王樂，程磊

（中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070）

瘦素基因（Leptin，Lep）最初克隆于肥胖突變型小鼠，該基因的突變會導(dǎo)致小鼠過度肥胖[1]。大量研究表明，Lep 基因在脊椎動物脂肪沉積和能量代謝調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。魚類的Lep 基因首先從紅鰭東方鲀Takifugu rubripes 中克隆得到[2]。在重要模式生物斑馬魚Danio rerio 中鑒定到Lep 基因的兩種亞型，被分別命名為Lepa 和Lepb[3]。迄今已有數(shù)十種魚類的Lep 基因被陸續(xù)鑒定出來，分析顯示真骨魚類普遍存在兩種Lep 基因亞型，支持真骨魚類較四足動物多經(jīng)歷了一輪額外的全基因組加倍的觀點(diǎn)[3]。

鯽Carassius auratus 是我國重要的養(yǎng)殖魚類之一，2017 年我國的鯽養(yǎng)殖產(chǎn)量超過了280 萬t。鯽在分類上屬于鯉形目Cypriniformes 鯉科Cyprinidae 鯉亞科Cyprininae，與同屬于鯉科的斑馬魚Danio rerio具有25 條染色體不同，鯉亞科魚類通常有50 條染色體，推測鯉亞科在斑馬魚等真骨魚類的基礎(chǔ)上多經(jīng)歷了一輪基因組加倍[4]。Tang 等[5]在鯉Cyprinus carpio 中克隆到Lepa 和Lepb 基因，發(fā)現(xiàn)Lepa基因確實(shí)如預(yù)期一樣在鯉基因組中存在進(jìn)一步的加倍，可以分成Lepa1 和Lepa2。但是，該研究只報(bào)道了一種Lepb 基因。在Genbank 數(shù)據(jù)庫中現(xiàn)在可以查詢到若干鯽Lep 基因的同源序列，但是多不完整。尚不清楚鯉、鯽的基因組中是否如預(yù)期一樣存在兩份拷貝的Lepb 基因。

在上述工作的基礎(chǔ)上，利用PCR 同源擴(kuò)增的方法成功克隆了鯽Lep 基因的四個亞型，在鯉基因組中獲得了Lepb 基因的兩個亞型。這進(jìn)一步驗(yàn)證了鯉、鯽等鯉亞科魚類比斑馬魚等真骨魚類多了一輪的基因組加倍，為全面研究鯉、鯽的Lep 基因的功能及不同亞型在功能和調(diào)控機(jī)制上的分化奠定了基礎(chǔ)[4]。

1 材料與方法

1.1 材料

研究中所用的鯽Carassius auratus 和鯉Cyprinus carpio 采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭實(shí)驗(yàn)站。剪取約200 mg 尾鰭，利用蛋白酶K 消化—酚氯仿抽提法純化總DNA。獲得的DNA沉淀重新溶解于去離子水中后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性和濃度，以Nanodrop8000 檢測DNA 的濃度和純度后，調(diào)整到約50ng/μL 備用。

1.2 方法

1.2.1 Lep 基因克隆

克隆Lep 基因的PCR 引物來源于Tang 等[5]的報(bào)道及根據(jù)GenBank 數(shù)據(jù)庫序列信息設(shè)計(jì)的新引物。引物的信息如表1 所示，克隆不同Lep 基因所需的具體引物對在結(jié)果部分分別敘述。PCR 反應(yīng)體系為50μL，包含25 μL 的2×Es Taq MasterMix（Dye）（康維世紀(jì)）、10 μM 的上下游引物各2μL，1μL 的DNA 模板，用ddH2O 補(bǔ)足至50μL。PCR 擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性2 min；35 個循環(huán)，每個循環(huán)94℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸90s；72℃終延伸15min。所有PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，用Axygen 膠回收試劑盒純化。純化產(chǎn)物連接至pMD19-T 載體（TaKaRa），并轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞（TaKaRa）中。挑選陽性克隆，委托金唯智生物科技有限公司用3730XL 毛細(xì)管電泳平臺測序。

