向承林

摘? 要：簡述MoFlo XDP超流式細(xì)胞分選儀的工作原理、使用調(diào)試和日常維護(hù)，介紹MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀的使用和管理。

關(guān)鍵詞：MoFlo XDP;超速流式細(xì)胞分選儀;使用和管理

中圖分類號：R197.39? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2019）26-0190-03

Abstract： This paper briefly describes the working principle， debugging and daily maintenance of the MoFlo XDP ultra speed flow cytometry sorter， and introduces the use and management of the MoFlo XDP ultra speed flow cytometry sorter.

Keywords： MoFlo XDP; ultra speed flow cytometry sorter; use and management

流式細(xì)胞分選儀是電子技術(shù)、激光技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、熒光化學(xué)技術(shù)及流體理論為一體的細(xì)胞分選技術(shù)，可以從細(xì)胞群體中分選出高純度的目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞蛋白檢測、細(xì)胞基因測序等應(yīng)用。MoFlo XDP超速流式分選儀是美國Beckman Coulter的第三代流式細(xì)胞分選儀，可根據(jù)細(xì)胞胞內(nèi)蛋白、DNA、RNA及細(xì)胞表面標(biāo)志物的不同，以每秒10萬個(gè)細(xì)胞的速度檢測包含F(xiàn)SC、SSC在內(nèi)的17參數(shù)對細(xì)胞進(jìn)行快速準(zhǔn)確的分析和分選，同時(shí)可最多對四種細(xì)胞進(jìn)行分選，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞動力學(xué)、生理學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的研究。

1 工作原理

MoFlo XDP是一款在空氣中激發(fā)和分選的流式細(xì)胞分選儀，當(dāng)單個(gè)懸浮顆粒通過噴嘴后在空氣中被激光束照射并對激光進(jìn)行散射，同時(shí)所帶的熒光化合物發(fā)被激發(fā)并發(fā)射出熒光，檢測器同時(shí)對散射光和熒光進(jìn)行分析并對包裹細(xì)胞的液流進(jìn)行充電，通過震蕩液流使目標(biāo)細(xì)胞包含在帶電的液滴中，在通過高壓靜電偏轉(zhuǎn)板時(shí)收集到指定容器中，實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的分析和分選。

2 儀器調(diào)試

2.1 激光

MoFlo XDP采用了固態(tài)激光，激光開啟后應(yīng)預(yù)熱5分鐘使激光穩(wěn)定工作，當(dāng)使用355nm的高功率激光時(shí)，應(yīng)當(dāng)預(yù)熱30分鐘，否則可能因高功率的紫外激光對儀器光學(xué)部件造成損壞。

2.2 液流調(diào)整

打開液流系統(tǒng)，點(diǎn)擊觸屏面板上的“Debubble”進(jìn)行排氣泡，當(dāng)能觀察到穩(wěn)定的液流即可停止。調(diào)整噴嘴的上下、左右、前后千分尺和平衡臺上的2個(gè)旋鈕，使液流垂直對齊。

2.3 光路校正

將MoFlo XDP的質(zhì)控（QC）熒光微球用無菌的超純水按1：20進(jìn)行稀釋，上樣微球，調(diào)整樣品壓力差使EPS為100，打開QC面板，調(diào)整激光的上下、左右、前后的千分尺和電壓，使面板上各通道的信號形成最亮、最集中的一群，且CV值在2.5以下即可（如圖1）。

2.4 液滴調(diào)整

打開液流震蕩開關(guān)，選擇噴嘴直徑，尋找激光位置，調(diào)整振蕩頻率（Frequency）、整幅（Amplitude）。選擇到分選調(diào)整面板，打開靜電偏轉(zhuǎn)板電源并加電壓到3000Volts，調(diào)整Charge Phase到分選液流偏轉(zhuǎn)最差的角度，然后調(diào)整到以該數(shù)值加減180°的角度，得到穩(wěn)定的四路預(yù)分選液流。MoFlo XDP使用了IntellisortⅡ智能化分選模塊，使用70μm和100μm噴嘴時(shí)可通過計(jì)算機(jī)計(jì)算液滴延遲時(shí)間（Drop Delay）并自動微調(diào)振幅以維持液滴斷點(diǎn)（如圖2）。

2.5 分選設(shè)置

上樣并通過在軟件Summit V5.4.0上對細(xì)胞散射和熒光進(jìn)行分析、設(shè)門，設(shè)定分選設(shè)置，選擇分選位置，可最多同時(shí)對L1、L2、R1、R2四個(gè)位置分選四種特定的細(xì)胞，并適配0.5mL、1.5mL、2mL、5mL、15mL、50mL離心管及標(biāo)準(zhǔn)流式管作為上樣和分選容器。同時(shí)MoFlo XDP還可通過“CyClone”分選設(shè)置，使用玻片和不同規(guī)格的孔板進(jìn)行單種細(xì)胞分選。

2.6 關(guān)機(jī)

