金媛媛，BOWATTE Saman，賈倩民，侯扶江，李春杰

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

禾草內(nèi)生真菌(grass endophyte) 主要分布在禾草莖髓和葉鞘細(xì)胞間隙中，在禾草體內(nèi)渡過全部或部分生活史，但不會引起禾草外部顯現(xiàn)任何病害癥狀的一類真菌[1]，禾草內(nèi)生真菌通過種子垂直傳播至下一代植物中[2]。大量研究表明，內(nèi)生真菌侵染對宿主植物和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有著顯著影響[3-6]。內(nèi)生真菌侵染宿主會增加其對低水分供應(yīng)和鹽脅迫等非生物脅迫的抵抗力[7-9]，也可增強(qiáng)對生物脅迫的抗性，如食草動物采食[10]和病原體入侵[11]。同時內(nèi)生真菌產(chǎn)生的一系列次級代謝產(chǎn)物，可以保護(hù)宿主植物免受病蟲害侵害[12]。

野大麥(Hordeumbrevisubulatum)作為一種飼料作物被廣泛種植，其對非生物脅迫(如鹽度和干旱)具有較強(qiáng)的耐受性，并且被Epichloёbromicola內(nèi)生真菌侵染[13]。研究表明，在鹽脅迫下內(nèi)生真菌侵染可促進(jìn)野大麥的生長[14]以及增加宿主的抗?jié)承訹15]。禾草和內(nèi)生真菌共生對宿主農(nóng)藝性狀的影響已得到充分研究和認(rèn)識，但對于共生體地下生境效應(yīng)的研究才逐漸被關(guān)注。一些研究表明，內(nèi)生真菌的存在對高羊茅(Festucaarundinacea)牧場土壤微生物群落[16-17]、土壤微生物生物量[18]、土壤基礎(chǔ)呼吸[18]、土壤有機(jī)碳[19]、可溶性碳[19]、土壤碳氮庫[20-21]、土壤水力特性[22]、礦化[23]和根際過程[24]均可產(chǎn)生一定的影響。Bowatte等[25]在研究內(nèi)生真菌侵染對一系列C3和C4植物土壤硝化潛力的影響時發(fā)現(xiàn)，測試植物在內(nèi)生真菌侵染的情況下土壤的潛在硝化作用明顯提高。目前，大多數(shù)內(nèi)生真菌對宿主生境的研究主要集中在高羊茅共生體影響地下生境上，其他禾草共生體生境的研究較少。同時內(nèi)生真菌對地下過程的響應(yīng)也可能因植物類型、內(nèi)生真菌基因型、土壤類型和環(huán)境的不同而異，因此需要在不同試驗條件對內(nèi)生真菌進(jìn)行研究，以明確它的作用機(jī)制和應(yīng)用價值。

本試驗以內(nèi)生真菌Epichloёbromicola與野大麥共生體為研究材料，將E+，E-植株種植在不同生態(tài)區(qū)(瑪曲、臨澤、榆中) 的土壤中，通過測定土壤化學(xué)性質(zhì)(土壤碳、氮、磷和pH) 以及土壤細(xì)菌、真菌和土壤氮循環(huán)細(xì)菌(氨氧化細(xì)菌，反硝化細(xì)菌和氧化亞氮還原菌) 的豐度，探究內(nèi)生真菌共生對宿主生境土壤化學(xué)和生物學(xué)特性的影響，明確其影響機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2016年9月，在蘭州大學(xué)臨澤研究站(E 100°06′，N 39°11′) 種子庫收獲Epichloёbromicola內(nèi)生真菌侵染(E+) 和未侵染(E-) 的野大麥種子。將收獲的種子在4 ℃下保存于農(nóng)業(yè)部牧草與草坪草種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗測量中心(蘭州) 儲藏室，備用。試驗所用土壤采集于甘肅省的三個不同生態(tài)區(qū)，分別是西北內(nèi)陸干旱區(qū)臨澤縣(Linze，LZ)，黃土高原榆中校區(qū)蘭州大學(xué)試驗地(Yuzhong，YZ) 和青藏高原瑪曲縣(Maqu，MQ)，表1列出了3種土壤的基本情況。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗采用2因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計進(jìn)行野大麥盆栽試驗，包括3個生態(tài)區(qū)的土壤(LZ、YZ和MQ) 和2種野大麥內(nèi)生真菌侵染狀況(E+和E-)，共6個處理，每個處理重復(fù)6次，共36盆。于2017年7月至2018年4月在蘭州大學(xué)榆中校區(qū)的智能溫室進(jìn)行。溫室環(huán)境條件如下：光照強(qiáng)度為 800 μmol·m-2·s-1，16 h光照和8 h黑暗交替；溫室的最高和最低溫度分別為33和5 ℃，25 ℃/16 ℃晝夜變化。將E+和E-種子分別播種在兩個單獨的蛭石培養(yǎng)盤中，每隔2 d澆一次水以保證種子正常出苗。3周后，采用Saha等[26]的方法，使用苯胺藍(lán)染色再次檢測幼苗的內(nèi)生菌侵染情況，確保E+幼苗的帶菌率為100%，E-幼苗的帶菌率為0。移栽前將3個不同生態(tài)區(qū)的土壤分別裝到直徑和高度均15 cm的花盆中，每個花盆中裝2.4 kg土壤。然后將生長一致的E+和E-幼苗移栽至花盆中，每盆移栽4株幼苗。試驗期間保持土壤濕度為最大持水量的60%以上，在生長周期內(nèi)根據(jù)植物需要定期定量澆水。