表1 本研究所用到的引物信息Tab.1 Primers used in the experiment

1.2.2 Lep 基因序列分析

測序結(jié)果使用BioEdit 7.0 軟件拼接和整理，參考斑馬魚等已知魚類的Lep 基因的注釋信息，利用Expasy 的在線工具Translate（https://web.expasy.org/translate/）預(yù)測各Lep 基因的開放閱讀框及氨基酸序列。注釋后的鯉鯽Lep 基因序列被提交至Genbank 中（檢索號分別MK482332-MK482337）。利用Expasy 的在線工具ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）計(jì)算預(yù)測各蛋白質(zhì)的理論等電點(diǎn)（pI）和分子量信息；利用在線工具SignalP 4.0 預(yù)測信號肽序列及半胱氨酸殘基（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；利用含有SWISS-MODEL 的ProModII 程序分析蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)。利用cluster W軟件將克隆得到的Lep 基因與從Genbank 中下載得到的硬骨魚類及四足動物的Lep 基因的氨基酸序列一起進(jìn)行多重比對，利用Mega3.1 軟件提供的NJ（Neighbor-joining）法繪制Lep 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯽Lepa 基因的克隆及序列分析

利用表1 中的1、2 引物對擴(kuò)增，可獲得鯽Lepa1（CaLepa1）的基因全長序列，用3、4 引物對擴(kuò)增可得鯽Lepa2（CaLepa2）的基因全長序列。CaLepa1基因CDS 全長719bp，其開放閱讀框全長為516bp，由兩段外顯子組成，編碼171 個氨基酸序列，非編碼序列包括41bp 的5’-非編碼區(qū)序列（5’-UTR）、89bp 的內(nèi)含子序列及73bp 的3’-非編碼區(qū)序列（3’-UTR）組成（圖1A）。所編碼的氨基酸序列包含20 個信號肽序列及2 個半胱氨酸殘基。預(yù)測所得蛋白分子量為19.51 ku，理論pI 為8.96，不穩(wěn)定系數(shù)為38.55，脂肪系數(shù)為116.32，親水性系數(shù)為-0.049，表明其為親水性蛋白。CaLepa2 全長745bp，其開放閱讀序列為510bp，由兩段外顯子組成，可編碼169個氨基酸序列，非編碼序列包括50bp 的5’-UTR、102bp 的內(nèi)含子序列及83 bp 的3’-UTR 組成（圖1B）。所編碼的氨基酸序列包含20 個信號肽序列及2 個半胱氨酸殘基。預(yù)測所得蛋白分子量為19.10 ku，理論pI 為8.87，不穩(wěn)定系數(shù)為35.15，脂肪系數(shù)為118.88，親水性系數(shù)為0.041，表明其為疏水性蛋白。

2.2 鯽Lepb 基因的克隆及序列分析

利用表1 中的5、8 引物對擴(kuò)增可獲得鯽Lepb1（CaLepb1）的基因全長序列。而鯽Lepb2（CaLepb2）的基因全長序列則需要用4、7 及6、9 兩對引物分別擴(kuò)增、拼接而成。CaLepb1 的全長序列為1 476bp，其開放閱讀序列為507bp，由兩個外顯子組成，編碼168 個氨基酸，非編碼序列由281bp 的5’-UTR、654 bp 的內(nèi)含子序列及34 bp 的3’-UTR 組成（圖1C）。CaLepb1 所編碼的氨基酸序列包含16 個信號肽及3 個半胱氨酸殘基，預(yù)測所得蛋白分子量為19.31ku，理論pI 為5.19，不穩(wěn)定系數(shù)為44.36，脂肪系數(shù)為108.51，親水性系數(shù)為0.048，表明其為疏水性蛋白。CaLepb2 全長序列為1 558bp，其開放閱讀序列為507bp，由兩個外顯子組成，可編碼168aa，非編碼序列包括325bp 的5’-UTR、694bp 的內(nèi)含子序列及32 bp 的3’-UTR（圖1D），有趣的是該基因的5’端有一個（AC）n 的微衛(wèi)星。CaLepb2 編碼的氨基酸序列包含20 個信號肽和3 個半胱氨酸殘基。預(yù)測所得蛋白分子量為19.20ku，理論pI 為6.20，不穩(wěn)定系數(shù)為49.38，脂肪系數(shù)為109.11，親水性系數(shù)為0.019，表明其為疏水性蛋白。

