董汝 曹揚榮

（華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，生命科學技術學院，武漢 430070）

氮是植物生長發(fā)育所必需的主要營養(yǎng)元素之一，然而自然界中大量的氮氣必須被還原為硝態(tài)氮或者氨態(tài)氮后才能被植物吸收利用。在自然界氮素還原中，生物固氮占據(jù)主導地位，它是指分子態(tài)氮氣在生物體內(nèi)被還原成氨的過程。目前發(fā)現(xiàn)只有原核生物能夠進行生物固氮［1］。在生物固氮中，根瘤菌與豆科植物形成的共生固氮是目前已知效率最高且被研究最為廣泛的一種。然而，根瘤菌的宿主范圍主要限于豆科植物，這是限制其被廣泛應用于非豆科植物（如禾本科作物）的瓶頸［2］。因此，擴大根瘤菌宿主范圍乃至實現(xiàn)非固氮植物的結瘤及固氮是目前農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展和養(yǎng)分高效利用的關鍵途徑之一。

在根瘤菌-豆科植物共生固氮中，豆科植物形成的根瘤是根瘤菌進行生物固氮的場所。根瘤菌與豆科植物共生固氮包括兩個相對獨立且密不可分的途徑，即根瘤菌入侵和根瘤發(fā)育［3-4］。植物根部釋放出的類黃酮化合物被匹配的根瘤菌感知，并激活nodD基因表達，誘導合成并釋放結瘤因子［5］。這些結瘤因子進而被植物結瘤因子受體蛋白復合物識別，如百脈根中的NFR1/NFR5（Nod factor receptor 1 /Nod factor receptor 5）與共生受體激酶SymRK（Symbiosis Receptor Kinase）形成的復合物，激活下游共生信號通路［6］。近年來，與共生受體激酶有關的分子調控機制得到廣泛研究，如Nick4（NFR5-interacting cytoplasmic kinase 4）能夠和NFR5相互作用，連接了結瘤因子信號識別和根瘤器官發(fā)生的信號通路［7］。小 G 蛋白 ROP6（Rho-like GTPase 6）能夠與NFR5互作調控侵染線的生長和根瘤發(fā)生［8］。百脈根中的類二氫黃酮醇蛋白DFL1（Dihydroflavonol-4-reductase-like protein 1）能夠與NFR5互作，揭示信號通路可能通過負反饋方式直接調控類黃酮的合成［9］。共生信號的激活最終可以引起細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流［10］。DMI1（Does not Make Infections 1）作為核膜上的離子通道，能夠通過控制離子出入調節(jié)共生信號［11］。細胞核內(nèi)的鈣離子振蕩被CCaMK（Calciumand Calmodulin-dependent protein Kinase）蛋白激酶解碼，CCaMK通過磷酸化CYCLOPS，CYCLOPS作為能夠結合DNA的轉錄激活子，能夠與DELLA蛋白、NSP1（Nodulation signaling pathway 1） 蛋 白、NSP2（Nodulation signaling pathway 2）蛋白等形成轉錄復合物共同激活共生相關基因的表達［12-14］。根瘤菌對豆科植物類黃酮類化合物的響應具有特異性，并且豆科植物相應根瘤菌結瘤因子也具有一定特異性。因此，豆科植物分泌的類黃酮類化合物以及根瘤菌結瘤因子的結構差異是調控根瘤菌宿主范圍的一個關鍵。根瘤菌侵染宿主植物后，根瘤菌沿侵染線到達并定殖于根部皮層細胞，誘導根瘤原基發(fā)育。根據(jù)形態(tài)結構，根瘤大致分為定型根瘤和不定型根瘤。定型根瘤的根瘤原基起始于外皮層細胞，而不定型根瘤的根瘤原基起始于內(nèi)皮層細胞［15］。在根瘤共生細胞中，根瘤菌分化形成能夠固氮的類菌體［16］，從而將空氣中氮氣還原為氨供植物吸收利用。