表1 土壤概況 Table 1 Soil properties at the beginning of the experiment

1.3 植物和土壤取樣

當(dāng)植物生長3、6和8個月時，將高于地面5 cm的全部野大麥植株進(jìn)行收獲，在60 ℃烘箱內(nèi)干燥至恒重，稱量后作為地上干物質(zhì)量。植物生長6和8個月后，用直徑3 cm和高5 cm的土壤取樣器收集根周圍的土壤。土壤樣品過2 mm篩，去除土壤中的植物殘留物和其他雜質(zhì)。將每份土壤樣品中的一小部分儲存在-20 ℃冰箱中用于DNA的提取，其余土壤樣品冷藏在4 ℃冰箱中用于土壤化學(xué)分析。

1.4 土壤化學(xué)分析

采用烘干法測定土壤水分，將土壤樣品置于105 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A, 上海精宏) 中烘干48 h至恒重。使用pH計(PE-10, Sartorious, Germany) 在土水比為1.0∶2.5的懸浮液中測定土壤pH。使用元素分析儀(Vario EL/micro cube，Elementar，Hanau，Germany) 測定土壤全碳(total carbon， TC) 和全氮(total nitrogen， TN) 含量。經(jīng)H2SO4-HClO4萃取后，用鉬銻藍(lán)比色法使用分光光度計在660 nm處比色測定土壤全磷(total phosphorus， TP)[27]。土壤有機(jī)碳(organic carbon， OC)使用油浴鍋加熱使重鉻酸鉀氧化，硫酸亞鐵滴定法[28]。

1.5 土壤微生物指標(biāo)測定

1.5.1生物量碳 土壤微生物生物量碳測定使用熏蒸-提取方法[29]。兩份25.0 g新鮮土壤，一份使用連同盛有CHCl3燒杯在真空干燥皿中用真空泵抽取真空,使 CHCl3沸騰 5 min以上, 在25 ℃黑暗條件下真空密封24 h；另一份在25 ℃黑暗條件下保存24 h。之后將兩份土壤用K2SO4浸提。微生物量碳使用加熱重鉻酸鉀氧化，硫酸亞鐵滴定，熏蒸與未熏蒸的差值比上轉(zhuǎn)換系數(shù)0.35。