2.3 鯉Lepb 基因的克隆及序列分析

Tang 等[5]只克隆鯉Lepb 基因的一種亞型，使用的引物對恰好位于開放閱讀框的起始處和結(jié)束處。本研究中以表1 中5、8 引物對擴(kuò)增獲得鯉Lepb1（CcLepb1）基因的全長序列，以5、9 引物對擴(kuò)增獲得鯉Lepb2（CcLepb2）基因的全長序列。CcLepb1基因的全長為1 536bp，其開放閱讀序列為507bp，由兩個外顯子組成，編碼168 個氨基酸序列，非編碼序列包括300 bp 的5’-UTR、695 bp 的內(nèi)含子序列及34 bp 的3’-UTR（圖1E）。所編碼的氨基酸序列包含16 個信號肽和3 個半胱氨酸殘基。預(yù)測所得蛋白分子量為19.25 ku，理論pI 為5.55，不穩(wěn)定系數(shù)為42.30，脂肪系數(shù)為107.92，親水性系數(shù)為0.020，表明其為疏水性蛋白。CcLepb2 基因的全長序列為1 553bp，其開放閱讀序列為507bp，由兩個外顯子組成，可編碼168 個氨基酸，非編碼序列包括269 bp 的5’-UTR、745 bp 的內(nèi)含子序列及32 bp 的3’-UTR（圖1F）。所編碼的氨基酸序列也包含16 個信號肽和3 個半胱氨酸殘基。預(yù)測所得蛋白分子量為19.38 ku，理論pI 為5.18，不穩(wěn)定系數(shù)為39.94，脂肪系數(shù)為98.04，親水性系數(shù)為-0.035，表明其為親水性蛋白。

2.4 Lep 基因的進(jìn)化

Lep 氨基酸序列相似性比較結(jié)果（圖2）表明，鯉、鯽、人和斑馬魚間的瘦素氨基酸序列差異很大，即使是同種間的Lepa 與Lepb 間的差異也很明顯，但物種內(nèi)部同一亞型的兩個基因具有較高的相似性。鯽CaLepa1 及CaLepa2 間具有高達(dá)78.7%的相似性，但與CaLepb1、CaLepb2 的相似性僅為28.2%～29.2%；同樣，CaLepb1、CaLepb2 間的相似性可高達(dá)91.1%，且與CcLepb1、CcLepb2 的相似性也很高，可達(dá)86.3%～95.2%。而本研究所得鯽Lepa、Lepb及鯉Lepb 共計(jì)6 個亞型與人Lep 之間的相似性都很低，僅為21.7%～27%。氨基酸序列的多重比對結(jié)果（圖3）也進(jìn)一步驗(yàn)證了上述結(jié)論，即該基因亞型間序列相似性較低，而亞型內(nèi)序列相似性較高。

圖2 鯽、鯉、斑馬魚與人Lep 氨基酸同源性比較Fig.2 Comparative homology of Lep amino acid sequences in crucian carp,comm on carp,zebrafish and human

圖3 鯽、鯉Lep 氨基酸序列的多重比對Fig.3 Multiple alignment of Lep amino acid sequences in crucian carp and common carp

圖4 基于硬骨魚及其他四足動物的Lep 基因序列同源性分析構(gòu)建的進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of crucian carp and other tetrapod based on Lep using the Neighbor-joining method

利用Mega3.1 軟件中的N-J 法構(gòu)建硬骨魚及其他四足動物的Lep 基因系統(tǒng)發(fā)育樹，所用到物種包括鯽、鯉、斑馬魚、人、非洲爪蟾Xenopus laevis、小鼠Mus musculus、斜帶石斑魚Epinephelus coioides、青鳉Oryzias latipes、大西洋鮭Salmo salar、草魚Ctenopharyngodon idella、鱖Siniperca chuatsi。結(jié)果如圖4 所示，所有脊椎動物的Lep 基因聚為3 支，其中一支為人和四足動物的Lep 基因，硬骨魚類Lepa、Lepb 則分別聚為一支，硬骨魚類Lepa 和Lepb的分化出現(xiàn)在硬骨魚類與四足動物分化之后。如圖4 所示，鯉鯽Lepa1、Lepa2 與其他硬骨魚的Lepa 聚集成一支，鯉鯽Lepb1、Lepb2 則與其他硬骨魚的Lepb 聚類。

2.5 Lep 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

大多數(shù)硬骨魚的Lep 基因在結(jié)構(gòu)上十分保守的，本研究所獲得鯽、鯉Lep 基因的六個亞型均只有長度相似的兩個外顯子。不同的是，鯽Lepa 兩亞型的內(nèi)含子長度要明顯的短于鯽Lepb 及鯉Lepb亞型。

