梁東雨 王禹佳 蘇敖純 徐洪偉 周曉馥

（吉林師范大學(xué) 吉林省植物資源科學(xué)與綠色生產(chǎn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四平136000）

牛皮杜鵑（Rhododendron chrysanthumPall.）也稱為牛皮茶，屬于杜鵑花科，主要生長在中國長白山海拔1 000-2 506 m的岳樺林下和高山苔原帶［1］，是長白山珍貴的優(yōu)勢種群之一［2］。長白山氣候惡劣，太陽輻射值高，短波長光強(qiáng)烈，生長在高山環(huán)境中的牛皮杜鵑長期適應(yīng)并進(jìn)化，形成了獨(dú)特的生理生化適應(yīng)機(jī)制以抵御高寒、干旱和強(qiáng)輻射等逆境傷害［3］。運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)對牛皮杜鵑的抗寒機(jī)理研究發(fā)現(xiàn)，在光合作用能量傳遞和蛋白質(zhì)合成上表現(xiàn)出顯著差異［4］。

近年來，由于氟氯烴等化合物排放的增加導(dǎo)致大氣臭氧減少，到達(dá)地表的UV-B輻射增強(qiáng)［4］。UV-B輻射是長白山的主要環(huán)境脅迫因子，不僅可以調(diào)節(jié)植物的生理過程，也會作為脅迫信號導(dǎo)致植物細(xì)胞的損傷和過氧反應(yīng)［5］。因此，尋找一種能夠緩解UV-B脅迫對植物傷害的方法非常重要。

祁虹等［6］發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)UV-B輻射后，植物葉片葉綠體膜系統(tǒng)會受到活性氧自由基的損傷，PSII活性受抑制，同化物的合成減少，抑制CO2的固定，最終導(dǎo)致光合作用減弱。袁孟玲等［7］發(fā)現(xiàn)，芒果成年樹可通過提高SOD、POD、CAT活性以及總黃酮和多酚等物質(zhì)的積累來抵御UV-B輻射造成的氧化損傷。劉曉等［8］認(rèn)為，外源茉莉酸通過提高抗氧化酶活性，花青素含量等緩解膜損傷，以及增大植物光合天線系統(tǒng)體積緩解UV-B輻射對光合器官的傷害。目前，以茉莉酸（JA）為代表的茉莉酸類物質(zhì)（JAs）被認(rèn)為是植物面臨生物與非生物脅迫中產(chǎn)生防御反應(yīng)的重要信號分子［9］。Wasternack［10］研究發(fā)現(xiàn)茉莉酸類物質(zhì)能誘導(dǎo)蘆丁、花青素等黃酮類物質(zhì)的表達(dá)，來抵抗植物UV-B脅迫。Conconi 等［11］指出，植物對UV-B輻射的防御需要JAs信號途徑的參與。但關(guān)于外源茉莉酸能夠緩解UV-B輻射對植物傷害的研究仍然屈指可數(shù)。本試驗(yàn)為進(jìn)一步研究長白山牛皮杜鵑抗紫外線脅迫的特性提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

