王燕新 廖圓圓 阿依木古麗 齊驁穹 李海健 徐紅偉 楊具田蔡勇

（1. 西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，蘭州 730030；2. 西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)部，蘭州 730030）

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育是由許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑上的調(diào)控因子協(xié)同來(lái)執(zhí)行的，體內(nèi)幾乎所有的激素都直接或間接地參與機(jī)體生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)［1-2］。對(duì)于生物的整個(gè)生長(zhǎng)和分化過(guò)程起到重要調(diào)節(jié)作用的是同源盒基因在動(dòng)物組織中表達(dá)出來(lái)的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［3-5］。LIM同源盒3基因（LIM homeobox gene 3，LHX3）是位于腦垂體上游重要的調(diào)節(jié)因子之一［6］，其蛋白產(chǎn)物是垂體發(fā)育和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元特化所需要的神經(jīng)內(nèi)分泌轉(zhuǎn)錄因子［7-10］。LHX3因其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)使其既可以進(jìn)行自調(diào)節(jié)又可以激活垂體激素基因，包括生長(zhǎng)激素（Growth hormone，GH）、催乳素（Prolactin，PRL）、促黃體生成素（Luteini-zing hormone，LH）、促卵泡生成激素（Follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）和促甲狀腺素（Thyrotropin，thyroid stimulating hormone，TSH）等［11］，而這些激素大多與動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖有一定的聯(lián)系［6］。由于LHX3及其產(chǎn)物在垂體的早期發(fā)育及垂體激素分泌中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，如對(duì)POUIF1、PRL和GH的調(diào)控［12］，故該基因在綿羊的生長(zhǎng)發(fā)育方面具有重要的遺傳效應(yīng)。插入/缺失是研究動(dòng)植物基因組DNA進(jìn)化和育種、種質(zhì)保護(hù)、選擇利用的最簡(jiǎn)單快速的分子標(biāo)記之一，它不僅擴(kuò)增產(chǎn)物帶型簡(jiǎn)單清晰，穩(wěn)定性和產(chǎn)物分離效果均明顯優(yōu)于SSR標(biāo)記［13］；還較SNP標(biāo)記檢測(cè)簡(jiǎn)單便捷，對(duì)儀器設(shè)備和技術(shù)要求較低，在電泳技術(shù)平臺(tái)上即可進(jìn)行［14］。因此，動(dòng)植物中插入/缺失的開(kāi)發(fā)、鑒定和功能分析越來(lái)越受到研究者的關(guān)注［15］。本實(shí)驗(yàn)以灘羊（Tan sheep，TS）、小尾寒羊（Small-tailed Han sheep，STHS）、蘭州大尾羊（Lanzhou Fat-tailed sheep，LFTS）為研究對(duì)象，以LHX3作為研究影響綿羊生長(zhǎng)發(fā)育的候選基因，尋找與綿羊生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的分子標(biāo)記，為綿羊的分子選育和種質(zhì)資源的有效利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為1 269只綿羊（1-1.5歲，公母隨機(jī)），生長(zhǎng)發(fā)育正常、健康無(wú)病且同一品種綿羊的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件相同。其中灘羊（TS，n=1 018，寧夏鹽池縣鑫海食品有限公司）、小尾寒羊（STHS，n=131，甘肅永靖縣瑞霖科技養(yǎng)殖有限公司）、蘭州大尾羊（LFTS，n=120，甘肅永靖縣瑞霖科技養(yǎng)殖有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)收集 先將綿羊耳緣被毛刮干凈，用75%酒精擦拭消毒之后用耳鉗采集黃豆粒大小耳組織，放入1.5 mL離心管并加1 mL 75%乙醇，固定后帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃冰箱低溫保存。所有綿羊的數(shù)據(jù)測(cè)量均由同一人采樣同一標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量，包括體長(zhǎng)（Body length，BL）、體重（Body weight，BW）、體高（Body hight，BH）、 胸 深（Chest depth，ChD）、 胸寬（Chest width，ChW）、胸圍（Chest cicumference，ChC）、管?chē)–annon circumference，CaC）和十字部高（Hip width，HW）。后期根據(jù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行不同綿羊品種LHX3基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析。

