周恒 姜蕓 許葉祥 錢生輝 繆莉，2

（1. 揚(yáng)州大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，揚(yáng)州 225127；2. 中國科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510301）

群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）是微生物通過分泌、釋放一些特定的信號分子，并通過這些信號分子的濃度變化，來感知周圍環(huán)境中同類細(xì)胞密度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的現(xiàn)象。它可以調(diào)節(jié)許多微生物的生理活動(dòng)，也可以調(diào)節(jié)不同細(xì)菌之間的關(guān)系，是微生物為適應(yīng)周圍環(huán)境的一種信號交流機(jī)制［1］。致病菌合成致病毒素而產(chǎn)生致病作用與致病菌在人體內(nèi)形成生物膜而產(chǎn)生的對抗生素的抗性作用受到廣泛關(guān)注［2］，且致病病毒的合成和生物膜的形成均受群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過群體感應(yīng)抑制劑介導(dǎo)致病菌的群體感應(yīng)來控制致病菌的致病效應(yīng)，使其不會產(chǎn)生抗性突變從而產(chǎn)生耐藥性［3］。所以，尋找群體感應(yīng)抑制劑有望從新的角度解決細(xì)菌耐藥性問題［4］。因此，近年來從天然源［5-7］分離或從合成化合物［8］中篩選群體感應(yīng)抑制劑的研究越來越多。

海洋微生物資源豐富且具有不同于陸地微生物的活性物質(zhì)，目前的天然抗菌藥物大約有2/3來自放線菌［9］，放線菌的藥用價(jià)值已經(jīng)得到認(rèn)可［10］，從放線菌中分離出數(shù)百種具有不同結(jié)構(gòu)或顯著生物活性的化合物，其中約70%的天然衍生化合物正在臨床應(yīng)用中［11］。因此，以海洋放線菌為篩選對象，對其進(jìn)行群體感應(yīng)抑制活性研究，優(yōu)化活性菌株的培養(yǎng)條件，對抗菌感染研究具有一定的理論和實(shí)踐價(jià)值［12］。本研究對前期從連云港表層海水中分離篩選得到的一株具有較高群體感應(yīng)抑制活性的海洋放線菌S. parvulusHY026［13］進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和活性復(fù)篩，再優(yōu)化其培養(yǎng)基成分，以提高其產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力，為進(jìn)一步的活性物質(zhì)分離純化研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用的測試菌是實(shí)驗(yàn)室保存的從連云港表層海水分離所得的海洋微小鏈霉菌S. parvulusHY026，群體感應(yīng)報(bào)告菌是由香港科技大學(xué)提供的紫色桿菌Chromobacterium violaceum12472。

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g/L、硝酸鉀1 g/L、氯化鈉0.5 g/L、三水合磷酸氫二鉀0.5 g/L、七水合硫酸鎂0.5 g/L、七水合硫酸亞鐵0.01 g/L、海鹽33 g/L、pH 7.4-7.6，用于培養(yǎng)放線菌S. parvulusHY026。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L、胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉5 g/L、pH 7.4-7.6，用于培養(yǎng)報(bào)告菌紫色桿菌。

1.2 方法

1.2.1 HY026的復(fù)蘇、發(fā)酵及粗提物的制備 將凍存管中的菌株S. parvulusHY026轉(zhuǎn)移到高氏一號液體培養(yǎng)基中，30℃、140 r/min振蕩復(fù)蘇培養(yǎng)5 d。從復(fù)蘇菌液中吸取5 mL菌液接種到50 mL高氏一號液體培養(yǎng)基中相同條件下培養(yǎng)5 d。將發(fā)酵液用紗布過濾，分別收集濾液和菌體。濾液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，菌體用10 mL氯仿/甲醇（1∶1）萃取兩次。將分別合并濾液、菌體的有機(jī)相萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥得到粗提物，稱重后加入一定量的甲醇或DMSO配制成50 mg/mL或100 mg/mL的粗提物樣品液用于活性測定。

1.2.2 HY026粗提物群體感應(yīng)抑制活性的測定 采用濾紙片法測定HY026發(fā)酵產(chǎn)物的群體感應(yīng)抑制活性。吸取100 μL生長良好的紫色桿菌液于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，用無菌棉簽均勻涂布。吸取10μL HY026的粗提物樣品液滴加到濾紙片上，風(fēng)干后將濾紙片反扣到培養(yǎng)基上，做兩組平行，以10 μL溶劑甲醇為陰性對照，以化合物呋喃酮、吡啶（50 μg）為陽性對照。將培養(yǎng)皿封口后置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48 h，測量紫色素抑制圈直徑。