牛皮杜鵑收集于中國北方長白山附近（40.10 N，100.10 E）。運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室后，將植物保存在模擬高山環(huán)境的智能人工氣候室中培養(yǎng)［14/10 h光周期；18/16℃（白天/夜晚）；光子通量密度50 μmol/（m2·s）］。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 選擇具有相同生長狀態(tài)的牛皮杜鵑組培苗作為研究材料，以預(yù)施加茉莉酸（50μmol/L）的1/4MS培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)牛皮杜鵑4 d作為實(shí)驗(yàn)組，以1/4MS培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛皮杜鵑作為對照組。將實(shí)驗(yàn)組和對照組分別在PAR和UV-B下輻射48 h。采用混合采樣策略消除個體之間的差異，本研究中進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。PAR照射處理是將400 nm的濾光片（Edmund；Filter Long 2IN SQ，USA）置于培養(yǎng)瓶上。UV-B輻射處理是將295 nm的濾光片（Edmund；Filter Long 2IN SQ，USA）置于培養(yǎng)瓶上。其中PAR光源由暖白色T5x14W熒光燈（Philips，荷蘭）提供。人工UV-B輻射的來源是Ultraviolet-B TL 20W / 01RS熒光管（Philips，荷蘭）提供。樣品有效接收的輻照度為UV-B：2.3 W·/m2，PAR ：μmol 光子 /（m2·s）。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鉁y定及相關(guān)參數(shù)計(jì)算 利用IMAGING-PAM葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)（Heinz Walz，德國）對其進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測定，在相同葉齡的葉片上選取3個觀測點(diǎn)，暗適應(yīng)20 min后對初始熒光（Fo），最大熒光（Fm）和（Fm'）以及最小熒光（Fo'）進(jìn)行測定并對以下參數(shù)進(jìn)行計(jì)算，同時對qP、NPQ和ETR快速光響應(yīng)曲線進(jìn)行測定。

光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的最大量子產(chǎn)量［Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm］、

光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的有效量子產(chǎn)量［Fv'/ Fm'=（Fm'- Fo'）/ Fm'］、

光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的潛在活性［Fv/Fo=（Fm-Fo）/Fo］、

光化學(xué)淬滅系數(shù)［qP=（Fm'-Fs）/（Fm'-Fo'）］、

非光化學(xué)淬滅系數(shù)［NPQ=（Fm-Fm'）/Fm'］。

1.2.3 抗氧化酶、NADPH氧化酶和丙二醛的測定 將0.3 g新鮮葉片在液氮中研磨并用100 mmol/L磷酸鉀緩沖液（pH 7.0-7.4）提取。根據(jù)Bradford［12］方法用牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)測定蛋白質(zhì)濃度。使用相應(yīng)的試劑盒（南京建成生物工程研究所，南京，中國）測量CAT，T-SOD和NADPH氧化酶和MDA的活性。

1.2.4 花青素的測定 花青素用分光光度法測定。將10 mg新鮮葉片在3.6 mL甲醇∶HCl（99∶1）中組成細(xì)胞勻漿，室溫下黑暗中提取72 h，在546 nm處讀取提取物的吸光度以測定花色素苷，以葉鮮重為基礎(chǔ)表示吸光度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 16.0（NY，USA）進(jìn)行單因子方差分析，在結(jié)果中，使用小寫字母來標(biāo)識顯著差異。使用Sigmaplot 12.5繪制圖表，（Systa software inc芝加哥，伊利諾伊州，美國）。

2 結(jié)果

2.1 外源茉莉酸對UV-B輻射下牛皮杜鵑葉綠素?zé)晒馓卣鞯挠绊?/h3>

2.1.1 葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)的變化 圖1為不同處理下牛皮杜鵑葉片PSII模式中的Fo圖像與Fm圖像。表1中，F(xiàn)o為初始熒光，不同處理后變化相對穩(wěn)定。Fm為最大熒光，F(xiàn)v/Fm為PSII最大光化學(xué)效率，F(xiàn)v'/Fm'為PSII有效光化學(xué)效率，F(xiàn)v/Fo為PSII潛在活性，與PAR組相比UV-B輻射后分別降低20.08%、9.8%、14.26%、18.78%。表明UV-B輻射可使最大熒光和光化學(xué)效率降低，從而使?jié)撛诨钚允軗p傷，最終導(dǎo)致光化學(xué)電子進(jìn)入碳還原過程受抑制。

qP為光化學(xué)淬滅系數(shù)，反映PSII天線色素吸收光能后可用于光化學(xué)電子傳遞的部分，在UV-B輻射后qP顯著降低，說明PSII光化學(xué)電子傳遞活性降低，與Fv/Fm、Fv'/Fm'和Fv/Fo的下降相吻合。