從進化上推測，根瘤菌-豆科植物互作起源于病原菌-植物的病原反應（Pathogenesis），作為一種外來微生物，根瘤菌入侵仍然會激發(fā)植物一定的免疫反應。如在共生互作早期，植物一些免疫應答基因表達量上調，這些防御反應在隨后的共生互作中被逐漸降低或者抑制。而作為宿主，植物也進化出相應機制來抑制自身免疫反應進而實現(xiàn)與根瘤菌互惠共生。如苜蓿NAD1（Nodules with Activated Defence）、DNF2（Defective in Nitrogen Fixation 2）等蛋白的缺失特異激發(fā)了根瘤中免疫反應，進而導致根瘤菌定殖和類菌體發(fā)育中的終止［17-19］。根瘤菌和病原細菌與植物的互作方式是相似的，即不論是共生體（如根瘤菌）還是病原體（如病原假單胞桿菌）抑制植物免疫反應的策略也有可能大致類似。那么植物是如何識別和區(qū)分根瘤菌與病原菌，又是如何調控自身免疫反應來“邀請”根瘤菌而不是病原菌的入侵和定殖？總之，宿主防御反應與共生反應的平衡對于根瘤菌入侵和根瘤發(fā)生是至關重要的。我們將從根瘤菌MAMP、根瘤菌三型效應蛋白以及根瘤菌定殖等3個方面論述根瘤發(fā)生過程中宿主和根瘤菌對植物免疫反應的調控。

1 根瘤菌MAMP在共生互作中作用

植物可以通過模式識別受體（Pattern Recognition Receptor，PRR）感知微生物相關分子模式（Microbe-Associated Molecular Patterns，MAMP）并激發(fā)免疫反應，被稱為PTI反應（Pattern-triggered immunity，模式觸發(fā)的免疫反應）［20］。該免疫反應在抵御病原菌入侵和調控植物周圍環(huán)境中微生物種類和組合起重要作用。而微生物MAMP和植物PRR的多樣化組合正是調控與不同微生物互作的一個關鍵因素［21］。根瘤菌是一種典型的革蘭氏陰性菌。革蘭氏陰性菌細胞壁分為外壁層和內(nèi)壁層。外壁層最外層是脂多糖，內(nèi)壁層含有一層結構疏松的肽聚糖。那么根瘤菌和病原菌表面具有的相同的分子模式是怎樣被植物識別的；在根瘤發(fā)生和共生建立的過程中，豆科植物產(chǎn)生的免疫反應又是如何被根瘤菌和植物調控的？

在擬南芥中，細菌鞭毛蛋白（flagellin或flg22，代表N端保守的22個氨基酸肽段）被LRR（Leucinerich repeat）受體激酶FLS2（Flagellin Sensing 2）識別［22］。另一個LRR受體激酶BAK1（BRI1-associated receptor kinase）作為細菌鞭毛蛋白的共受體介導了免疫反應的激活［23］。flgII-28，細菌鞭毛蛋白上另一個激發(fā)免疫反應的肽段，能夠被茄科植物的FLS3（Flagellin-Sensing 3）識別并激發(fā)免疫反應［24］。同樣，根瘤菌，如百脈根中慢生型根瘤菌（Mesorhizobium loti），接種植物后也激發(fā)百脈根免疫反應，這暗示根瘤菌也可能有激發(fā)免疫反應的MAMP。被病原菌flg22處理后的百脈根與根瘤菌共生識別大大降低，最終導致根瘤數(shù)目減少和根瘤固氮酶活降低，然而在百脈根根瘤發(fā)生后，flg22處理并沒有抑制根瘤數(shù)目和固氮酶活，這表明植物PTI反應特異抑制根瘤菌入侵。然而從M. loti純化的鞭毛蛋白并不能誘導百脈根的免疫反應。通過對比flg22序列發(fā)現(xiàn)，根瘤菌的鞭毛蛋白氨基酸序列發(fā)生變異，這些突變可能是植物識別和激發(fā)植物免疫反應的關鍵［25］。因此，這可以從進化上解釋根瘤菌可以通過鞭毛蛋白序列的突變逃避植物FLS2介導免疫反應的抑制。

此外，根瘤菌還有很多多糖類的MAMP，如結瘤因子、脂多糖、胞外多糖和肽聚糖等。在擬南芥中受體激酶CERK1（Chitin elicitor receptor kinase 1）和受體蛋白LYM1/LYM3以及水稻中的兩個LysM-containing蛋白LYP4和LYP6共同介導細菌細胞壁肽聚糖PGN介導的免疫反應［26-27］。但是目前根瘤菌的細胞壁組成成分肽聚糖有何作用仍未知。