1.2.2 基因組DNA的提取及檢測(cè) 采用苯酚-氯仿抽提法［16］從耳緣組織中提取總基因DNA，并用核酸測(cè)定儀測(cè)定基因組DNA的濃度和OD值。當(dāng)OD值260/280在1.8-2.0之間時(shí)，則DNA質(zhì)量較優(yōu)，符合試驗(yàn)要求。

1.2.3 引物設(shè)計(jì) 按照GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)公布的綿羊LHX3基因的mRNA序列（GenBank：NC_019460.2），參照Z(yǔ)hao等［6］設(shè)計(jì)的特異性引物用于擴(kuò)增不同品種綿羊的LHX3基因。引物序列為（F：5'-CTCTGAACTGCCAGGACCCA-3'；R：5'-ACTCCA-CGATGCAGCCAAGA-3'），由上海生物工程科技有限公司合成。

1.2.4 PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增條件 PCR 擴(kuò)增體系為50 μL：基因組 DNA 模板 3.0 μL，上游引物L(fēng)HX3-F 1.5μL，下游引物L(fēng)HX3-R 1.5 μL，2×Master Mix 25 μL，ddH2O 19 μL。

為了確定引物的最佳退火溫度（Tm），先利用梯度PCR進(jìn)行篩選，隨后在最佳Tm值下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，61.4℃退火 30 s，72℃延伸30 s，共 30個(gè)循環(huán)；72℃ 延伸5 min，4℃保存。采用1.5%瓊脂糖凝膠對(duì)其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，并將 PCR產(chǎn)物送上海生物工程科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法 將測(cè)序結(jié)果與綿羊LHX3基因序列（GenBank：NC_019460.2）做比對(duì)，利用網(wǎng)站www.Msrcall.com計(jì)算和分析哈德-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）、有效等位基因數(shù)（Ne）、雜合度（He）、純合度（Ho）、多態(tài)性信息（PIC）、基因型頻率和等位基因頻率。利用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)［17］，并對(duì)不同位點(diǎn)基因型的分布進(jìn)行χ2檢測(cè)，當(dāng)χ2＜χ20.05時(shí)，表明該基因位點(diǎn)處在Hardy-Weinberg動(dòng)態(tài)平衡；當(dāng)時(shí)為Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)［18-19］。利用PIC軟件統(tǒng)計(jì)多態(tài)信息含量（PIC），公式如下：

Pi和Pj分別為第i個(gè)和第j個(gè)等位基因頻率，n為等位基因數(shù)。當(dāng)PIC＞0.5時(shí)，該突變位點(diǎn)處在高度多態(tài)；當(dāng)0.25＜PIC≤0.5時(shí)為中度多態(tài)；當(dāng)PIC≤0.25時(shí)為低度多態(tài)。

對(duì)于綿羊的8個(gè)生長(zhǎng)性狀按照LHX3所表現(xiàn)出來(lái)的 3 個(gè)基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用SPSS19.0軟件的一般線性模型（GLM）分析個(gè)體基因型對(duì)綿羊生長(zhǎng)性狀的影響。Y=u+maker+gender+MG+e，式中u為群體平均值，marker為基因型效應(yīng)，gender為性別效應(yīng)，MG為基因型與性別的互作效應(yīng)，e為隨機(jī)殘差。對(duì)同一品種的不同基因型進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果用“Mean±SE”表示。

2 結(jié)果

2.1 LHX3基因PCR擴(kuò)增分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖凝膠（120 V，60 min）電泳，結(jié)果如圖1所示，LHX3基因 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶清晰且無(wú)雜帶，PCR產(chǎn)物具有3種類型：其中插入型（AA）為280 bp單一條帶，缺失型（BB）為251 bp單一條帶，插入/缺失型（AB）為251 bp和280 bp兩個(gè)條帶（圖1）。

圖1 綿羊LHX3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果

2.2 序列測(cè)定與分析

對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序峰圖如圖2所示，插入/缺失片段為“GCCTGGACTGTGATGGGCACCCT CCGGGGTAG”，所得到的結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中預(yù)測(cè)的結(jié)果相同（NC_019460.2：g.3107494-3107522 del GGCCTGGACTGATGGGCACCCTCCGGG）。

測(cè)序結(jié)果（圖2）顯示，基因型為插入/插入型（AA）的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為280 bp，缺失/缺失型（BB）為251 bp，經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其核苷酸序列與GenBank綿羊LHX3基因序列的同源度為96%以上，所擴(kuò)增產(chǎn)物為綿羊LHX3基因片段。