1.5.2土壤DNA提取 稱取0.5 g土壤，使用Bioprep-24生物樣品均質(zhì)儀(Bioprep-24 Homogenizer) 以6 m·s-1的強(qiáng)度搖動45 s，使土壤微生物細(xì)胞裂解釋放出DNA。之后，使用FastDNA?spin kit(MP Biomedicals，Santa Ana，CA) 試劑盒提取土壤樣品的總DNA。然后將提取的DNA溶解在100 μL的DNA洗脫液中，使用Nanodrop ND-1000紫外可見分光光度計測定DNA量和純度。將提取的樣品DNA保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.5.3土壤細(xì)菌、真菌和氮循環(huán)細(xì)菌的定量 使用CFX96光學(xué)實時檢測系統(tǒng)(CFX96TM Thermal Cycler，USA) 進(jìn)行實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR) 測定每個樣品的DNA，3個技術(shù)重復(fù)，分析土壤細(xì)菌、真菌和氮循環(huán)細(xì)菌的基因拷貝數(shù)。土壤細(xì)菌、真菌基因拷貝數(shù)分別通過定量16S rDNA和18S rDNA擴(kuò)增數(shù)量確定。通過靶向amoA基因來研究氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)，靶向nirK基因的反硝化細(xì)菌和靶向nosZ基因的氧化亞氮還原菌的豐度，來分析氮循環(huán)相關(guān)的3個關(guān)鍵細(xì)菌功能基因。qPCR反應(yīng)混合物(20 μL)含有10 μL TB Green premix Ex Taq(TaKaRa Biotech，大連，中國) 酶，正向與反向引物各0.25 μL和1.0 μL土壤DNA，之后使用滅菌的超純水補(bǔ)充到20 μL。通過相關(guān)基因片段的7倍稀釋梯度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度基因拷貝數(shù)做橫坐標(biāo)，測得的循環(huán)數(shù)(Ct)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)測得的Ct值即可得到目標(biāo)基因拷貝數(shù)。引物和熱循環(huán)條件見表2。

表2 qPCR所用的引物和程序Table 2 Primers and qPCR thermal cycle conditions

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，采用方差分析(ANOVA)確定土壤，采樣時間，內(nèi)生真菌及其相互作用對土壤化學(xué)和微生物豐度的影響。對基因豐度數(shù)據(jù)進(jìn)行對數(shù)轉(zhuǎn)換以滿足正態(tài)分布的要求，統(tǒng)計顯著性定義為95%置信水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 地上干物質(zhì)量

圖1A所示，在同一帶菌情況下(E+或 E-)，從3至8月隨著植物生長時間的延長，E+和E-的地上植物干物質(zhì)量(dry matter， DM) 均表現(xiàn)上升的趨勢，且臨澤土壤中的DM明顯高于另外兩種土壤；同一生態(tài)區(qū)土壤中，E+植物的DM在3、6和8月均高于E-；其中榆中土壤中的E+和E-植物的DM差異最大，在3、6和8月E+植物的DM 分別是E-的1.59，1.46和1.32倍。從圖1B可以看出，在同一種帶菌情況下，3、6和8月的總DM表現(xiàn)規(guī)律為LZ>YZ>MQ，其中LZ顯著高于YZ和MQ；同一生態(tài)區(qū)土壤中，E+植物的總DM顯著高于E-(P<0.05)。

2.2 土壤化學(xué)性質(zhì)

2.2.1有機(jī)碳和C/N 因素顯著性分析結(jié)果表明(表3)，土壤類型對有機(jī)碳和C/N影響極顯著(P<0.01)，而內(nèi)生真菌侵染、植物生長時間以及因素間的交互作用對有機(jī)碳和C/N影響不顯著(P>0.05)。從圖2A可看出，土壤有機(jī)碳大小規(guī)律為MQ>LZ>YZ，MQ顯著高于LZ和YZ，分別高22.78和31.64 g·kg-1；而C/N大小規(guī)律為YZ>LZ>MQ，各土壤類型之間差異顯著(P<0.05)，YZ比LZ和MQ分別高出1.33和1.52倍(圖2B)。

2.2.2全氮和全磷含量 因素顯著性分析結(jié)果顯示(表3)，土壤類型對全磷含量影響極顯著(P<0.01)，土壤類型和生長時間的交互作用影響顯著(P<0.05)，而內(nèi)生真菌、生長時間以及其他因素間的交互作用影響不顯著(P>0.05)。從圖3A可看出，在植物生長6個月時，MQ全磷含量較LZ和YZ分別高1.35和1.6倍(P<0.05)。然而，在植物生長8個月時，各土壤類型的全磷含量差異均不顯著。

圖1 內(nèi)生真菌對地上干物質(zhì)量(DM)的影響Fig.1 Effects of endophyte status on above ground dry matter (DM) 不同小寫字母表示在P<0.05水平差異顯著。3, 6, 8：植物生長時間(月)。LZ：臨澤土壤，YZ：榆中土壤，MQ：瑪曲土壤。下同。The values with different letters are statistically different at P<0.05. 3, 6, 8: Plant growth time (month). LZ: Linze soil, YZ: Yuzhong soil, MQ: Maqu soil. The same below.

