李鵬飛 范家明 劉 河 張 茜 安卓玲 劉麗宏

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院藥事部, 北京 100020)

百草枯(paraquat，PQ)又稱對(duì)草快、克蕪蹤，屬聯(lián)吡啶雜環(huán)化合物，為速效觸殺型、滅生性季胺鹽類除草劑，在我國(guó)農(nóng)林行業(yè)廣泛使用，目前尚無(wú)替代品[1]。百草枯對(duì)人毒性極大，且無(wú)特效藥，口服中毒病死率可達(dá)90%以上，百草枯可導(dǎo)致肝、腎等多器官衰竭，肺部不可逆纖維化和呼吸衰竭[2-3]。百草枯的致毒機(jī)制目前尚未闡明，研究[4]顯示百草枯是一電子受體，吸收入體后通過(guò)一系列作用引起細(xì)胞內(nèi)超氧化陰離子自由基及過(guò)氧化氫過(guò)量，引起組織器官細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化，從而造成多系統(tǒng)組織器官的損害。百草枯在人體的毒代動(dòng)力學(xué)尚不清楚。初步的毒代動(dòng)力學(xué)研究[5-6]顯示，百草枯可經(jīng)皮膚、呼吸道和消化道不完全吸收，隨血液分布至全身各組織器官，肺中含量較高，達(dá)到血中含量的十至數(shù)十倍。百草枯在體內(nèi)很少降解，常以完整的原形物隨糞、尿排出，少量可經(jīng)乳汁排出。研究[7-9]顯示，百草枯血漿質(zhì)量濃度僅能間接反映百草枯體內(nèi)情況，并不能代表受損傷器官中毒物濃度，研究中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注各靶器官的損傷和器官衰竭情況。本研究采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)測(cè)定方法，系統(tǒng)性研究了染毒下百草枯在大鼠體內(nèi)多個(gè)組織中的分布情況，為百草枯毒性機(jī)制的進(jìn)一步研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～240 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。

1.2 儀器與試劑

5500 QTRAP型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子化源(electrospray ionization，ESI)以及Analyst 1.6數(shù)據(jù)處理軟件，美國(guó)Sciex公司；島津20A高效液相色譜系統(tǒng)，包括液相泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱等，日本島津公司。BP211D型十萬(wàn)分之一分析天平，德國(guó)Sartorius公司。Direct 8型Milli-Q超純水系統(tǒng)，美國(guó)密理博公司。百草枯對(duì)照品，含量為99.8%，批號(hào)：856177-250 MG，百草枯-d8對(duì)照品，含量為98.0%，批號(hào)：50636-5 MG，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。其他試劑均為色譜均，超純水由Milli-Q超純水系統(tǒng)制備。

1.3 百草枯組織樣本LC-MS/MS測(cè)定方法建立

1.3.1 溶液的配制

校正曲線和質(zhì)控樣本的配制：精密稱取10 mg百草枯對(duì)照品，加入對(duì)應(yīng)體積的乙腈-水(1∶1)溶解并渦旋，配制1 g/L的百草枯儲(chǔ)備液。精密量取百草枯儲(chǔ)備液，用空白組織勻漿提取液逐級(jí)稀釋至校正曲線樣本所需濃度1、2、5、10、20、50、100 μg/L。重新稱量并配制質(zhì)控用儲(chǔ)備液，精密量取并用空白組織勻漿提取液逐級(jí)稀釋至質(zhì)控樣本所需濃度 3、15、80 μg/L。內(nèi)標(biāo)溶液的配制：精密稱取10 mg百草枯-d8對(duì)照品，加入乙腈-水(1∶1)充分溶解，配制成1 g/L的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。取適量?jī)?nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液用乙腈逐級(jí)稀釋至100 μg/L的百草枯-d8內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：Waters Acclaim Trinity Q1色譜柱(3.0 mm×50.0 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水[100 mmol/L甲酸銨、0.4%(體積分?jǐn)?shù))甲酸]，流速：0.8 μL/min(1∶1分流)，梯度洗脫(表1)；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度條件Tab.1 Conditions of gradient elution

1.3.3 質(zhì)譜條件

離子源： ESI，正離子模式；離子噴射電壓：5 500 V；溫度：550 ℃；鞘氣壓力：379.2 kPa；霧化氣壓力：379.2 kPa；氣簾氣壓力：158 kPa；碰撞氣壓力設(shè)為Medium；以上氣體均使用高純氮?dú)?；掃描方式為多重反?yīng)監(jiān)測(cè)。百草枯和百草枯-d8解簇電壓：50 V、140 V；碰撞能量：16 eV、15 eV；百草枯和百草枯-d8定量分析的離子對(duì)分別為質(zhì)譜比(m/z)93.1→171.1和m/z97.1→179.2，百草枯用于定性考察的離子對(duì)為m/z186.1→171.1。