分選完成后，調(diào)整壓力差至5.0PSI，分別先后上樣2mL5%次氯酸鈉、75%乙醇、無菌超純水進(jìn)行管路清洗，關(guān)閉系統(tǒng)和激光，排除鞘液桶氣壓。

3 日常維護(hù)與管理

（1）設(shè)備預(yù)約：流式細(xì)胞分選儀應(yīng)至少提前24小時(shí)預(yù)約使用，預(yù)約前應(yīng)提前告知樣品來源、抗體熒光染料信息和樣品信息。

（2）環(huán)境質(zhì)控：MoFlo XDP應(yīng)置放于密閉的潔凈房間內(nèi)，室溫控制在18-22℃，濕度控制在20%-65%，同時(shí)配備紫外滅菌設(shè)備，實(shí)驗(yàn)前后使用紫外照射滅菌15min。

（3）鞘液管路清洗：MoFlo XDP的鞘液管路系統(tǒng)采用

了全封閉系統(tǒng)，需要定期對鞘液管路進(jìn)行滅菌維護(hù)。鞘液應(yīng)使用無菌處理的PBS或生理鹽水，鞘液需要定期更換;每月使用75%乙醇做為鞘液，進(jìn)行管路滅菌，每次進(jìn)行2小時(shí)，再使用無菌PBS或生理鹽水沖洗管路2小時(shí)，清洗殘留乙醇;半年更換一次濾芯，拆下濾芯后可使用5%次氯酸鈉進(jìn)行一次管路清洗，再使用75%乙醇沖洗，安裝新的濾芯，用無菌PBS或生理鹽水進(jìn)行沖洗，濾芯不可接觸次氯酸鈉溶液。

（4）噴嘴清洗：噴嘴應(yīng)每周或出現(xiàn)液滴狀態(tài)不穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行拆卸和清洗，清洗時(shí)取下噴嘴，嘴尖朝上放入盛有2mL無菌超純水的流式管里，進(jìn)行超聲清洗15min，清洗2次;將5mL注射器拔出針頭，吸入無菌超純水，對準(zhǔn)噴嘴尾部并壓緊，推動注射器可看到噴嘴有穩(wěn)定的液流噴出，再將注射器對準(zhǔn)噴嘴尖部，緩慢推動，液體沿噴嘴內(nèi)壁緩慢流出即說明噴嘴無堵塞，重復(fù)2次。

（5）進(jìn)樣針清洗：MoFlo XDP提供了進(jìn)樣針外壁滅菌

系統(tǒng)，點(diǎn)擊觸屏上的“Clean”按鈕，使用消毒液桶內(nèi)預(yù)裝的消毒鞘夜對進(jìn)樣針外壁滅菌;再點(diǎn)擊“Rinse”按鈕，使用鞘液對進(jìn)樣針潤洗。

（6）上樣管路清洗：開機(jī)調(diào)試前，應(yīng)先上樣75%乙醇對上樣管路滅菌5min，再使用無菌超純水上樣5min。

（7）進(jìn)行分選時(shí)，應(yīng)使用無水乙醇對分選倉使用無水乙醇進(jìn)行擦拭滅菌，保證分選倉的無菌狀態(tài)，避免分選時(shí)樣品污染。

（8）分選過程中發(fā)現(xiàn)有樣品堵塞情況，應(yīng)立即停止分選，點(diǎn)擊觸屏上的“Backflush”按鈕對上樣管路進(jìn)行回沖2次，并上樣無菌超純水沖洗5min。

（9）每次完成實(shí)驗(yàn)后，需要更換鞘液并加至鞘液桶上限刻度線，如使用自配的PBS或其他鞘液需要進(jìn)行高壓滅菌;更換鞘液同時(shí)需要清倒廢液桶的廢液，并沖洗，防止下次實(shí)驗(yàn)因廢液桶溢出而損壞空氣泵。

（10）MoFl XDP的光路系統(tǒng)在廠家工程師的指導(dǎo)下可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行光路調(diào)整和更改，嚴(yán)禁非管理人員擅自對電子系統(tǒng)、光路系統(tǒng)進(jìn)行更改。

（11）樣品要求：對于需要進(jìn)行分選的樣品，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行無菌處理，防止污染的樣品對系統(tǒng)管理造成污染;上樣前應(yīng)使用300目（50μm）的無菌濾網(wǎng)過濾，防止對上樣管路造成堵塞;拒絕接受有感染性病毒、微生物樣品進(jìn)行上樣分選。

4 結(jié)束語

MoFlo XDP超速流式細(xì)胞分選儀擁有高速度、高純度、高回收率和高準(zhǔn)確性的特點(diǎn)，但是對運(yùn)行環(huán)境要求較高，且設(shè)備零配件價(jià)格昂貴，到貨周期長，所以正確、規(guī)范的調(diào)試方法和日常管理方法，可以保證MoFlo XDP的穩(wěn)定運(yùn)行，準(zhǔn)確有效地分選，節(jié)約設(shè)備的維護(hù)成本。

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