王 青，蘇聰平，張惠敏，羅 慧，焦文超，李 琳，張晶璇，郭淑貞

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院，北京 100029）

心力衰竭（簡稱心衰）是指由于各種原因?qū)е碌男募〗Y(jié)構(gòu)和功能異常，引起心室收縮功能（射血）和/或舒張功能（充盈）受損的臨床綜合征。《中國心血管病報告2017》[1]指出，心衰現(xiàn)患者人數(shù)高達(dá)450萬，且患病率隨年齡增加上升。隨著中國逐漸步入老齡化社會，心衰防治工作將是中國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)的巨大挑戰(zhàn)。

芪參顆粒以益氣溫陽、活血解毒立法，治療心衰藥效確切。前期研究表明：其清熱解毒藥味可通過改善能量代謝效率治療心衰[2]。金銀花是芪參顆粒中清熱解毒治法的代表性藥物。獐牙菜苷，又名當(dāng)藥苷，是金銀花中含量最高的環(huán)烯醚萜苷類化合物，有可能是芪參顆粒干預(yù)心衰的主要活性成分之一。既往獐牙菜苷的藥理研究主要集中在治療關(guān)節(jié)炎[3]、骨質(zhì)疏松[4]、糖尿病[5]等。治療心血管疾病的相關(guān)報道較少，僅有一篇報道[6]顯示獐牙菜苷可以有效對抗烏頭堿引發(fā)的大鼠心律失常，其作用機制與調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬有關(guān)。

為進(jìn)一步研究獐牙菜苷治療心衰的藥理活性，本研究采用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫對獐牙菜苷治療心衰的作用及靶點進(jìn)行預(yù)測，并采用異丙腎上腺素致心衰小鼠，觀察其干預(yù)心衰的藥效，分析起效環(huán)節(jié)，旨在發(fā)現(xiàn)獐牙菜苷干預(yù)治療心衰的作用及其機制，進(jìn)一步闡明芪參顆粒的效應(yīng)成分及其機制，同時為治療心衰提供新思路和新的候選藥物。

1 材料

1.1 動物 SPF級C57/BL6N小鼠，體質(zhì)量18～22 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號為SCXK（京）2016-0006。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動物實驗室，恒溫恒濕環(huán)境，自由飲水，普通飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始造模給藥。

1.2 試劑 獐牙菜苷由成都普思生物科技有限公司提供（批號：PS0111123）。卡托普利由中美上海施貴寶制藥有限公司（批號：AAQ3404）。鹽酸異丙腎上腺素（ISO）由西格瑪-奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司提供（批號：101722747）。鈉鉀ATP酶α1抗體由Abcam（上海）公司提供（貨號：ab7671）。羊抗小鼠IgG-HRP標(biāo)記抗體由北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司提供（貨號：DE0602）。RIPA裂解液由北京普利萊基因技術(shù)有限公司提供（貨號：C1053）。

1.3 儀器 加拿大Vevo?2100小動物超聲影像平臺，匈牙利3DHIESTECH數(shù)字切片掃描系統(tǒng)Pannoramic 250/MIDI，美國Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)Universal Hood II，美國伯樂Bio-Rad小型垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)。

1.4 BATMAN-TCM在線生物信息數(shù)據(jù)庫 本數(shù)據(jù)庫的網(wǎng)址 http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/。

2 方法

2.1 分組與模型制備 C57/BL6小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為空白組（8只）、模型組（11只）、卡托普利組（9只）、獐牙菜苷組（9只）。模型組與給藥組采用課題組前期建立的梯度造模法[7]：通過皮下注射過量ISO（第1日20mg/kg，第2日10 mg/kg，第3～14日5 mg/kg）構(gòu)建心衰小鼠模型?？ㄍ衅绽M每天給予卡托普利16.5 mg/kg，獐牙菜苷組每天給予獐牙菜苷120 mg/kg[8]，從造模第1天起給藥，給藥14 d?？瞻捉M每日給予等量蒸餾水。

2.2 心功能檢測 實驗終點，采用加拿大Vevo?2100小動物超聲影像平臺評價小鼠心功能。測量左室收縮末內(nèi)徑（LVIDs）、左室舒張末內(nèi)徑（LVIDd），計算射血分?jǐn)?shù)（EF）和短軸縮短率（FS）。每只動物采樣3次，記錄3個連續(xù)心動周期的平均值用于后續(xù)分析。

2.3 病理學(xué)檢測 取材時將心臟置于1%磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗血液，使用數(shù)碼相機，拍攝、觀察心臟整體形態(tài)。

心臟組織沿中心最大橫徑處切開，心底部浸入4%多聚甲醛固定24 h后，常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋、切片貼片，進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE）。

2.4 數(shù)據(jù)庫靶點預(yù)測 打開http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/，選擇 example 3，輸入“Sweroside”，及該化合物的pubmed CID：161036，確定Score cutoff為20，以P＜0.05為統(tǒng)計學(xué)意義范圍進(jìn)行檢索獐牙菜苷治療心衰疾病靶點。