2.3 LHX3基因多態(tài)性位點(diǎn)分析

對(duì)3個(gè)品種綿羊中的基因型頻率和基因頻率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表1所示，這3個(gè)品種綿羊的He和Ho非常接近，Ne接近于2。對(duì)于目前的基因位點(diǎn)來(lái)說(shuō)，LTFS和STHS處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)（P＜0.05），而TS處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)（P＞0.05），3個(gè)綿羊品種的PIC都呈現(xiàn)為中等程度的多態(tài)性（0.25＜PIC≤0.5）。由表2可以看出綿羊不同品種間基因型多態(tài)性分布的卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)中，LFTS、STHS、TS兩兩之間的基因型頻率與等位基因頻率均具有差異（P＜0.01）。

表1 LHX3基因多態(tài)位點(diǎn)分析

表2 不同品種間LHX3多態(tài)性基因型分布的卡方獨(dú)立性檢驗(yàn)

2.4 LHX3基因型與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析

本實(shí)驗(yàn)著重于考慮基因型效應(yīng)對(duì)于表型值的影響程度。采用 SPSS19.0 軟件和Grandpad Prism分析不同基因型間生長(zhǎng)性狀差異的顯著性（表3）。

表3 LHX3基因不同基因型與生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析

2.4.1LHX3基因型與蘭州大尾羊生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析 由圖3可以看出，在LFTS中，BB基因型個(gè)體各生長(zhǎng)性狀均高于AA基因型和AB基因型個(gè)體，其次，LFTS的BB基因型的BL、BH這2個(gè)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)明顯高于AA基因型和AB基因型（P＜0.01），而在ChD、CaC這2個(gè)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)則表現(xiàn)為BB基因型明顯高于AB基因型（P＜0.01）。

圖3 LHX3基因不同基因型與LFTS生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析

圖4 LHX3基因不同基因型與STHS生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)聯(lián)分析

2.4.2LHX3基因型與小尾寒羊生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析由圖4可以看出，在STHS這一群體中，BB基因型各生長(zhǎng)性狀大多高于AA基因型和AB基因型，且在ChD、CaC這兩個(gè)生長(zhǎng)性狀中BB基因型顯著高于AB基因型（P＜0.01）。STHS的BB基因型的 ChC、ChD極顯著高于AA基因型（P＜0.01）。

2.4.3LHX3基因與灘羊生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析 由圖5可以看出，TS的生長(zhǎng)性狀指標(biāo)中BB基因型在BL、ChD上顯著高于AB基因型（P＜0.01），BB基因型ChD、CaC這2個(gè)生長(zhǎng)性狀明顯高于AA基因型（P＜0.05）。在BL這個(gè)生長(zhǎng)性狀中，AA基因型和BB基因型都表現(xiàn)出較高優(yōu)勢(shì)，且BB基因型優(yōu)于AA基因型。通過(guò)以上分析可以看出該29 bp插入/缺失位點(diǎn)與綿羊的生長(zhǎng)性狀指標(biāo)明顯相關(guān)。

圖5 LHX3基因不同基因型與TS生長(zhǎng)形狀之間的關(guān)聯(lián)分析

3 討論

3.1 LHX3基因群體遺傳特征分析

Ne、He、PIC、Ho等指標(biāo)從不同角度反映了群體的遺傳變異程度。一般認(rèn)為群體的He與遺傳多樣性密切相關(guān)，群體He越高，群體的遺傳變異越大，遺傳多樣性就越豐富，選擇的潛力就越大［20］。本實(shí)驗(yàn)中，3個(gè)不同綿羊品種LHX3基因的Ho均在0.5左右，He均在0.49左右，Ne均在1.9左右，PIC均在0.37左右，為中度多態(tài)位點(diǎn)，表明在該位點(diǎn)的遺傳變異相對(duì)較高。

根據(jù)表1中HWE和PIC的分類，可以看出29個(gè)bp插入/缺失位點(diǎn)在3個(gè)不同綿羊品種中均處于中等程度多態(tài)。也就是說(shuō)，29 bp的插入/缺失位點(diǎn)具有豐富的遺傳多樣性，這個(gè)位點(diǎn)可以用來(lái)評(píng)估綿羊遺傳資源的豐富程度。LFTS和STHS品種中HWE的P值均低于0.05，造成這種情況的原因可能是選種和選配不平衡，群體數(shù)量較小并受到高度選擇，導(dǎo)致群體偏離了HWE規(guī)律。