1.4 大鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及組織樣本采集

大鼠飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物房?jī)?nèi)，所有的實(shí)驗(yàn)操作均符合首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的要求，溫度為(22±2) ℃，相對(duì)濕度為23%。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食不禁水。

雄性大鼠36只，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為9組，每組4只。9個(gè)組分別為給藥前組、給藥后0.5、1、3、6、10、24、48、72 h組，給藥前組不給予百草枯，直接處死取組織；給藥后組單次灌胃給予90 mg/kg百草枯，分別于對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，處死前取血漿，處死后分別取心、肝、肺、腎、大腦、小腦、胃組織。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組織用0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液洗凈，放入-70 ℃冰箱中冰凍待處理。

大鼠處死前通過(guò)眼眶取血約0.4 mL，置于含肝素的EP管中，立即以13 200 r/min離心10 min分離血漿，放入-70 ℃冰箱中冰凍待測(cè)。

1.5 組織樣本處理方法

剪取并稱量組織(0.250±0.025)g，若組織少于0.25 g，全部取用，記錄全部重量。注意取組織不同部位各一小部分，例如，不同肝葉、雙腎等。加入500 μL乙腈-水(1∶1)，使用勻漿機(jī)勻漿2～8 min(根據(jù)實(shí)際需要，不同組織勻漿時(shí)間可適當(dāng)調(diào)整)，組織勻漿液渦流振蕩20 min，在4 ℃下13 200 r/min離心5 min，組織勻漿上清液倒入另一1.5 mL EP管中，-70 ℃冰凍待測(cè)。

向1.5 mL EP管中加入組織勻漿上清液樣本100 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，加入乙腈200 μL，渦流2 min后在4 ℃下13 200 r/min離心10 min，取150 μL上清液進(jìn)行LC-MS/MS分析，進(jìn)樣10 μL。

1.6 各組織和血漿中百草枯濃度LC-MS/MS測(cè)定方法

本研究前期建立了血漿中百草枯濃度的定量檢測(cè)方法，并按照9012《生物樣品定量分析方法指導(dǎo)原則》[10]進(jìn)行全面方法學(xué)驗(yàn)證，驗(yàn)證通過(guò)后采用建立的方法進(jìn)行大鼠不同劑量染毒后毒代動(dòng)力學(xué)研究[11]。除基質(zhì)不同外，7種組織提取液的樣本前處理方法、液相條件、質(zhì)譜參數(shù)與血漿檢測(cè)質(zhì)譜方法完全相同。組織樣本檢測(cè)時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣本均采用對(duì)應(yīng)空白組織勻漿提取液配制，與組織樣本完全一致。研究中僅對(duì)每種組織樣本進(jìn)行了部分方法學(xué)驗(yàn)證，分別進(jìn)行了連續(xù)2 d、每天4個(gè)濃度水平質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和精密度考察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度與精密度

所有質(zhì)控樣品準(zhǔn)確度為88.03%～112.73%，精密度為10.14%，方法的準(zhǔn)確度和精密度達(dá)到生物樣品分析要求。

2.2 大鼠基本情況

大鼠灌胃百草枯染毒后出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少，毛發(fā)易脫落，飲水、飲食減少等現(xiàn)象。大鼠灌胃百草枯染毒后體質(zhì)量隨時(shí)間降低明顯，72 h處置組體質(zhì)量降幅最大，降幅為給藥前體質(zhì)量的13.21%。除按處置時(shí)間處死取樣外，36只大鼠均無(wú)染毒死亡現(xiàn)象。