十字花科植物中的Lectin S-domain受體激酶LORE介導了病原菌脂多糖引起的免疫反應［28］。而水稻中的OsCERK1蛋白也與脂多糖介導的免疫反應有關［29］。那么根瘤菌的脂多糖在共生中具有什么功能？據(jù)報道苜蓿根瘤菌脂多糖突變體Rm6963與苜蓿結瘤時間延遲并且與野生型根瘤菌相比結瘤競爭能力降低［30］，這表明根瘤菌脂多糖在共生中起正調控作用。但是脂多糖在根瘤菌與豆科植物的分子對話中如何發(fā)揮正向功能，植物中的哪些蛋白參與了這個過程，這些問題仍然需要我們?nèi)ヌ剿鳌?/p>

真菌細胞壁組成成分幾丁質是一種被廣泛研究的MAMP。在擬南芥中，AtCERK1和AtLYK5形成的受體復合物共同介導幾丁質引起的免疫反應［31-32］。根瘤菌結瘤因子的化學結構式是脂殼修飾的短鏈幾丁質［33-34］。且結瘤因子受體，如百脈根LjNFR1/LjNFR5和苜蓿MtLYK3/MtNFP，與幾丁質受體具有較高同源性［35-39］。在本氏煙草中過表達LjNFR1/LjNFR5或者MtLYK3/MtNFP可以激發(fā)葉片細胞程序性死亡［40］，這暗示共生信號通路在進化上與幾丁質激發(fā)的免疫信號通路具有相關性。最近研究還發(fā)現(xiàn)，除了在共生反應中起關鍵作用，結瘤因子還可以誘導細菌鞭毛蛋白受體FLS2的降解，進而抑制MAMP激發(fā)的植物免疫反應，擬南芥AtLYK3在介導結瘤因子抑制植物免疫中起關鍵作用［41］。那么，豆科植物中AtLYK3的同源蛋白是否存在抑制植物免疫反應的功能還有待于研究。

除此之外，有證據(jù)表明根瘤菌產(chǎn)生的胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）也參與了根瘤共生。根瘤菌能夠產(chǎn)生胞外多糖，并分泌到胞外。這個特性顯示出它有可能和結瘤因子一樣，是第一批接觸到宿主的分子模式［42］。在百脈根中EPS的LysM受體EPR3能夠區(qū)分匹配和不匹配的根瘤菌的胞外多糖。EPS介導的EPR3識別通路促進了根皮層細胞內(nèi)的侵染以及根和根瘤菌的有效互作。使用根瘤菌胞外多糖突變體R7AexoB接種野生型百脈根和epr3突變體顯示EPR3可能存在共受體［43］。

在MAMP觸發(fā)的植物PTI反應中，對于MAMP的識別通常是由多個受體蛋白形成的復合物共同進行的。AtFLS2能夠和AtBAK1形成共受體復合物共同介導flg22引起的免疫反應；AtCERK1能夠和AtLYK5形成共受體復合物共同介導幾丁質引起的免疫反應；水稻中的OsCERK1能夠和OsCEBiP形成共受體復合物介導幾丁質引起的免疫反應；AtCERK1能夠和AtLYM1和AtLYM3形成共受體復合物介導PGN引起的免疫反應。而在結瘤因子介導的共生途徑中，NFR1能夠和NFR5形成復合物共同識別并介導下游的免疫反應［44-46］。因此，共生過程中根瘤菌其他分子模式的識別也有可能是通過共受體復合物介導的。

由于根瘤菌中的很多分子模式與病原菌分子模式結構非常相似，并且在已鑒定的與免疫相關的苜蓿突變體nad1中很多受體類蛋白表達上調，但是哪些分子模式被這些受體類蛋白識別激發(fā)免疫反應影響共生過程仍然未知［17-18］。在根瘤菌和植物互相識別的過程中，植物是如何區(qū)分匹配的根瘤菌以及不匹配的根瘤菌和病原菌，根瘤菌又是如何利用和調整自身的分子模式以幫助自己與植物的互作過程，這些還存在很多未知。在未來，我們或許可以通過各種技術綜合鑒定出這些在共生過程中發(fā)揮著重要作用的分子模式以及其相應的受體蛋白，為人們更好的利用這個識別模式奠定基礎。

