的滲透調(diào)節(jié)中起重要作用，脯氨酸在C3-C4松葉豬毛菜滲透調(diào)節(jié)中起一定作用，而可溶性糖和脯氨酸在C3型蒿葉豬毛菜通過滲透調(diào)節(jié)的抗旱適應(yīng)性中均起一定作用。

2.4 豬毛菜屬3種光合型物種生境貧瘠適應(yīng)性比較

2.4.1植物葉生態(tài)化學(xué)計量特征 C3-C4松葉豬毛菜的碳含量低于C3蒿葉豬毛菜，但二者都遠遠低于C4東方豬毛菜(圖5a)；C3植物的氮含量顯著高于C3-C4植物，但是兩者都顯著低于C4植物(圖5b)，這與磷含量在3種光合型豬毛菜中的趨勢類似(圖5c)。C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜的C/N和C/P無顯著差異，但是都顯著低于C3-C4松葉豬毛菜(圖5d,e)；這說明C3-C4松葉豬毛菜的N、P元素利用率最高，即同化單位N或者P元素固定的碳含量最高。再結(jié)合3種光合型植物的碳含量發(fā)現(xiàn)不同光合型豬毛菜采用不同策略來增強固碳量，C3-C4松葉豬毛菜采用的是增強N、P元素的利用率來增加植物的固碳量，而C4東方豬毛菜通過增加N、P元素的含量來增加植物的固碳量。從C3到C3-C4再到C4豬毛菜，葉N/P呈現(xiàn)下降趨勢(圖5f)，表明這3種光合型豬毛菜體內(nèi)P起限制作用，到C4東方豬毛菜，這種限制作用逐漸減小，暗示C4進化過程中低磷脅迫越來越弱。同時N/P下降也反映出植物可以降低對氮的需求，以便更能適應(yīng)貧瘠的環(huán)境從而提高耐瘠薄性。

圖2 豬毛菜屬3種不同光合型物種的葉片解剖結(jié)構(gòu)特征比較Fig.2 The leaf anatomical structure and relative quantitative index of Salsola genus 不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant differences (P<0.05). The same below.

圖3 豬毛菜屬不同光合型物種的種子形態(tài)差異以及直徑和百粒重的比較Fig.3 The variation of seeds morphology, 100-seed weight and diameter among 3 photosynthetic types of Salsola genus

2.4.2土壤生態(tài)化學(xué)計量特征 C3蒿葉豬毛菜生境中的土壤碳、氮含量顯著高于C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜之間差異不大(圖6a,b)，說明C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜生境中土壤的營養(yǎng)元素相對匱乏。C3-C4松葉豬毛菜生境中的土壤磷含量顯著高于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜之間差異不大(圖6c)。C3-C4松葉豬毛菜的土壤C/N略高于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，但不顯著，C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜之間的C/N差異不大(圖6d)，有效氮含量略低于全國平均水平。C4東方豬毛菜的土壤C/P和土壤N/P略高于C3-C4松葉豬毛菜，但是它們的土壤C/P和土壤N/P都顯著低于C3蒿葉豬毛菜(圖6e,f)，豬毛菜生境土壤C/P含量明顯低于全國平均水平，且C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜的土壤有效磷含量遠遠大于C3蒿葉豬毛菜。

圖4 豬毛菜屬不同光合型物種的抗旱性差異比較分析Fig.4 The physiological index among the 3 photosynthetic types of Salsola genus

圖5 豬毛菜屬不同光合型物種葉營養(yǎng)元素及比值變化Fig.5 The content of leaf nutrient elements and its ratio of Salsola genus

2.5 主成分分析

逆境下植物的生長適應(yīng)性由多種生理生態(tài)指標共同塑造，而這些指標之間具有一定的相關(guān)性，為探究這些相關(guān)指標對豬毛菜適旱生長的貢獻率，本試驗采用主成分分析法，對干旱驅(qū)動的不同光合型豬毛菜的各項指標進行綜合分析，為C4進化的表觀生長影響因子進行歸類并評價。