NPQ表示PSⅡ天線色素吸收光能后不能用于光化學(xué)電子傳遞，而以熱能形式耗散掉未利用光能的部分，在UV-B輻射后呈上升趨勢，說明UV-B 輻射引起了過多的光抑制，NPQ上升有效減輕PSⅡ吸收UV-B而引起的光氧化。JA+UV-B處理后的Fm、Fv/Fm、Fv'/Fm'、Fv/Fo和qP數(shù)值與UV-B輻射相比顯著上升并與PAR組持平，NPQ數(shù)值顯著下降，表明外源茉莉酸預(yù)處理可提高植物光系統(tǒng)Ⅱ的光合電子傳遞。

圖1 不同處理下牛皮杜鵑PSII模式中的Fo圖像與Fm圖像

表1 不同處理對牛皮杜鵑葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)特征的影響

2.1.2 葉綠素?zé)晒饪焖俟忭憫?yīng)曲線的變化 隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，JA預(yù)處理的qP快速光響應(yīng)曲線呈現(xiàn)出最佳狀態(tài)，在光強(qiáng)不斷增加的過程中，qP下降的幅度最?。▓D2-A）。不同處理的qP快速光響應(yīng)曲線隨光照強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)出不同的變化趨勢（圖2-B），qP快速光響應(yīng)曲線在UV-B輻射處理后下降幅度最大，JA+UV-B處理后下降幅度緩慢，與qP動力學(xué)數(shù)值的下降表現(xiàn)一致。表明外施茉莉酸使植物光能利用率增強(qiáng)。

隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，JA預(yù)處理的NPQ快速光響應(yīng)曲線與對照組相比上升幅度大，隨著光強(qiáng)的增加曲線達(dá)到平穩(wěn)時數(shù)值較大（圖3-A）。不同處理的NPQ快速光響應(yīng)曲線隨光照強(qiáng)度的增加呈現(xiàn)出不同的變化趨勢（圖3-B），上升幅度大小順序?yàn)镴A+UV-B＞JA+PAR＞UV-B＞PAR，說明茉莉酸預(yù)處理后使其NPQ快速光響應(yīng)曲線上升，可有效減輕由于植株P(guān)SⅡ吸收過量的光能而引起的光能抑制，是提高植物的抗逆反應(yīng)現(xiàn)象，使其具有更有效的光保護(hù)能力。

圖4中rETR為相對電子轉(zhuǎn)移率，曲線高低與光合速率呈正相關(guān)，如圖（圖4-A）所示隨著光照強(qiáng)度的增強(qiáng)，JA預(yù)處理后rETR快速光響應(yīng)曲線上升幅度增大，曲線趨于平穩(wěn)時rETR數(shù)值最高。UV-B輻射后rETR快速光響應(yīng)曲線斜率最小，趨于平穩(wěn)時rETR數(shù)值最低，JA+UV-B處理后使rETR快速光響應(yīng)曲線顯著上升（圖4-B），與PSII的光化學(xué)效率和潛在活性結(jié)果一致，最終說明UV-B輻射導(dǎo)致光合作用原初反應(yīng)過程受抑制，而茉莉酸具有顯著的緩解作用。