2 根瘤菌釋放的效應蛋白觸發(fā)的免疫反應的調節(jié)

植物類受體激酶和類受體蛋白識別病原菌的MAMP后觸發(fā)免疫反應，試圖殺死病原菌。病原菌則釋放效應蛋白進入植物體內(nèi)，通常靶定植物PTI反應中的各個組分阻止免疫反應的產(chǎn)生，以便讓自己順利侵入。而植物也進化出識別效應蛋白的R（Resistance）蛋白。R蛋白能夠特異識別病原菌釋放的效應蛋白，從而激活免疫反應（Effctor-triggered Immunity，ETI）［47］。

Flor［48］提出 gene-for-gene 假說，即高度特異的R蛋白和效應蛋白一對一地直接結合。如水稻的Pita R蛋白能夠直接結合水稻稻瘟病菌Magnaporthe grisea的 AvrPita蛋白［49］。Guard model 則證明了 R蛋白也能夠被間接地激活。即R蛋白不檢測效應蛋白的直接行為，而是識別R蛋白復合物中宿主蛋白的異常［50］。如效應蛋白AvrRPM1誘導RIN4（RPM1-INTERACTING PROTEIN 4）的磷酸化，RIN4能夠與RPM1互作，RPM1感知到RIN4的變化后激起免疫反應［51］。有時R蛋白保護的宿主蛋白是植物為病原菌設置的“誘餌”，即植物進化出與效應蛋白靶標結構類似的蛋白。丁香假單胞桿菌的效應蛋白AvrPphB能夠靶標和分裂PBS1（AVRPPHB SUSCEPTIBLE 1），激活 R 蛋白 RPS5［52-53］。

在豆科植物與根瘤菌的互作中，宿主植物需要對根瘤數(shù)目和發(fā)育、根瘤菌定殖、根瘤菌固氮效率以及與根瘤菌之間的營養(yǎng)交換等進行精細的調控。而根瘤菌作為外來入侵的細菌，可以向植物細胞內(nèi)分泌效應蛋白來調控與植物的共生互作。在宿主應對病原微生物的反應中，病原菌通過III型分泌系統(tǒng)分泌的效應蛋白主要是抑制宿主的免疫反應。除少部分根瘤菌（如苜蓿根瘤菌）外，大部分根瘤菌基因組中都含有編碼III型分泌系統(tǒng)的各個基因［54］。然而，根瘤菌III型效應蛋白是否也參與調控共生互作中的免疫反應大都未知。目前被研究的幾個III型效應蛋白在共生中主要起正調控作用，然而也有實驗證明根瘤菌III型效應蛋白在共生互作中起負調控作用。如在植物病原菌Ralstonia中轉入根瘤菌的共生質粒，賦予它形成無效瘤的能力。在經(jīng)過幾輪的重復競爭性接種后，根瘤菌能夠通過自發(fā)地抑制三型分泌系統(tǒng)從而獲得形成更多共生根瘤的能力［55］。

那么目前被鑒定功能的效應蛋白主要也是來自根瘤菌III型分泌系統(tǒng)，但是大部分在共生中具有正調控作用，這可能與根瘤菌在漫長的進化過程中作出的改變有關。根瘤菌分泌的蛋白被命名為NOPs（Nodulation outer proteins）［56］。 根 瘤 菌 NGR234 中NopM是IpaH效應蛋白家族的成員。NopM是E3泛素連接酶，在煙草中能夠抑制MAMP觸發(fā)的ROS的產(chǎn)生。NopM也能抑制MAPK途徑。在NGR234與Lablab purpureus的共生中，NopM能夠增加根瘤的數(shù)量［57］。NopL作為一個具有多個磷酸化位點的根瘤菌特異的效應蛋白，能夠抑制百脈根中PR基因的表達。在NGR234與Flemingia congesta的共生中增加結瘤數(shù)量，在NGR234與菜豆的共生中延遲根瘤衰老［58-60］。NopP 是根瘤菌特異的效應蛋白，在NGR234與Tephrosia vogelii和Flemingia congesta的共生中增加結瘤數(shù)量［61］。NopT是C58半胱氨酸蛋白酶，在NGR234與灰毛豆共生中有正向調控的作用［62-63］。NopC是HH103的一個效應蛋白，在HH103與大豆的互作中有正向調控的作用［64］。