1.2.3 HY026最佳碳源的選擇 根據(jù)放線菌的常用碳源，選擇5種不同碳源（可溶性淀粉、乳糖、玉米粉、葡萄糖、麥芽糖），采用單因子試驗(yàn)，進(jìn)行HY026的碳源優(yōu)化。每種碳源分別設(shè)置兩個(gè)濃度（1%和2%），以代替原高氏一號培養(yǎng)基中的碳源，每個(gè)處理設(shè)兩個(gè)平行。將HY026接種到配制好的各培養(yǎng)基中，按1.2.1中所述發(fā)酵條件進(jìn)行振蕩培養(yǎng)和代謝物的提取，以備后續(xù)的活性測試。

1.2.4 HY026最佳氮源的選擇 根據(jù)放線菌的常用氮源，選擇5種不同氮源（KNO3、黃豆粉、胰蛋白胨、酵母粉、（NH4）2SO4），采用單因子試驗(yàn)，進(jìn)行HY026的氮源優(yōu)化。每種氮源分別設(shè)置兩個(gè)濃度（1‰和2‰），以代替原高氏一號培養(yǎng)基中的氮源。每個(gè)處理設(shè)兩個(gè)平行。將HY026接種到配制好的各培養(yǎng)基中，按1.2.1中的發(fā)酵條件進(jìn)行振蕩培養(yǎng)和代謝物的提取，以備后續(xù)的活性測試。

1.2.5 HY026培養(yǎng)基的優(yōu)化 在確定好最佳碳源和氮源后，以這兩種碳氮源，同時(shí)選取高氏一號培養(yǎng)基中另外兩種主要成分，設(shè)計(jì)四因素四水平L16（45）的正交實(shí)驗(yàn)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)平行，因子水平設(shè)計(jì)見表1。將HY026接種到配制好的各培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和代謝物提取，通過測定發(fā)酵液提取物的質(zhì)量、群體感應(yīng)抑制活性確定該菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因子與水平

1.2.6 培養(yǎng)基優(yōu)化前后HY026粗提物質(zhì)量及群體感應(yīng)抑制活性的比較 按照正交試驗(yàn)確定好的最佳培養(yǎng)條件配置培養(yǎng)基，并配置原高氏一號培養(yǎng)基，將HY026菌種接入這兩種培養(yǎng)基中，各設(shè)3個(gè)平行，在30℃，140 r/min條件下培養(yǎng)5 d，按1.2.1中所述方法獲得粗提物并配制成樣品液，測定其活性。

2 結(jié)果

2.1 HY026群體感應(yīng)抑制活性的復(fù)篩

從50 mL HY026的高氏一號培養(yǎng)液中，獲得7.3 mg發(fā)酵液粗提物和143.3 mg的菌體；對HY026的菌體浸提液、發(fā)酵液粗提物以及濃縮后的萃余液進(jìn)行群體感應(yīng)抑制活性的測定。結(jié)果（圖1）顯示，菌體浸提液、萃余液及溶劑甲醇均無活性，而粗提物具有較高的群體感應(yīng)抑制活性，其抑制圈直徑為14 mm。無活性、陽性對照呋喃酮與吡啶的色素抑制圈直徑分別為16 mm與19.5 mm。表明菌株HY026所產(chǎn)生的活性物質(zhì)主要存在于胞外，發(fā)酵液經(jīng)兩次萃取后，活性代謝產(chǎn)物已萃取完全。

2.2 HY026最佳碳源的選擇

選擇淀粉、乳糖、玉米粉、葡萄糖和麥芽糖為碳源，分別以1%和2%的濃度替代高氏一號培養(yǎng)基中的碳源，在其他條件不變的情況下對HY026進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定各發(fā)酵液的代謝物產(chǎn)量和群體感應(yīng)抑制活性。結(jié)果（圖2）顯示，以1% 淀粉、2% 淀粉、2% 玉米粉以及1% 麥芽糖為碳源時(shí)，該菌代謝產(chǎn)物質(zhì)量較高，在7 mg以上；以玉米粉為碳源時(shí)，該菌株的群體感應(yīng)抑制活性顯著高于其他處理，其對紫色桿菌產(chǎn)紫色素的抑菌圈直徑超過20 mm。綜合菌株發(fā)酵液代謝物產(chǎn)量以及群體感應(yīng)抑制活性，確定2% 玉米粉為HY026的最佳碳源。