圖2 不同處理對牛皮杜鵑光化學(xué)淬滅系數(shù)的影響

圖3 不同處理對牛皮杜鵑非光化學(xué)淬滅系數(shù)的影響

圖4 不同處理對牛皮杜鵑相對電子轉(zhuǎn)移率的影響

2.2 外源茉莉酸對UV-B輻射下牛皮杜鵑抗氧化酶活性的影響

對處理后新鮮葉片的CAT和SOD酶活性進(jìn)行測量。CAT和SOD兩種抗氧化酶是植物體內(nèi)活性氧的清除劑。CAT可以將H2O2轉(zhuǎn)化為H2O，并與SOD協(xié)同反應(yīng)，使活性氧維持在最低水平，由圖（5-A）所示，JA預(yù)處理可顯著提高SOD活性。UV-B輻射可顯著降低CAT活性（圖5-B），與PAR處理相比降低75.31%。JA+PAR處理使CAT活性顯著升高，是PAR處理的1.82倍。JA+UV-B處理使CAT活性維持對照水平。說明UV-B輻射導(dǎo)致其細(xì)胞內(nèi)自由基數(shù)量增加，活性氧含量升高，外施茉莉酸預(yù)處理可緩解UV-B的脅迫效應(yīng)。

圖5 不同處理對牛皮杜鵑抗氧化劑活性的影響

2.3 外源茉莉酸對UV-B輻射下牛皮杜鵑脂質(zhì)過氧化和NADPH氧化酶活性的影響

對牛皮杜鵑葉片進(jìn)行脂質(zhì)過氧化和NADPH氧化酶活性測定，與PAR組相比，UV-B輻射使MDA含量維持在對照水平（圖6-A），NADPH氧化酶活性顯著上升了48.53%（圖6-B），JA+PAR處理后MDA含量和NADPH氧化酶活性顯著上升，JA+UV-B處理后MDA含量下降到對照水平，由于長白山牛皮杜鵑葉片具有較厚的角質(zhì)層和較發(fā)達(dá)的柵欄組織，可減緩葉片受到強(qiáng)輻射的損傷，而單獨(dú)使用JA預(yù)處理可能導(dǎo)致牛皮杜鵑葉片膜脂過氧化，JA和UV-B共同處理能有效減緩葉片損傷程度的作用。

圖6 不同處理對牛皮杜鵑脂質(zhì)過氧化和NADPH氧化酶活性的影響

2.4 外源茉莉酸對UV-B輻射下牛皮杜鵑花青素含量的影響

對牛皮杜鵑進(jìn)行花青素含量測定，與PAR組相比，UV-B輻射使花青素含量顯著降低33.13%。與UV-B輻射相比，JA+UV-B處理的花青素含量顯著上升38.78%，并與PAR處理持平（圖7）?？赡苁峭蝗贿M(jìn)行UV-B輻射使其葉片的花青素含量驟減，外施JA預(yù)處理后植株葉片合成了大量花青素等紫外防御物質(zhì)，可吸收部分紫外線，使進(jìn)入葉肉細(xì)胞的UV-B輻射量減少，有效地抑制UV-B輻射對葉綠體的破壞。

圖7 不同處理對牛皮杜鵑花青素含量的影響

3 討論

UV-B輻射通常對植物的生理生化過程產(chǎn)生一定影響。研究人員對植物體內(nèi)的光合元件進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)UV-B輻射對光合系統(tǒng)的影響主要包括葉綠體類囊體膜結(jié)構(gòu)受損傷、PSⅡ的活性喪失［13］、加速光系統(tǒng)Ⅱ核心蛋白D1和D2的降解、Rubisco酶活力下降［14］等方面。本實(shí)驗(yàn)中，牛皮杜鵑葉片葉綠素?zé)晒馐艿経V-B輻射的影響，葉綠素?zé)晒馐菣z測光合作用的有效探針，與電子傳遞，ATP合成以及CO2的固定有關(guān)，直接反映出光合作用過程中動態(tài)變化［15］。在UV-B輻射期間，光系統(tǒng)Ⅱ的Fm、Fv/Fo、光化學(xué)效率和光化學(xué)淬滅顯著降低，qP和rETR快速光響應(yīng)曲線下降幅度增大。與鄭翔等［16］研究結(jié)果一致，其原因可能是UV-B輻射使與PSII緊密結(jié)合的質(zhì)體鯤QA過度還原［17］，從而阻礙光合電子傳遞速率，抑制光合原初反應(yīng)。NPQ在UV-B輻射后顯著上升，表明脅迫后光合色素吸收的光能不能全部用于光合電子傳遞，大部分以熱能的形式耗散掉，從而保護(hù)植物PSII反應(yīng)中心。UV-B脅迫作為外界的誘導(dǎo)因子可激發(fā)茉莉酸的合成途徑，同時外源茉莉酸會誘導(dǎo)JlPs（茉莉酸誘導(dǎo)蛋白組）的表達(dá)［18］。本試驗(yàn)結(jié)果表明，JA+UV-B處理后Fm、Fv/Fm、Fv'/Fm'、Fv/Fo和qP數(shù)值與UV-B輻射相比顯著上升并與PAR組持平，并且qP、NPQ和rETR快速光響應(yīng)曲線呈現(xiàn)出最佳狀態(tài)，說明外源施加茉莉酸可緩解外界因素對牛皮杜鵑的傷害，同時提高牛皮杜鵑的抗逆性，使其更能適應(yīng)苛刻的環(huán)境。