通過主成分分析，提取2個主成分，在第一主成分軸上，C3-C4植物松葉豬毛菜和C4植物東方豬毛菜得分較高。在第二主成分軸上，C3植物蒿葉豬毛菜得分較高(圖7)。第一主成分的方差貢獻率為51.079%，在這一主成分中，葉片C、N、P含量和葉片C/N、C/P、種子直徑和百粒重、可溶性糖含量和土壤C/N、土壤P含量等指標具有較高的載荷值，對松葉豬毛菜貢獻較大(表2和圖7)；第二主成分的方差貢獻率為48.921%，這一主成分中，葉片C、N和P以及貯水組織面積、維管束鞘面積、可溶性糖含量、降水量等具有較高的載荷值，對東方豬毛菜貢獻較大(表2)。

圖6 豬毛菜屬不同光合型物種生境土壤營養(yǎng)元素及比值變化Fig.6 The content of soil nutrient elements and its ratio among 3 photosynthetic types of Salsola genus

項目Item主成分Principalcomponents(PC)PC1PC2項目Item主成分Principalcomponents(PC)PC1PC2葉片C/PLeafC/P0.998-脯氨酸含量Prolinecontent0.2620.965土壤P含量SoilPcontent0.990-0.140降水量Precipitation0.2760.961葉片C/NLeafC/N0.988-0.156土壤C含量SoilCcontent-0.3120.950種子百粒重100-seedsweight0.978-0.210土壤N含量SoilNcontent-0.3500.937葉片N含量LeafNcontent-0.966-0.258維管束鞘面積Areaofbundle-sheathcell-0.436-0.900種子直徑Seeddiameter0.964-0.268土壤C/PSoilC/P-0.5060.863可溶性糖含量Solublesugarcontent-0.942-0.334土壤N/PSoilN/P-0.5060.862葉片P含量LeafPcontent-0.906-0.423葉片直徑Leafdiameter0.5090.861土壤C/NSoilC/N0.865-0.502MDA含量MDAcontent-0.6890.724葉片C含量LeafCcontent-0.828-0.561貢獻率Contributionrate(%)51.07948.921葉片N/PLeafN/P-1.000累積貢獻率Cumulativecontributionrate(%)51.079100.000貯水組織面積Areaofwaterstoragecell-0.112-0.994

從載荷圖(圖7)可知，在第一主成分上能夠分開C3蒿葉豬毛菜和C3-C4松葉豬毛菜，在第二主成分上能夠分開C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜。C3蒿葉豬毛菜的土壤C、N含量和土壤N/P、C/P、丙二醛和脯氨酸含量較高；C3-C4松葉豬毛菜的種子直徑和百粒重、葉片C/N、C/P較高；C4東方豬毛菜的維管束鞘面積和貯水組織面積、葉片C、N、P含量、可溶性糖含量較高。

圖7 豬毛菜屬不同光合型物種多種指標的載荷圖Fig.7 Load map of various indexes among 3 photosynthetic types Salsola genus

3 討論

至此，已對藜科豬毛菜屬3種不同光合型植物應(yīng)對干旱貧瘠的生長適應(yīng)性做了初步比較。

首先確立不同光合型豬毛菜的親緣關(guān)系和C4演化方向。已有研究對菊科黃頂菊屬(Flaveria)不同光合型植物的關(guān)系進行研究，發(fā)現(xiàn)黃頂菊屬C3植物位于系統(tǒng)發(fā)育樹的最底部，之后進化出C3-C4和C4光合途徑[33]。本研究利用DNA條形碼對不同光合型豬毛菜植物進行構(gòu)樹聚類研究，發(fā)現(xiàn)C3-C4型豬毛菜與C4型豬毛菜也是由C3型豬毛菜演化而來，這與不同光合型黃頂菊屬植物的進化總體方向一致[34]，明確了不同光合型豬毛菜的親緣關(guān)系和C4進化方向。