圖2 不同土壤中有機(jī)碳含量和C/NFig.2 Effect of soil type on soil organic carbon content and C/N

圖3 土壤類型和植物生長時間對土壤全氮和全磷的影響Fig.3 Effect of soil type and plant growth time on total nitrogen and total phosphorus

從表3可看出，土壤類型和內(nèi)生真菌對全氮含量影響極顯著(P<0.01)，土壤類型和生長時間的交互作用影響顯著(P<0.05)，而內(nèi)生真菌與土壤類型、生長時間的交互作用影響不顯著(P>0.05)。如圖3B所示，在植物生長6個月時，MQ的全氮含量較LZ和YZ分別高1.41和1.62倍(P<0.05)，在植物生長8個月時，MQ土壤全氮含量較LZ和YZ分別高2.67和2.62倍(P<0.05)。

2.2.3內(nèi)生真菌對土壤pH、全碳和全氮的影響 因素顯著性分析結(jié)果顯示(表3)，內(nèi)生真菌侵染對土壤全氮有極顯著作用(P<0.01)，而內(nèi)生真菌與土壤類型、生長時間之間交互作用不顯著(P>0.05)。如圖4A所示，內(nèi)生真菌的侵染顯著促進(jìn)了土壤全氮含量(P<0.05)，E+土壤全氮含量比E-高1.08倍。

從表3可看出，內(nèi)生真菌、土壤類型和植物生長周期三者之間交互作用對土壤全碳存在顯著作用(P≤0.001)。從圖4B可看出，在3種土壤中，無論E+和E-土壤，MQ土壤 6和8月的TC均顯著高于LZ土壤(P<0.05)，LZ土壤顯著高于YZ土壤(P<0.05)。在瑪曲土壤中，E+6個月時的TC顯著高于E-(P<0.05)，在其他土壤類型中E+和E-無顯著性差異(P>0.05)。

因素顯著性分析結(jié)果顯示(表3)，內(nèi)生真菌、土壤類型和植物生長周期三者之間交互作用對土壤pH存在顯著作用(P<0.05)。從圖4C可看出，在3種土壤中，無論E+和E-土壤，LZ土壤6和8月的pH顯著高于YZ和MQ(P<0.05)，YZ土壤顯著高于MQ(P<0.05)。在瑪曲土壤中，E+土壤6和8月時的pH均顯著高于E-(P<0.05)，分別高出0.4和0.2，在其他土壤類型中E+和E-無顯著性差異(P>0.05)。

圖4 內(nèi)生真菌對土壤全氮、土壤全碳和土壤pH的影響Fig.4 Effects of endophyte status on soil total nitrogen, soil total carbon and soil pH

項目ItemdfpHFPTNFPTCFPOCFPTPFPC/NFP土壤Soil2158.26<0.01329.56<0.01438.75<0.0169.70<0.01321.22<0.0169.70<0.01內(nèi)生真菌Endophyte122.530.6711.38<0.010.080.781.200.281.350.251.200.28生長時間Time114.45<0.010.010.9536.180.000.530.471.300.260.530.47土壤×內(nèi)生真菌Soil×endophyte213.64<0.010.490.624.950.010.540.590.530.590.540.59土壤×生長時間Soil×time20.560.573.020.060.970.381.310.284.330.021.310.28內(nèi)生真菌×生長時間Endophyte×time12.360.132.510.120.010.920.160.691.140.290.160.69土壤×內(nèi)生真菌×生長時間Soil×endo-phyte×time23.350.046.860.118.520.000.780.471.180.310.780.47

2.3 內(nèi)生真菌對土壤微生物碳的影響

圖5 內(nèi)生真菌對土壤微生物量碳的影響Fig.5 Effects of endophyte status on soil microbial biomass carbon

方差分析結(jié)果顯示(表4)，內(nèi)生真菌，土壤類型和植物生長三者之間交互作用對土壤微生物碳起顯著性作用(P≤0.05)(圖5)；YZ 6和8月的土壤微生物量碳均顯著小于LZ和MQ(P<0.05) 。LZ土壤8月，E+土壤中微生物量碳顯著高于E-(P<0.05)，高出120 mg·kg-1，而另外兩種土壤之間無顯著差異(P>0.05)。