圖1 HY026的菌體浸提液、發(fā)酵液粗提物及萃余液的群體感應(yīng)抑制活性

圖2 不同碳源對HY026代謝物產(chǎn)量及群體感應(yīng)抑制活性的影響

2.3 HY026最佳氮源的選擇

選擇硝酸鉀、黃豆粉、胰蛋白胨、酵母粉以及硫酸銨為氮源，分別以1‰ 和5‰ 的濃度替代高氏一號培養(yǎng)基中的氮源，在其他條件不變的情況下對HY026進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定各處理的代謝物產(chǎn)量和群體感應(yīng)抑制活性。結(jié)果（圖3）顯示，以5‰ 黃豆粉和5‰ 胰蛋白胨為氮源時(shí)，該菌代謝物產(chǎn)量明顯高于其他處理，在6.5 mg以上；以5‰ 黃豆粉和5‰（NH4）2SO4為氮源時(shí)，該菌株的群體感應(yīng)抑制活性相對較高，其對紫色桿菌產(chǎn)紫色素的抑制圈直徑分別為15.50 mm和14.85 mm。綜合菌株發(fā)酵液代謝物產(chǎn)量以及群體感應(yīng)抑制活性，確定5‰ 黃豆粉為HY026的最佳氮源。

圖3 不同氮源對海洋短小鏈霉菌粗提物的影響

2.4 HY026最佳培養(yǎng)基配方的研究

對選擇出的最佳碳源和氮源以及培養(yǎng)基中含量較高的海鹽和磷酸氫二鉀這4個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)研究，將HY026按各處理?xiàng)l件進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)、代謝物提取和群體感應(yīng)抑制活性測試，根據(jù)各處理的代謝物質(zhì)量、群體感應(yīng)抑制活性的數(shù)據(jù)分析HY026的最佳培養(yǎng)基配方。

以不同培養(yǎng)基發(fā)酵所得的各代謝物對紫色桿菌產(chǎn)紫色素的抑制圈直徑為指標(biāo)，通過極差分析計(jì)算并比較各因素的K值和R值，結(jié)果（表2）表明，四因素玉米粉、黃豆粉、鹽度、磷酸氫二鉀對菌株的群體感應(yīng)抑制活性的影響作用大小及各因素最優(yōu)化水平依次為：磷酸氫二鉀（4）＞鹽度（3）＞玉米粉（2）＞黃豆粉（2）。通過方差分析計(jì)算各因素的F值，與查表所得的F0.05、F0.01值進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中磷酸氫二鉀、鹽度、玉米粉和黃豆粉對菌株的群體感應(yīng)抑制活性的影響均為極顯著（表3），F(xiàn)值的大小順序也與極差分析的結(jié)果一致。因此，僅從活性考慮，菌株HY026的最佳培養(yǎng)基配方（g/L）為磷酸氫二鉀1.0，鹽度34.0，玉米粉20.0，黃豆粉5.0。

由于在活性物質(zhì)分離時(shí)，代謝物的產(chǎn)量也很重要，抗群體感應(yīng)活性和代謝物產(chǎn)量也需同時(shí)進(jìn)行考量，因此，將各處理所得的粗提物質(zhì)量與抑制圈直徑相乘，再以所得的值為指標(biāo)進(jìn)行極差分析，計(jì)算各因素的K'值和R'值。結(jié)果（表4）顯示，四因素對菌株的影響作用大小及各因素的最優(yōu)化水平依次為：磷酸氫二鉀（4）＞黃豆粉（2）＞玉米粉（1）＞鹽度（3）。與僅考慮活性相比，影響因素的排序發(fā)生了變化，黃豆粉的影響變大而鹽度的影響變小，玉米粉的最優(yōu)化水平也有所變動(dòng)。通過方差分析計(jì)算各因素F值并與查表結(jié)果相比，發(fā)現(xiàn)磷酸氫二鉀、黃豆粉、玉米粉的影響仍為極顯著，鹽度的影響為不顯著，與極差分析的結(jié)果一致。因此，同時(shí)考慮活性和代謝物產(chǎn)量，菌株HY026的最佳培養(yǎng)基配方為磷酸氫二鉀1.0 g/L，黃豆粉5.0 g/L，玉米粉10.0 g/L，鹽度34.0 g/L。

2.5 培養(yǎng)基優(yōu)化前后的代謝物產(chǎn)量和群體感應(yīng)抑制活性的比較

將正交實(shí)驗(yàn)所得的兩種優(yōu)化條件（優(yōu)化1僅考慮活性，優(yōu)化2同時(shí)考慮活性和代謝物產(chǎn)量）對菌株HY026進(jìn)行培養(yǎng)，并以原高氏一號培養(yǎng)基為對照，比較3種條件下所得的粗提物的質(zhì)量與抑制圈直徑。