不同光合型豬毛菜應(yīng)對干旱脅迫產(chǎn)生葉和種子的形態(tài)結(jié)構(gòu)不同。葉片可以進行光合作用和蒸騰作用等多種生命活動，在植物生長過程中發(fā)揮重要作用，在行使生理功能的過程中葉片與環(huán)境之間有著緊密的關(guān)系，因而為了適應(yīng)環(huán)境的變化，植物葉片會在外部形態(tài)、解剖結(jié)構(gòu)等多個方面發(fā)生一系列的適應(yīng)性變化。豬毛菜屬3個種從C3向C4方向過渡，外部形態(tài)上柱狀葉趨于細短，細小的葉型可以減少水分蒸發(fā)面積而更耐旱[4]，表明豬毛菜屬植物在向C4進化過程中其葉片外部形態(tài)越來越適應(yīng)干旱環(huán)境。解剖結(jié)構(gòu)上相較于C3種，C3-C4種和C4種的柵欄組織和貯水組織更為發(fā)達。柵欄組織/海綿組織越大，即柵欄組織越發(fā)達，植物越耐旱；貯水組織越發(fā)達，植物越耐旱[35-36]。這便是豬毛菜C4植物更耐旱的原因[37]。同時豬毛菜C4種葉片具有典型的豬毛菜型“花環(huán)”結(jié)構(gòu)，即由外層整齊排列的葉肉細胞和內(nèi)層較發(fā)達的維管束鞘細胞組成，旨在通過四碳化合物從葉肉細胞向維管束鞘的運輸實現(xiàn)二氧化碳在維管束鞘細胞內(nèi)的再固定，為高光效光合作用提供了快速產(chǎn)生和運輸有機產(chǎn)物的物質(zhì)條件和合理結(jié)構(gòu)。

干旱條件下植物的生長環(huán)境非常嚴酷，因此，為適應(yīng)這種嚴酷的條件，植物具有其特殊的適應(yīng)機制，其中種子繁殖便是荒漠植物產(chǎn)生的一種適應(yīng)機制[38]。從種子自身萌發(fā)特性而言，種子大小影響植物生長和存活：較大的種子萌發(fā)緩慢但萌發(fā)后生存力強，自身競爭力強；較小種子萌發(fā)較快但萌發(fā)后生存力較弱，但種子大小與種子數(shù)量和種子擴散分布成反比，具有較小種子的植物，其種子在數(shù)量上一般居多，采取的是機會主義生存策略[39]。C3-C4松葉豬毛菜的種子無論在形態(tài)上還是重量上都明顯大于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，其采用增強種子自身競爭力的機制來適應(yīng)環(huán)境，而C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜則采取在種子傳播上占據(jù)優(yōu)勢的策略。為了適應(yīng)干旱的環(huán)境，荒漠植物種子表面具有水溶性抑制物質(zhì)，只有在大量降水后，這些抑制物質(zhì)被洗脫掉才能萌發(fā)，以保證形成的幼苗不致因缺水而枯死。從形態(tài)上可以看出來，豬毛菜種子外有一層覆蓋物，這層覆蓋物可能發(fā)揮著保護種子免受環(huán)境脅迫、保持種子水分等作用，隨著向C4進化，這層覆蓋物越加致密發(fā)達。