3.2 LHX3基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析

動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程是由眾多調(diào)控因子綜合作用的結(jié)果，因此對(duì)一些有著重要功能的基因結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)顯得十分重要。LHX3基因不僅對(duì)許多器官的發(fā)育和功能有重要的作用，其突變會(huì)嚴(yán)重影響其靶器官發(fā)育和功能［21］，而且它還是非常重要的垂體轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖起重要作用，它既可以進(jìn)行自調(diào)節(jié)又可以激活與動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖有一定的聯(lián)系的垂體激素基因［6］，包括GH、PRL、LH、FSH和TSH等［11］。國(guó)內(nèi)外對(duì)LHX3基因的研究大多集中在患者內(nèi)分泌系統(tǒng)、激素缺乏、肺癌相關(guān)病理研究以及對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)控作用上［22-28］，關(guān)于LHX3作為改善家畜生長(zhǎng)性狀的候選基因的報(bào)道逐漸增多，LHX3基因多態(tài)性在山羊和牛上的研究已有報(bào)道［11］，發(fā)現(xiàn)LHX3中存在插入/缺失位點(diǎn)，其中一些單核苷酸所呈現(xiàn)出來(lái)的多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms，SNP）位點(diǎn)可以影響山羊和奶牛生長(zhǎng)性狀和奶的品質(zhì)［11，29］。但關(guān)于LHX3基因多態(tài)性對(duì)綿羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析的研究并不多見(jiàn)。

遺傳變異主要有兩方面的應(yīng)用，一是基于功能變異的選擇；二是將該遺傳變異用于遺傳評(píng)估的模型中［30］。經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)的長(zhǎng)期發(fā)展，與之而來(lái)的是更多深入的研究，利用分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)家畜進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析得到廣泛運(yùn)用［31-33］。插入/缺失作為一種新的遺傳標(biāo)記輔助選擇方法，能夠更加快速有效地探究LHX3基因多態(tài)性是否影響綿羊的生長(zhǎng)發(fā)育，有研究報(bào)道了關(guān)鍵基因插入/缺失與家畜生長(zhǎng)性狀相關(guān)，如閆海龍等［34］發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)激素受體（Growth hormonereceptor，GHR）基因9 bp的插入/缺失能顯著提高陜北白絨山羊的體重和多個(gè)生長(zhǎng)性狀；鄔明麗等［35］報(bào)道黃牛溶酶體轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子（Lysosomal trafficking regulator，LYST）基因 22 bp 的插入 /缺失突變能夠顯著影響郟縣紅牛的生長(zhǎng)性狀。

本實(shí)驗(yàn)分析了LHX3基因29 bp插入/缺失位點(diǎn)與綿羊生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)系，在TS中BB基因型的個(gè)體存在諸多優(yōu)良性狀包括BL、BW、ChD和CaC，并且純合子BB基因型和AA基因型比雜合子AB基因型個(gè)體有著更高的先天優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LFTS、STHS和TS中LHX3基因的3個(gè)基因型的生長(zhǎng)性能都存在顯著性差異，可見(jiàn)綿羊生長(zhǎng)性能與這個(gè)插入/缺失位點(diǎn)之間存在一定的相關(guān)性。通過(guò)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)BB基因型有利于LFTS、STHS和TS的生長(zhǎng)，這是一個(gè)潛在的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，可用于綿羊的遺傳分析和優(yōu)良個(gè)體選擇。本實(shí)驗(yàn)所用樣本雖然存在一定的局限性，但結(jié)果表明B等位基因是優(yōu)勢(shì)基因，純合子的BB基因型個(gè)體更具有先天優(yōu)勢(shì)，可以在育種工作中選擇。3個(gè)綿羊品種均為中度多態(tài)且數(shù)值接近，說(shuō)明這3個(gè)綿羊品種中的遺傳變異程度相似，具有相對(duì)較高的選擇潛力。

4 結(jié)論

LFTS、STHS和TS的LHX3基因中存在一個(gè)29 bp的插入/缺失（NC_019460.2：g.3107494-3107522 del GGCCTGGACTGATGGGCACCCTCCGGG）突變，該突變與生長(zhǎng)性能相關(guān)，可以作為綿羊選育的DNA標(biāo)記位點(diǎn)。