植物正常生長情況下，體內(nèi)的活性氧（ROS）產(chǎn)生和消除會維持動態(tài)平衡，而UV-B輻射等逆境脅迫可能打破了這種平衡，使其產(chǎn)生大量自由基和H2O2，活性氧疊加累積會直接或間接地對脂類和不飽和脂肪酸進(jìn)行攻擊，MDA來自不飽和脂肪酸的降解［19］，可結(jié)合糖蛋白引起膜蛋白變性，細(xì)胞膜的選擇透過性和流動性受影響，MDA含量反映了植物受到脅迫后損傷的程度［20］。SOD是保護(hù)植物免受ROS損害的第一線酶，將O2轉(zhuǎn)化為H2O2，NADPH氧化酶途徑也產(chǎn)生H2O2，可引起氧化猝滅，CAT將H2O2轉(zhuǎn)化為水和氧，從而去除有毒的自由基。本試驗(yàn)中UV-B輻射使SOD酶活性顯著提高，CAT活性顯著降低，NADPH氧化酶活性顯著升高，致使H2O2含量增加。說明UV-B輻射使細(xì)胞內(nèi)清除活性氧能力下降，活性氧大量積累，最終導(dǎo)致?lián)p傷出現(xiàn)。JA+UV-B處理后誘導(dǎo)CAT活性上升到對照水平并且MDA含量降低到對照水平。這與遲虹等［21］的結(jié)果一致，茉莉酸可激發(fā)植物的抗氧化系統(tǒng)的活性，進(jìn)而控制體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的含量，緩解膜脂過氧化的程度，減緩細(xì)胞受活性氧的傷害。

植物體內(nèi)的抗氧化物質(zhì)包括抗氧化酶主要有丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）及紫外吸收復(fù)合物等。黃酮類化合物（包括花青素）是植物抵御UV-B輻射的關(guān)鍵物質(zhì)，可有效吸收或過濾進(jìn)入葉片的紫外光子，黃酮類化合物的積累是植物對UV-B輻射的一種適應(yīng)和保護(hù)措施［22］。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)JA+UV-B處理顯著增加花青素含量，表明在UV-B輻射下進(jìn)行外源茉莉酸處理可促進(jìn)牛皮杜鵑體內(nèi)花青素的合成，部分吸收紫外強(qiáng)光，減緩UV-B輻射對植物的傷害。正如王茹丹等［23］研究，認(rèn)為增加植物體內(nèi)花青素含量可抵御UV-B輻射對葉片造成的傷害。

4 結(jié)論

綜上所述，UV-B輻射和外源茉莉酸預(yù)處理對各個生理指標(biāo)具有顯著作用，外源茉莉酸部分抵消了UV-B輻射的負(fù)面影響，尤其是通過增強(qiáng)植物光合作用，提高抗氧化酶活性和花青素等物質(zhì)的積累，進(jìn)而提高植株的防御能力。