干旱脅迫下植物細胞膜容易發(fā)生過氧化反應(yīng)產(chǎn)生丙二醛，因此常用葉片的丙二醛含量來反映植物膜脂過氧化程度，即丙二醛含量越高，說明細胞膜不穩(wěn)定，則植物的抗旱能力越弱。不同光合型豬毛菜應(yīng)對干旱脅迫在抗性生理方面表現(xiàn)出差異。干旱脅迫下植物葉片容易遭受氧化脅迫使得膜脂過氧化產(chǎn)生丙二醛，但耐旱植物在逆境中產(chǎn)生的丙二醛含量較低[40]，本試驗中C4物種產(chǎn)生的丙二醛含量較低。干旱脅迫下，植物細胞內(nèi)水勢較低，會通過積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來吸收更多的水分以維持植物體正常的生命活動，這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)主要有可溶性糖和脯氨酸等。本研究結(jié)果中，脯氨酸和可溶性糖在C3蒿葉豬毛菜中的作用均大于C3-C4蒿葉豬毛菜，相較于脯氨酸，可溶性糖在C4東方豬毛菜中發(fā)揮重要的作用。不同植物在干旱脅迫下積累的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)種類存在差異，如無機離子在中生植物滲透調(diào)節(jié)中起的作用較小[41]，但在葡萄(Vitisvinifer)植株中卻起著大于可溶性有機物質(zhì)的作用[42]?？扇苄蕴呛吭谔鸩?Betavulgaris)[43]、豌豆(Pisumsativum)[44]等植物抗旱中發(fā)揮著重要的滲透調(diào)節(jié)作用，但是也有研究指出干旱脅迫下，植物碳同化率降低，可溶性糖含量降低[45]，本試驗中相較于脯氨酸，可溶性糖在調(diào)節(jié)C4東方豬毛菜滲透作用的過程中起著更為重要的作用，在向C4光合過渡中植物的光合能力逐漸增強，通過可溶性糖來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的滲透勢具有極為便利的物質(zhì)基礎(chǔ)。

植物通過光合作用吸收大氣中的二氧化碳，通過葉的蒸騰作用獲取土壤中的水分和礦質(zhì)營養(yǎng)元素，驅(qū)動陸地生態(tài)系統(tǒng)中水和碳氮磷等元素的生物地化循環(huán)[46]。作為植物的基本營養(yǎng)元素，C元素是構(gòu)成植物體最主要的結(jié)構(gòu)元素，而N和P是植物體主要的功能元素，因為它們是植物體內(nèi)各種蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)重要的組成元素，C、N、P在植物生長和各種生理調(diào)節(jié)機能中關(guān)系密切,且發(fā)揮著重要作用。植物葉片中的C/N、C/P不僅可以反映植物N、P元素的利用率，還反映了植物吸收單元同化C元素的能力。換言之，比值越高，說明植物吸收單位N或者P元素同化的C元素越多[47-48]，植物N/P則被用來評價生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)元素的限制作用。本試驗結(jié)果中，C3-C4植物的C/N、C/P中明顯大于C3植物和C4植物，這說明C3-C4植物的N、P元素利用率最高，即同化單位N或者P元素固定的C含量最高，再結(jié)合3種光合型植物的碳含量發(fā)現(xiàn)不同光合型豬毛菜采用不同策略來增強碳積累，C3-C4松葉豬毛菜采用的是增強N、P元素的利用率來增加植物的碳積累，而C4東方豬毛菜通過增加N、P元素的含量來增加植物的碳積累。植物組織中的營養(yǎng)元素含量被用來評價生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)元素限制作用，N/P的化學(xué)計量比值被用來評價N或P中哪一種更多地起限制生物量產(chǎn)量和物種豐度的作用，一般認為，N起限制作用的N/P臨界值為6.7～16.0，而P起限制作用的N/P臨界值為12.5～26.3，低于臨界值表示N起限制作用，高于臨界值表示P起限制作用[49]。本試驗結(jié)果表明，這3種光合型豬毛菜體內(nèi)N/P所處范圍屬于P起限制作用，且隨著向C4進化，這種限制作用逐漸減小，有研究表明低磷脅迫能顯著降低葉片相對含水量和葉綠素含量，同時，低磷脅迫能顯著降低葉片光合速率和氣孔導(dǎo)度[14]，因而C4進化過程中低磷脅迫越來越弱。