2.3 組織分布結(jié)果

大鼠灌胃百草枯染毒后組織，其中胃、腎、肺和肝的達(dá)峰質(zhì)量濃度均>30 μg/g，心、大腦和小腦的達(dá)峰質(zhì)量濃度均<10 μg/g。胃和肺1 h濃度最高，分別為(205.5±69.5)μg/g、(35.5±28.0)μg/g；腎和肝3 h濃度最高，分別為(124.8±146.9)μg/g、(30.9±42.1)μg/g。各組織和血漿大多數(shù)濃度點(diǎn)個(gè)體間變異超過(guò)50%，呈現(xiàn)較高的個(gè)體差異，詳見(jiàn)表2。不同組織是同一時(shí)間點(diǎn)濃度差異的影響因素(P<0.01)，除肝、腎、大腦和小腦外，不同時(shí)間是同一組織濃度差異的影響因素(P<0.05)。同一組織或同一時(shí)間內(nèi)兩兩比較，大多數(shù)組織間比較或時(shí)間點(diǎn)間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Tissue and plasmaSampling times/h0.513610244872F2P2Stomach/(μg·g-1)198.3±42.3205.5±69.5150.2±77.641.5±8.231.1±10.830.6±16.56.0±2.02.4±1.218.31< 0.001Kidney/(ng·g-1)54.1±12.843.8±11.8124.8±146.919.6±8.717.9±5.620.4±10.39.0±6.93.6±3.12.250.065Lung/(ng·g-1)29.4±20.335.5±28.013.4±12.510.1±7.89.1±2.79.2±1.56.1±4.54.9±1.62.850.026Liver/(ng·g-1)17.1±9.911.1±5.630.9±42.110.1±6.83.7±1.05.9±4.71.9±0.80.8±0.31.620.179Plasma/(ng·g-1)10.41±10.083.41±1.142.07±1.061.54±1.581.34±1.600.93±0.650.47±0.300.11±0.073.290.01Heart/(μg·g-1)8.8±2.68.7±3.87.5±5.13.7±1.72.8±1.24.7±1.32.9±2.12.2±1.04.160.004Brain/(μg·g-1)5.3±7.21.5±0.91.3±1.70.5±0.21.2±0.72.4±2.40.3±0.10.9±0.41.330.279Cerebellum/(μg·g-1)0.8±1.01.6±0.71.3±0.81.2±0.41.5±1.01.2±0.31.2±0.21.8±0.40.890.532F156.75629.1094.41126.97023.8908.8803.8804.360--P1< 0.001< 0.0010.002< 0.001< 0.001< 0.0010.0060.004--

F1,P1: repeated measures ANOVA;F2,P2: one way ANOVA.

大鼠百草枯染毒后組織及血漿濃度柱狀分布見(jiàn)圖1，濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，百草枯在大鼠胃中分布的濃度是在各個(gè)臟器中最高的，達(dá)峰較快。大鼠的腎、肺和肝也是百草枯分布較多的臟器，其中腎臟中的濃度高于肺中的濃度，但達(dá)峰時(shí)間比肺慢。百草枯在腎臟中濃度較高，急性腎損傷也是百草枯中毒后常見(jiàn)癥狀。心臟、大腦和小腦中百草枯也有一定分布，濃度最大值為1.6～8.8 μg/g，且大腦中分布較快、心臟排出緩慢。百草枯體內(nèi)分布狀況與其中毒后靶器官損傷部位及程度高度一致，除大腦48 h外，7種組織24～72 h中組織質(zhì)量濃度均大于血漿毒物濃度，其中胃、腎、肺和肝中百草枯的質(zhì)量濃度遠(yuǎn)高于血漿濃度。

圖1 大鼠百草枯染毒后組織及血漿濃度圖Fig.1 Tissue and plasma concentration in rats exposed to paraquatA：higher peak mass concentration；B：lower peak mass concentration.

圖2 大鼠百草枯染毒后組織及血漿毒物濃度-時(shí)間曲線Fig.2 Concentration-time profile of tissue and plasma concentration in rats exposed to paraquat

3 討論

毒物組織分布研究的前提是建立精準(zhǔn)的目標(biāo)物定量方法，百草枯的質(zhì)譜定量在離子對(duì)和色譜柱的選擇上均需要深入探索和優(yōu)化。百草枯為季胺鹽，本身帶兩個(gè)電荷，質(zhì)譜中最常見(jiàn)的準(zhǔn)分子離子峰為m/z93.1，但在轉(zhuǎn)移過(guò)程或離子源中，也可能失去一個(gè)電荷，準(zhǔn)分子離子峰為186.1，經(jīng)碰撞后失去一個(gè)CH3+形成子離子m/z171.2。百草枯的極性很強(qiáng)，在普通的C18柱子上無(wú)法或很難保留，本研究選用的Acclaim trinity Q1色譜柱是專用于高極性化合物的百草枯專用色譜柱，在百草枯的分離和峰形上有便優(yōu)異的效果。樣本測(cè)試中百草枯組織濃度極高，超過(guò)定量上限的組織樣本需經(jīng)空白組織提取液稀釋后進(jìn)行復(fù)測(cè)。在勻漿過(guò)程中要多次逐級(jí)清洗勻漿機(jī)，防止交叉污染；先勻漿所有空白樣本，根據(jù)百草枯體內(nèi)濃度特點(diǎn)，組織勻漿按時(shí)間點(diǎn)“后前”順序勻漿；高濃度的肝、肺、腎、胃組織最后勻漿。