2.5 Western blot檢測候選靶點 心肌組織液氮速凍，-80℃保存。RIPA裂解液提取心肌組織總蛋白。上樣量為30 μg，電泳濃縮膠時電壓為80 V，電泳分離膠時，電壓為120 V，電泳1.5 h。電轉(zhuǎn)采用恒流300 mA，1.5 h。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4°孵育過夜（小鼠單克隆抗體，ATP1A1，1∶5 000），TBS-T 緩沖液漂洗3次，每次10 min；取出聚偏二氟乙烯膜（PVDF）加入二抗（羊抗小鼠IgG-HRP 標(biāo)記，1∶5000），室溫孵育1 h，TBS-T緩沖液洗膜3次后，滴加ECL發(fā)光液，曝光。記錄每條蛋白泳帶的灰度值，采用Image lab進(jìn)行定量分析。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SAS8.4統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 小鼠心臟超聲 模型組與空白組相比，EF、FS值顯著降低（P＜0.01），LVIDs值顯著增加（P＜0.01）、LVIDd有所增加（P＜0.05）；與模型組相比，獐牙菜苷可以顯著改善過量ISO致心衰小鼠的EF和FS值（P＜0.01），使 LVIDs顯著降低（P＜0.01），對 LVIDd無顯著影響，該作用與陽性藥卡托普利相近。見圖1。3.2 病理學(xué)檢測 剖檢可見，與空白組小鼠相比，模型組小鼠心臟變大，給藥組小鼠心臟與空白組小鼠心臟大小相近（見圖2）。心臟HE染色切片顯微鏡下觀察可見，與空白組小鼠相比，模型組小鼠心臟組織左心室壁變薄，心肌纖維變細(xì)，部分動物心臟組織可見心肌纖維壞死、炎細(xì)胞浸潤等病理改變；與空白組小鼠相比，卡托普利組和獐牙菜苷組小鼠心臟組織左心室壁厚度基本正常，心肌纖維無明顯變細(xì)。見圖3。

3.3 BATMAN-TCM預(yù)測靶點 BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫預(yù)測獐牙菜苷治療心衰靶點為ATP1A1（ATPase Na+/K+Transporting Subunit Alpha 1）。

3.4 Western blot結(jié)果 與空白組相比，模型組ATP1A1蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.01）；與模型組相比，獐牙菜苷組ATP1A1表達(dá)上升（P＜0.01）。

4 討論

心衰是多種心系疾病的重要轉(zhuǎn)歸，是各種心臟疾病的嚴(yán)重和終末階段。目前西醫(yī)多采用抑制神經(jīng)內(nèi)分泌激活的黃金三角治療策略[9]，盡管有一定的療效，但不良反應(yīng)較多，遠(yuǎn)未能滿足臨床需求。中醫(yī)藥中國的重要寶庫，具有多水平、多層次、多途徑、毒副作用小的起效特點。芪參顆粒治療心衰療效確切，機制研究涉及較廣，但多采用復(fù)方整體研究思路[10]，對效應(yīng)成分的研究還不夠。

圖1 獐牙菜苷對過量ISO致心衰小鼠EF、FS、LVIDd、LVIDs的影響

圖2 獐牙菜苷對過量ISO致心衰小鼠心臟大體形態(tài)的影響

為進(jìn)一步揭示芪參顆粒發(fā)揮藥效的主要成分，對芪參顆粒有效活性成分進(jìn)行藥效篩選。獐牙菜苷是芪參顆粒中特色藥有效成分，但目前關(guān)于其治療心血管疾病的研究報道較少。故本研究依據(jù)BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫對獐牙菜苷治療心衰的作用靶點進(jìn)行分類預(yù)測和篩選，預(yù)測靶點為，即Na+-K+-ATP酶α1亞基（ATP1A1）。三磷酸腺苷酶（NKA酶），是存在于細(xì)胞膜上的一種膜蛋白，由α、β、γ 3種亞基組成，α亞基是其中最重要的催化亞基，大小約為 112 kDa，含有 ATP、Na+、K+及強心苷的結(jié)合位點[11]。α亞基的表達(dá)具有組織特異性和種屬差異性，α1表達(dá)最為廣泛，存在于所有細(xì)胞中，Na+-K+-ATP酶可利用ATP的水解產(chǎn)生能量，使3個Na+移出細(xì)胞，2個 K+移入細(xì)胞，確保跨膜 Na+、K+電化學(xué)梯度的產(chǎn)生和維持。

實驗結(jié)果證明，皮下注射過量ISD可引起模型組小鼠發(fā)生心衰。獐牙菜苷可以顯著改善過量ISD引起的心衰，且作用機制與預(yù)測靶點ATP1A1有關(guān)。心衰發(fā)生時，NKA酶α亞基的表達(dá)會發(fā)生改變，α1亞基具有離子泵與信號調(diào)節(jié)的功能[12]。目前報道強心苷類藥物的唯一作用靶點是NKA酶，但強心苷類藥物具有藥物治療安全范圍狹窄、容易中毒的缺點。獐牙菜苷可能通過ATP1A1發(fā)揮強心作用，一方面有助于揭示中藥復(fù)方芪參顆粒起效的物質(zhì)基礎(chǔ)，另一方面這可能為具有強心作用的藥物研究提供新的候選化合物。開發(fā)中醫(yī)藥寶庫，挖掘更多活性成分，明確其靶標(biāo)，有助于中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展繁榮。

圖3 獐牙菜苷對過量ISO致心衰小鼠心臟組織病理結(jié)果（HE染色，40×）

圖4 Western blot法檢測各組小鼠ATP1A1蛋白表達(dá)變化

本研究通過過量ISO構(gòu)建小鼠心衰模型，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測靶點，并在蛋白表達(dá)水平進(jìn)行驗證，表明獐牙菜苷治療心衰的藥效與上調(diào)ATP1A1的表達(dá)量有關(guān)，為獐牙菜苷成為抗心衰藥物的候選藥物奠定了基礎(chǔ)。但獐牙菜苷干預(yù)心衰的藥效還需要通過其他動物模型進(jìn)行驗證。ATP1A1是否為獐牙菜苷的直接作用靶點，ATP1A1的表達(dá)量變化是否與獐牙菜苷的抗心衰藥效存在因果關(guān)系，都還有待進(jìn)一步的深入研究。