2.4 內(nèi)生真菌對土壤細(xì)菌和真菌的影響

從表4可以看出，內(nèi)生真菌對土壤真菌和細(xì)菌種群的影響隨植物生長時間(內(nèi)生真菌與生長時間互作對真菌和細(xì)菌豐度影響顯著，P值分別為0.001和0.010) 和土壤類型(內(nèi)生真菌和土壤類型互作對真菌和細(xì)菌豐度影響顯著，P值均小于0.001)而變化。如圖6A，B所示，瑪曲土壤中E+和E-的真菌和細(xì)菌豐度存在顯著差異(P<0.05)，其中E+土壤比E-土壤具有更高的細(xì)菌和更低的真菌豐度。在6個月時，E+和E-土壤之間的真菌和細(xì)菌豐度沒有顯著差異，但是在8個月時，與E-土壤相比，E+土壤具有更高的細(xì)菌豐度和更低的真菌豐度(圖 6C, D)。土壤中的真菌和細(xì)菌種群在E-土壤中從6個月到8個月沒有顯著變化，相比之下，從6到8個月E+土壤細(xì)菌豐度顯著增加，而真菌豐度顯著減少。

圖6 內(nèi)生真菌對土壤真菌和細(xì)菌豐度的影響Fig.6 Effects of endophyte status on abundance of soil fungi and bacteria

2.5 內(nèi)生真菌對土壤氮循環(huán)細(xì)菌的影響

因素顯著性分析結(jié)果顯示(表4)，內(nèi)生真菌侵染對amoA基因豐度有顯著性作用(P<0.01)，而內(nèi)生真菌、土壤類型和生長時間的交互作用影響不顯著(P>0.05)，而土壤類型和生長時間的相互作用對AOB豐度具有極顯著影響(P< 0.01)。如圖7A所示，E+土壤中AOB豐度顯著高于E-(P<0.05)，高出1.06倍。

從表4可以看出，內(nèi)生真菌與土壤互作對nirK基因豐度有顯著性作用(P<0.05)。通過nirK基因豐度估計得出，MQ土壤中，E+的nirK基因豐度顯著高于E-(P<0.05)，但在LZ和YZ土壤中沒有觀察到顯著差異(圖7B)。

因素顯著性分析結(jié)果顯示(表4)，內(nèi)生真菌侵染，土壤類型和生長周期三者之間互作對nosZ基因豐度具有顯著性差異(P<0.05)。在生長8個月后，與E-相比，臨澤和榆中土壤中的nosZ基因豐度顯著低于E+(P<0.05)，而在生長6個月時，3種土壤E+、E-的nosZ基因豐度均無顯著差異(圖7C)。

圖7 通過amoA(A)、nirK(B)和nosZ(C)基因豐度估計的內(nèi)生真菌對土壤氮循環(huán)細(xì)菌的影響Fig.7 Effect of endophyte status on soil nitrogen cycle bacteria estimated by amoA (A) nirK (B) nosZ (C) genes abundance

項目ItemdfMBCFP真菌FungiFP細(xì)菌BacteriaFPamoAFPnirKFPnosZFP土壤Soil273.93<0.0158.22<0.0174.19<0.0112.44<0.0132.18<0.016.26<0.01內(nèi)生真菌Endophyte12.130.152.920.093.470.0712.55<0.010.490.4933.26<0.01生長時間Time11.250.2741.10<0.0162.17<0.0132.87<0.011.580.215.580.02土壤×內(nèi)生真菌Soil×endophyte20.550.5810.99<0.018.32<0.012.690.084.770.013.890.03土壤×生長時間Soil×time210.66<0.014.920.010.220.8118.74<0.012.480.094.660.01內(nèi)生真菌×生長時間Endophyte×time10.900.9814.82<0.0111.87<0.010.680.411.220.2732.35<0.01土壤×內(nèi)生真菌×生長時間Soil×endo-phyte×time23.220.050.280.762.150.131.850.171.460.243.970.02