結(jié)果（圖4）顯示，優(yōu)化1所得粗提物的質(zhì)量及抑制圈直徑分別為24.24 mg和17.33 mm，優(yōu)化2所得粗提物的質(zhì)量及抑制圈直徑分別為25.62 mg和16.90 mm，而優(yōu)化前的高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)HY026所得粗提物質(zhì)量、抑制圈直徑分別為5.14 mg和14.20 mm。與優(yōu)化前相比，優(yōu)化1所得的粗提物質(zhì)量和群體感應(yīng)抑制活性分別提高了372%和22%；優(yōu)化2所得的粗提物質(zhì)量和群體感應(yīng)抑制活性分別提高了398%和19%。

3 討論

通過對萃取廢液、菌體浸液及粗提物的群體感應(yīng)抑制活性研究，發(fā)現(xiàn)萃取廢液及菌體浸液均無群體感應(yīng)抑制活性，僅粗提物具有較大的抑制圈直徑，表明活性代謝產(chǎn)物為胞外產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)中所采用的代謝物萃取方法可以很好地將活性物質(zhì)從發(fā)酵液中萃取出來。在濾紙片實(shí)驗(yàn)的操作過程中，將粗提物的溶液移加至濾紙片上時(shí)，若滴加速度過快，會有部分粗提物透過濾紙片或從濾紙片的邊緣溢出，所測試出的抑制圈會比實(shí)際要小，因此，HY026的粗提物群體感應(yīng)抑制活性應(yīng)稍大于測試值。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析

表3 正交試驗(yàn)的方差分析表（僅考慮活性）

通過單因子試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可溶性淀粉和玉米粉是HY026的良好碳源，黃豆粉和胰蛋白胨是HY026的優(yōu)良氮源。氮源是構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的主要材料［14］，而有機(jī)氮源對菌株的生長及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生具有重要的作用。碳源作為微生物生長中的必須營養(yǎng)物質(zhì)［15］，則更多地影響該菌株的群體感應(yīng)活性（即活性物質(zhì)在總代謝物中的占比）。夏覓真等［16］在對一株土壤放線菌FX05的發(fā)酵條件優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)以1% 玉米粉為碳源時(shí)，F(xiàn)X05的代謝產(chǎn)物抑制綠膿桿菌的活性最高。周慧茹［17］在對抗腫瘤活性菌的培養(yǎng)優(yōu)化及活性物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，高濃度的玉米粉不僅能使菌體生長旺盛，而且對菌株的代謝活動(dòng)更有利。肖懷東等［18］在對海洋放線菌JMC06001發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的研究中發(fā)現(xiàn)將蛋白胨和大豆粉組合時(shí)獲得的粗提物對藤黃八疊球菌（Sarcina lutea）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）有較強(qiáng)的抑制效果。

表4 正交試驗(yàn)的方差分析表（既考慮活性又考慮代謝物產(chǎn)量）

圖4 優(yōu)化前后粗提物質(zhì)量及抑制圈直徑比較

通過正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，就菌株的抗群體感應(yīng)活性而言，磷酸氫二鉀和鹽度影響較大，趙媛等［19］在對葉紅景天內(nèi)生菌抗病菌株篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，磷酸氫二鉀對抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生有較高的促進(jìn)作用。許潔［20］在抗群體感應(yīng)海洋放線菌的分離篩選與活性物質(zhì)研究中發(fā)現(xiàn)，鹽度的改變對菌株的活性有較大的影響。綜合代謝物產(chǎn)量和活性兩者因素發(fā)現(xiàn)，碳氮比降低，活性物質(zhì)的產(chǎn)量略有上升，但活性卻略微下降。就兩種優(yōu)化條件下發(fā)酵所得的提取物的產(chǎn)量和群體感應(yīng)抑制活性來看，兩者的優(yōu)化效率沒有明顯差異，都是培養(yǎng)菌株HY026的良好的發(fā)酵培養(yǎng)基。但優(yōu)化1中用到的玉米粉的含量高于優(yōu)化2，考慮到經(jīng)濟(jì)成本，優(yōu)化2中的培養(yǎng)基配方為菌株S. parvulusHY026的最佳優(yōu)化條件。

4 結(jié)論

本文對分離自連云港海域的一株海洋微小鏈霉菌HY026進(jìn)行了群體感應(yīng)抑制活性的測試和培養(yǎng)條件的優(yōu)化，通過濾紙片法確定S. parvulusHY026具有較高的群體感應(yīng)抑制活性，在單因子實(shí)驗(yàn)中，確定玉米粉為最佳碳源、黃豆粉為最佳氮源，通過正交實(shí)驗(yàn)，確定最佳的培養(yǎng)基配方為：磷酸氫二鉀1.0 g/L，鹽度34.0 g/L，玉米粉10.0 g/L，黃豆粉5.0 g/L。本研究為進(jìn)一步大批量發(fā)酵獲取S. parvulusHY026的粗提物和活性物質(zhì)的分離純化提供基礎(chǔ)。