通過上述的描述，可以看出根瘤菌分泌的效應蛋白很多在根瘤菌與豆科植物的共生中起正向調控作用，但也有部分效應蛋白在根瘤菌與不同的豆科植物的互作中具有不同的作用［65］。根瘤菌的三型分泌系統(tǒng)能夠分泌出很多效應蛋白，但是負向調控共生的效應蛋白還有很多未被鑒定。由于病原菌的效應蛋白可以靶標到免疫反應過程中的各個組分，因此根瘤菌效應蛋白靶標的研究能夠為人們了解共生通路的免疫調控奠定基礎。

3 根瘤菌定殖過程中免疫反應的調節(jié)

根瘤主要有兩種形態(tài)，如大豆、百脈根等產(chǎn)生的定型根瘤和苜蓿等產(chǎn)生的不定型根瘤［15］（圖1）。二者其中一個區(qū)別在于根瘤原基起始的根部的皮層細胞不同。不定型根瘤的細胞分區(qū)發(fā)生于內(nèi)皮層細胞和中柱鞘，定型根瘤的細胞通常發(fā)生于中皮層或者外皮層細胞［66-67］。不定型根瘤的形態(tài)通常是圓柱狀或者分叉狀，并且根瘤細胞根據(jù)根瘤菌侵染狀態(tài)不同可大致分為4個區(qū)域：I區(qū)為根瘤頂端的分生組織；II區(qū)為從侵染線釋放根瘤菌侵染植物細胞的侵染區(qū)；II-III區(qū)為過渡區(qū)；III區(qū)為類菌體固氮的區(qū)域；IV區(qū)的類菌體正在衰老，為衰老區(qū)。相比較而言，定型根瘤沒有一個持續(xù)的分生組織，形態(tài)趨近于球形，沒有類似不定型根瘤的分區(qū)［68-69］。

定形根瘤與不定型根瘤除了根瘤形態(tài)不同（不定型根瘤具有根瘤分區(qū)）外，最大的區(qū)別是大部分不定型根瘤中的根瘤菌會經(jīng)歷末端分化：細胞膨大，基因組加倍，膜的修飾以及繁殖能力的喪失等［70］。目前認為是根瘤中一類特異表達的抗菌肽（NCRs，Nodule-specific cysteine rich peptides）所控制的［71］。苜蓿根瘤類菌體形態(tài)的苜蓿中華根瘤菌需要BacA降低植物NCR肽誘導的膜透化作用和NCR肽的殺菌能力，而體外NCR肽誘導根瘤菌使其具有類菌體特性則不依賴于BacA蛋白［72］。這表明豆科植物在和根瘤菌的博弈過程中使用了免疫這一武器而且雙方都對這一免疫反應進行了調節(jié)。

圖1 苜蓿產(chǎn)生的不定型根瘤（A）和百脈根產(chǎn)生的定型根瘤（B）

但是由于在根瘤中存在免疫反應抑制的機制，我們無法直接檢測到是否有類似PTI或者其他免疫反應在根瘤發(fā)育中有重要的功能。NAD1，SymCRK（Symbiotic Cysteine-rich Receptor Kinase），DNF2以及RSD（Regulator of symbiosome differentiation）等基因和突變體的鑒定為研究根瘤中的免疫反應的調節(jié)提供了材料［17-19，73-74］。Yu 等［75］利用nad1突變體揭示了在根瘤發(fā)育過程中NADPH氧化酶RbohBCD以及CDPK5（Calcium-Dependent Protein Kinase5）蛋白的重要功能。在nad1突變體中敲除RBOHB，C，D以及CDPK5后能夠使突變體根瘤回復成具有正常功能的根瘤。而在野生型中過表達CDPK5-VK會使根瘤產(chǎn)生壞死。由此可以看出，CDPK-Rboh復合物產(chǎn)生的活性氧能夠破壞根瘤發(fā)育過程中的免疫和共生平衡。在nad1或者symcrk突變體中受體類激酶蛋白上調，而CDPK和Rboh引發(fā)的活性氧爆發(fā)是PTI反應中一個典型的胞內(nèi)反應。因此這似乎給予我們PTI反應參與了根瘤發(fā)育過程的信號。當NAD1、DNF2、SymCRK和RSD等抑制根瘤發(fā)育不同階段免疫反應的任一個基因缺失后，根瘤便會表現(xiàn)出過度的免疫反應，導致根瘤菌定殖和類菌體發(fā)育受阻，根瘤壞死［76］。