3 討論

土壤肥力是土壤從養(yǎng)分和環(huán)境兩方面供應(yīng)和協(xié)調(diào)植物生長的能力，是體現(xiàn)物種豐富度和植物良好生長的重要保證[35]。土壤類型不同，其土壤肥力狀況也不盡相同，從而導(dǎo)致植物生長、生物量和產(chǎn)量等存在差異[36]。本研究結(jié)果表明，雖然瑪曲土壤的肥力最好，臨澤次之，但是臨澤土壤生長的野大麥干物質(zhì)量要高于榆中和瑪曲，這可能是由于臨澤土壤pH較高(圖4C)，屬于堿性土壤，而野大麥?zhǔn)且环N耐鹽堿植物，堿性土壤有利于野大麥的生長，從而產(chǎn)生較高的生物量。有研究報道，內(nèi)生真菌的侵染可以增加宿主的干物質(zhì)量、葉面積和分蘗數(shù)[37]。Kfm等[38]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌的侵染可以提高宿主植物的持久性從而提高牧草的產(chǎn)量。本試驗結(jié)果表明，在瑪曲、臨澤和榆中土壤中E+植物的干物質(zhì)量均顯著高于E-植物，這說明在不同地區(qū)的土壤中，內(nèi)生真菌均能促進(jìn)植物的生長，提高宿主的生物量。

土壤C、N、P是土壤基本組成部分，可反應(yīng)土壤肥力[39]。大量研究證明，土壤化學(xué)計量與植物的生長和土壤肥力密切相關(guān)[40]。碳氮比的大小可以間接反應(yīng)土壤分解礦物的容易程度和速度[41]。研究表明，內(nèi)生真菌的侵染并未對土壤有機(jī)碳、C/N和全磷產(chǎn)生顯著影響，只是因土壤類型和植物生長周期的不同而產(chǎn)生一定的差異。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能是，雖然禾草的根系分泌物和凋落物是土壤有機(jī)碳的主要來源，但是兩者的分泌物的產(chǎn)生和凋落物的分解需要一定的時間，短時間內(nèi)，共生體根系分泌物的累積量和凋落物的分解量不足以引起土壤碳含量發(fā)生顯著變化，從而使有機(jī)碳含量未發(fā)生顯著變化[42]。磷與共生體生物堿的合成有一定的關(guān)系[43]，內(nèi)生真菌侵染可能會與宿主競爭磷庫[44]。有研究表明，當(dāng)土壤中磷含量低時，內(nèi)生真菌感染的植物地上部分和根部磷的含量要高于E-植物[43]。但任安芝等[45]研究顯示，在缺磷的情況下，內(nèi)生真菌的侵染并未改變宿主黑麥草(Loliumperenne)根部和地上部分磷的百分含量，說明內(nèi)生真菌侵染對磷的影響與內(nèi)生真菌基因型和宿主種類有關(guān)[46-47]。

土壤的氮素主要提供植物生長所需要的養(yǎng)分[48]，共生體對土壤氮的影響因宿主種類、禾草內(nèi)生真菌基因、土壤類型及試驗處理周期的不同使結(jié)果不同。試驗結(jié)果表明，內(nèi)生真菌的侵染提高了土壤全氮的含量，但是內(nèi)生真菌侵染，與土壤類型和生長周期之間對土壤全氮不存在交互作用。土壤pH影響植物對營養(yǎng)的吸收，影響土壤中大量和微量元素的有效性[49]。 Khayamim等[50]研究發(fā)現(xiàn)E+高羊茅根際的pH值顯著低于E-植株根際pH值。但也有研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌的感染使得羽茅(Achnatherumsibiricum)根際土壤的pH值高于未感染植株的土壤pH值[51]，這可能與不同共生體根系分泌的一些化學(xué)物質(zhì)不同有關(guān)。野大麥?zhǔn)且环N耐鹽堿植物，在低鹽偏堿中很有利于其生長，從而內(nèi)生真菌的侵染增加土壤堿性來促進(jìn)野大麥的生長，因此在瑪曲土壤中發(fā)現(xiàn)E+土壤pH高于E-。微生物碳是土壤有機(jī)庫中的活性部分，易受土壤易降解有機(jī)質(zhì)如微生物生物體和殘余物分解、土壤濕度和溫度季節(jié)變化及土壤管理措施的影響[52]。本研究發(fā)現(xiàn)，臨澤和瑪曲土壤的微生物碳含量顯著高于榆中土壤；在臨澤土壤中，E+植物生長8個月土壤中微生物量碳顯著高于E-植物生長的土壤，臨澤和瑪曲土壤E+和E-沒有顯著差異。從微生物真菌和細(xì)菌豐度來看，臨澤和瑪曲的高于榆中，微生物生物體量比較多，間接說明微生物碳含量高。臨澤E+植物生長的土壤微生物真菌和細(xì)菌豐度之和高于E-植物生長的土壤，而瑪曲E+植物生長的土壤微生物真菌和細(xì)菌豐度卻低于E-植物生長的土壤，說明微生物量臨澤高于瑪曲，也間接地說明了三者土壤之間微生物碳的差異及臨澤E+與E-之間的差異。