不同光合型豬毛菜應(yīng)對貧瘠生境在生態(tài)化學(xué)計量特征方面表現(xiàn)出差異。結(jié)合所在區(qū)域生境土壤的營養(yǎng)元素，能揭示植物對營養(yǎng)元素的需要和當?shù)赝寥赖酿B(yǎng)分供給能力，對植物與環(huán)境的適應(yīng)與反饋能力都具有十分重要的意義[50]。土壤是植物生存的物質(zhì)基礎(chǔ)和重要的環(huán)境條件，土壤C、N、P等養(yǎng)分含量是衡量土壤肥沃程度的重要指標，本試驗中，相較于C3蒿葉豬毛菜，C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜生境中土壤的營養(yǎng)元素相對匱乏。同時，土壤C/N、C/P和N/P也是確定土壤C、N、P平衡特征的重要參數(shù)，全球和全國土壤C/N平均水平為14.3和10～12[51]，C3-C4松葉豬毛菜的C/N大于C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜，但都維持在全國平均水平附近，土壤有機層的C/N較低表明土壤有機層的有效氮含量相對較高，因此盡管C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜生境土壤C、N含量較低，但土壤有效氮含量與C3植物相當；陸生生態(tài)系統(tǒng)中，生物固氮量隨著土壤中N/P增大而減少，隨土壤中N/P減少而增大[52]，本試驗中C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜其生境土壤的生物固氮量明顯大于C3植物；較低的C/P也反映了土壤中有效磷濃度較高，我國土壤C/P的平均值為61[53]，豬毛菜生境中C/P明顯低于全國平均水平，從葉片營養(yǎng)元素分析中可看出豬毛菜植物受到低磷脅迫，C3-C4較低的土壤C/P也反映了土壤中有效磷濃度較高，松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜的土壤有效磷濃度遠遠大于C3植物。這一結(jié)論與豬毛菜葉片存在低磷脅迫且C3-C4松葉豬毛菜和C4東方豬毛菜能緩解低磷脅迫相一致。簡而言之，C3-C4物種松葉豬毛菜生境中土壤C、N含量貧瘠，但土壤P含量豐富且土壤有效P含量較高，葉片C、N、P含量較低，但其葉片P元素利用率較高；C4植物東方豬毛菜生境中土壤C、N含量貧瘠，但土壤有效P含量較高，葉片C、N、P含量較高。表明C3-C4植物松葉豬毛菜和C4植物東方豬毛菜采用不同的策略來緩解低磷脅迫。

C4進化的驅(qū)動因素之一是干旱，其形成受環(huán)境因子以及植物對環(huán)境的生物和生態(tài)適應(yīng)性差異的影響，通過對這些指標進行主成分分析發(fā)現(xiàn)，在C4進化中，主要受兩大類因素影響，各因素的方差貢獻率分別為51.079%和48.921%。在第一主成分上能夠分開C3蒿葉豬毛菜和C3-C4松葉豬毛菜，在第二主成分上能夠分開C3蒿葉豬毛菜和C4東方豬毛菜。C3植物在第二主成分上具有較高的得分，表明相較于C3植物，C3-C4植物和C4植物更能適應(yīng)貧瘠的環(huán)境。

4 結(jié)論

本試驗基于 DNA 條形碼對 3 種光合型豬毛菜的生長適應(yīng)性包括形態(tài)結(jié)構(gòu)、抗旱生理和生態(tài)特征進行比較和評價，獲得以下主要結(jié)論，為完善C4進化理論提供表觀生長適應(yīng)證據(jù)。

1)C3光合型豬毛菜是原始祖先，C3-C4中間型豬毛菜與C4光合型豬毛菜由C3光合型豬毛菜進化而來；2)與C3光合型蒿葉豬毛菜相比， C3-C4中間型松葉豬毛菜以及C4光合型東方豬毛菜葉從外部形態(tài)和解剖結(jié)構(gòu)上逐漸形成適應(yīng)干旱的結(jié)構(gòu)特征，且種子的傳播策略也因種子大小不同而發(fā)生變化；3)C4光合型豬毛菜因高光合能力使其具備通過可溶性糖來調(diào)節(jié)滲透能力的物質(zhì)基礎(chǔ)，從而提高抗旱能力；4)C3-C4型豬毛菜是通過提高氮和磷的利用效率來增加固碳量，C4光合型豬毛菜是通過氮和磷含量的增多來增加固碳量。相較于C3物種蒿葉豬毛菜，C3-C4物種松葉豬毛菜和C4物種東方豬毛菜更能適應(yīng)貧瘠的環(huán)境。