4 總結與展望

病原菌與植物的“斗智斗勇”主要表現(xiàn)在兩個層次：MAMP觸發(fā)的MTI反應和效應蛋白觸發(fā)的ETI反應（圖2）。根瘤菌與豆科植物的互惠互利的共生模式與病原菌與植物的互作方式類似但也存在差異。在共生互作中，豆科植物供給根瘤菌碳源使其繁殖生長，而根瘤菌則提供給植物氮源。但豆科植物會在滿足自己氮源需求的基礎上盡量限制根瘤菌獲取的能源，而根瘤菌則盡可能獲取更多能源和避免氮氣還原中的能量消耗。因此二者之間會互相“抵制”又互相“包容”。但是根瘤菌與植物互作的研究由于根瘤自身的發(fā)育過程以及相對緊湊的根瘤結構而受到一定限制，因此我們可以以病原菌的研究為基礎探究植物根瘤內(nèi)的免疫反應調控。但是由于根瘤內(nèi)存在許多根瘤特異表達的基因，并且根瘤菌與植物的互作模式與病原菌仍存在很大差異，因此我們需要辯證性地參考植物病原菌的研究。

就MTI而言，根瘤菌作為革蘭氏陰性菌，其分子模式與病原菌有相同之處，但又有其自身的特點，因此植物如何識別和區(qū)分病原菌以及根瘤菌，并與后者建立互利共生的過程是目前國際上的研究熱點。植物如何調控哪些根毛被侵染，當根瘤菌進入根毛后，根瘤菌的繁殖速度是否受到抑制，這些過程是否與免疫反應相關還需進一步研究。

而當根瘤菌進入豆科植物根瘤后，植物與根瘤菌的“博弈”也與病原菌和植物的斗爭有一定的差異。模式植物苜蓿的根瘤為不定型根瘤，其根瘤具有嚴格的功能分區(qū)，而百脈根的根瘤為定型根瘤。目前鑒定的突變體nad1、symcrk等苜蓿突變體產(chǎn)生壞死的根瘤，而當這些基因在百脈根根瘤中缺失后，并未產(chǎn)生明顯表型［77］。這種現(xiàn)象可能與苜蓿根瘤中類菌體的末端分化有關。這可能也表明在苜蓿等產(chǎn)生不定型根瘤的植物中存在著對根瘤菌更嚴謹?shù)恼{控，而這種調控與植物的免疫反應相關。但是對于根瘤菌調控植物免疫反應的研究仍較少。因此不定型根瘤和定型根瘤對于根瘤菌免疫反應相關的調控具有差異，那么哪些基因參與了這個調控過程以及這個差異是否直接影響根瘤菌的固氮效率還有待探究。并且當結瘤起始后，能夠抑制免疫反應的根瘤菌中的蛋白又是如何被激活，在這些蛋白缺失之后植物是否識別根瘤菌為病原菌從而啟動免疫反應仍然未知。

圖2 根瘤發(fā)育過程中植物對自身先天免疫反應的調控

至于根瘤菌釋放的效應蛋白，多數(shù)似乎在共生過程中具有促進結瘤固氮的正向調控作用。令人疑惑的是，病原菌大部分依賴III型分泌系統(tǒng)釋放的效應蛋白誘導植物的免疫反應，而在根瘤菌中，III型分泌系統(tǒng)只在部分根瘤菌中存在，而苜蓿中華根瘤菌中沒有III型分泌系統(tǒng)，只有IV型分泌系統(tǒng)。那么通過IV型分泌系統(tǒng)釋放的效應蛋白在共生中的功能是怎樣的？并且這些效應蛋白在植物中的靶標以及工作方式如何仍是我們的盲區(qū)。因此，在根瘤發(fā)育過程中各種精細而又嚴密的調控仍然需要科學家們的研究闡釋。