毒性研究應(yīng)盡可能采用與臨床相同的給予途徑和劑型，以便比較不同種屬動(dòng)物的全身暴露情況。由于百草枯是易中毒毒物，臨床實(shí)踐中無(wú)給藥途徑，實(shí)際急救中中毒患者均為一次性口服誤入、皮膚黏染、肺吸入，以口服誤入為最常見(jiàn)，且百草枯口服誤入中毒幾乎很少有多次染毒情況，因此本研究選用最常見(jiàn)的一次性灌胃給予毒物。我國(guó)自2016年7月1日停止百草枯水劑在國(guó)內(nèi)銷售和使用[12]，臨床上中毒多數(shù)為百草枯膠劑或膠劑稀釋液中毒，本研究中使用百草枯膠劑稀釋至所需濃度后灌胃給予大鼠。大鼠急性給予百草枯半數(shù)致死量(median lethal dose, LD50)為150 mg/kg，研究選用90 mg/kg劑量進(jìn)行試驗(yàn)。

本研究中除按處置時(shí)間處死取樣外，36只大鼠均無(wú)染毒死亡現(xiàn)象，與本研究室開展的大鼠體內(nèi)的百草枯毒代動(dòng)力學(xué)研究90 mg/kg劑量下病死率有極大的差異[6]，推測(cè)由于藥代動(dòng)力學(xué)研究中需要在給予毒物當(dāng)天密集采血11個(gè)，造成大鼠失血較多，引起高于百草枯LD50的病死率。百草枯大量口服誤入可于24 h內(nèi)迅速出現(xiàn)肺水腫和肺出血，嚴(yán)重者可由此致死，百草枯中毒后全身中毒征象波及多器官系統(tǒng)，大多呈漸進(jìn)式發(fā)展，約1～3 d內(nèi)肺、腎、肝、心臟及腎上腺等器官發(fā)生壞死，后續(xù)再進(jìn)展而亡[13-14]。本研究采集組織樣本最長(zhǎng)至72 h，漸進(jìn)式發(fā)展至死亡72 h內(nèi)還未有發(fā)生，72 h內(nèi)未死亡并不能說(shuō)明病死率較低，針對(duì)百草枯病死率的研究需要更長(zhǎng)的觀察時(shí)間(28 d)。

百草枯在大鼠胃中濃度最高的，達(dá)峰較快，與臨床早期癥狀一致(惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉及血便等)，百草枯臨床中毒后第一時(shí)間催吐可能能有效降低體內(nèi)吸收總量，利于愈后和生存率，同時(shí)，及時(shí)清理口腔毒物，補(bǔ)液利尿，促進(jìn)毒物排泄。肺是百草枯損傷的主要靶器官，百草枯入肺較快、排出緩慢，大鼠72 h時(shí)肺組織中質(zhì)量濃度比其他組織均高，百草枯中毒患者的死因大多數(shù)為肺部不可逆的纖維化損傷和呼吸窘迫綜合征。大腦和小腦由于濃度較低、排出體外較慢等原因，不同時(shí)間點(diǎn)濃度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，百草枯中毒患者在中毒至死亡的時(shí)間內(nèi)，神志保持清醒，身體外觀無(wú)明顯的不適，這也是百草枯成為讓人聞之色變的毒物原因之一。百草枯在各組織中有蓄積、排出緩慢，血漿質(zhì)量濃度僅能間接反映百草枯體內(nèi)情況，并不能代表受損傷器官毒物水平，臨床上應(yīng)對(duì)癥和支持治療，特別應(yīng)注意處理好呼吸窘迫綜合征、肝壞死和急性腎衰竭等威脅生命的毒效應(yīng)。通過(guò)血液灌流可以祛除血液中的毒物成分，從而減輕或解除毒物對(duì)器官的損害。百草枯體內(nèi)呈現(xiàn)極大的組織間濃度差異和個(gè)體差異，應(yīng)針對(duì)每個(gè)病例，個(gè)性化精準(zhǔn)診斷和救治。