土壤微生物種類豐富，最常見的有細(xì)菌和真菌，其對土壤生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動起關(guān)鍵性作用，參與了有機(jī)質(zhì)，礦物質(zhì)的分解及養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等，是衡量土壤肥力的重要因子[53]。Buyer等[54]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌存在對土壤中的細(xì)菌和真菌有抑制作用，而周勇等[55]和黃璽等[56]研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌增加了土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量。而本研究發(fā)現(xiàn)，3種土壤中，E+植株使得細(xì)菌的豐度隨著時間的延長增加，而真菌的豐度卻在降低。目前關(guān)于內(nèi)生真菌對土壤細(xì)菌的影響規(guī)律與真菌相反的研究結(jié)果未見報道，因此在未來的研究中需要進(jìn)一步來確認(rèn)本試驗結(jié)果并確定其機(jī)制。內(nèi)生真菌對土壤細(xì)菌和真菌的影響因禾草種類、內(nèi)生真菌基因型以及土壤類型的不同而有所差異[54-56]。

AOB是硝化作用的主要功能基因，Bowatte等[25]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌侵染能提高一系列C3和C4植物的土壤硝化潛力。內(nèi)生真菌Phomopsisliquidambari對水稻的侵染也顯著提高了土壤礦質(zhì)氮含量、土壤硝化潛力和AOB豐度[57]。從本研究結(jié)果來看，內(nèi)生真菌的侵染顯著提高了AOB豐度，但與土壤類型及生長周期之間沒有互作。nirK基因是含銅的亞硝酸還原酶，可將NO2還原為NO，土壤pH、土壤有機(jī)質(zhì)和土壤呼吸等都會影響nirK反硝化細(xì)菌的豐度[58]。結(jié)果顯示，瑪曲土壤中的nirK反硝化細(xì)菌的豐度顯著高于臨澤和榆中土壤，這可能是因為瑪曲土壤中的有機(jī)碳含量要顯著高于另外兩種土壤所導(dǎo)致的?，斍寥乐?，E+和E-植物生長土壤的nirK反硝化細(xì)菌的豐度也存在顯著差異；E+顯著高于E-，這可能是因兩者之間土壤pH不同導(dǎo)致的。nosZ基因是一氧化氮還原酶基因，可將NO2還原為無害的N2[58]。Philippot等[59]研究發(fā)現(xiàn)，在不同土壤中，接種微生物的土壤潛在反硝化作用強(qiáng)于未接種微生物的土壤。本研究結(jié)果表明，在臨澤和瑪曲土壤中，隨著植物的生長nosZ基因豐度E+顯著大于E-，而瑪曲未發(fā)生變化。目前內(nèi)生真菌對反硝化作用的研究極少，猜測這可能是內(nèi)生真菌的存在影響了野大麥的根系分泌物，從而對土壤的氮循環(huán)細(xì)菌的生境產(chǎn)生了影響；根系分泌物又因植物種類、土壤類型、內(nèi)生真菌基因和植物生長時間等非生物因素的影響，這種影響又造成土壤養(yǎng)分等發(fā)生改變。這就需要不斷地深入研究，確定內(nèi)生真菌具體會改變哪些根系分泌物質(zhì)，這些分泌物質(zhì)的改變又與土壤的氮循環(huán)有何關(guān)聯(lián)。

4 結(jié)論

本研究揭示了內(nèi)生真菌的侵染對土壤化學(xué)性質(zhì)和土壤微生物群落的影響，探討了內(nèi)生真菌-土壤類型-植物生長時間之間的相關(guān)性。本研究發(fā)現(xiàn)Epichloёbromicola侵染野大麥增加了土壤全碳、全氮和微生物碳的含量，提高了土壤pH，促進(jìn)了土壤細(xì)菌、AOB、nirK和nosZ的豐度，降低了土壤真菌的豐度；又因土壤類型和植物生長時間的不同，內(nèi)生真菌侵染對土壤化學(xué)性質(zhì)和土壤微生物群落的影響存在差異。該研究為退化土壤的改良提供了理論依據(jù)和新的方法，也建議未來在退化土壤改良和恢復(fù)時，應(yīng)考慮種植一些帶內(nèi)生真菌的植物。