圖5 鯽與人Lep 三級結(jié)構(gòu)Fig.5 Tertiary structure of crucian carp and human Lep

三級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，四個亞型的Lep 三級結(jié)構(gòu)都非常保守，且與人Lep 相似，都具有四個反向平行的α-螺旋，形成獨(dú)特的四螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)還含有一個由兩個半胖氨酸形成的二硫鍵，用以連接α-螺旋的羧基末端（圖5）。這些研究結(jié)果與Murashita 等的結(jié)論相一致，雖然基因亞型間一級結(jié)構(gòu)差異很大，但三級結(jié)構(gòu)高度保守，提示這種結(jié)構(gòu)可能對Leptin 行使生物學(xué)功能起關(guān)鍵作用[6]。

3 討論

1994 年，Zhang 等人首次利用圖位克隆技術(shù)得到了小鼠的瘦素基因（Lep），直到2005 年Kurokawa等從紅鰭東方鲀Takifugu rubripes 中才首次克隆得到變溫動物的Lep 基因[1,2]。隨著分子生物技術(shù)的成熟和脊椎動物基因組學(xué)研究的快速發(fā)展。近十幾年間，數(shù)十種魚類包括青鳉Oryzias latipes、石斑魚Epinephelus coioides、鯉、斑馬魚、大馬哈魚Oncorhynchus keta、虹鱒Oncorhynchus mykiss、團(tuán)頭魴Megalobrama amblycephala、草魚Ctenopharyngodon idella、北極鮭Salvelinus alpinus、大西洋鮭Salmo salar、鱸Morone saxatilis、黃顙魚Pelteobagrus fulvidraco、尼羅羅非魚Oreochromis niloticus、翹嘴鱖Siniperca chuatsi 等及一些兩棲動物的Lep 基因被先后獲取[3,6,7-18]。有趣的是，很長一段時(shí)間里，鳥類和爬行類被認(rèn)為缺失Lep 基因，但是近些年的研究表明，鳥類和爬行類同樣存在Lep 基因[19]。本研究的Lep 氨基酸同源性比較結(jié)果表明，除近緣類群的Lep 基因DNA 和氨基酸序列相似性較高外，脊椎動物的Lep 基因一級結(jié)構(gòu)并不保守。例如紅鰭東方鲀的Lep 基因與哺乳動物人、小鼠的Lep 基因的相似性僅為17.5%，這可能是以小鼠或人的Lep 為參照基因獲取魚類等其他脊椎動物L(fēng)ep 相當(dāng)困難的原因。

現(xiàn)已在斑馬魚、青鳉、石斑魚、草魚、鯉及翹嘴鱖、虹鱒等真骨魚類中均得到Lepa 與Lepb 兩種不同的基因亞型[3,5,8,12,20,21]。本研究中脊椎動物L(fēng)ep 基因可以聚為3 支，其中真骨魚類具有兩支，分別對應(yīng)于Lepa 和Lepb，其余脊椎動物聚為一支。這一結(jié)果支持真骨魚類的共同祖先相較其他脊椎動物多經(jīng)歷了一輪基因組加倍。真骨魚類因而有兩拷貝的Lep 基因，而其他的脊椎動物則只有一份拷貝[22]。大量的研究表明：虹鱒等鮭科魚類、鯉鯽等鯉亞科魚類是古四倍體魚類，本研究克隆得到鯉鯽Lep 基因預(yù)期的全部四種亞型，符合這一推斷[23]。有學(xué)者也克隆到鮭科加倍Lep 基因，進(jìn)化分析表明：鮭科和鯉亞科魚類的基因組加倍是獨(dú)立事件，但是，鯉鯽等鯉亞科魚類應(yīng)該共享共同的四倍體祖先。

與哺乳動物相比，魚類中Lep 基因的功能研究仍處于初級階段?，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，魚類Lep具有調(diào)節(jié)能量代謝、控制食物攝入、促進(jìn)脂肪降解、調(diào)節(jié)食欲、調(diào)控繁殖發(fā)育以及影響衰老等生物學(xué)功能[16,24-29]。本研究成功分離獲得鯽Lep 基因的四個亞型CaLepa1、CaLepa2、CaLepb1 和CaLepb2，進(jìn)一步證實(shí)鯉也具有四個Lep 基因亞型，為后續(xù)深入研究鯉鯽等魚類Lep 基因不同亞型的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。