韋如萍 胡德活 晏 姝 鄭會全 王潤輝 曾 宏

( 廣東省森林培育與保護利用重點實驗室/廣東省林業(yè)科學研究院，廣東 廣州 510520)

杉木（Cunninghamia lanceolata）是我國特有的傳統(tǒng)優(yōu)勢造林樹種，也是南方商品林基地建設的當家樹種，在我國木材工業(yè)、木材戰(zhàn)略儲備以及生態(tài)建設中具有舉足輕重的重要地位[1]。生產實踐中，杉木無性繁育的方式主要包括扦插或組織培養(yǎng)。由于扦插育苗過程中尚存在土地資源消耗大、繁殖系數低、生產季節(jié)受限制等問題，使得具有高度集約化特性的組織培養(yǎng)技術在杉木無性繁育過程中得到快速發(fā)展[2-5]。組培苗的生根率和移栽成活率是實現工廠化育苗的關鍵影響因子[6]。目前，杉木組培苗生根方式多以瓶內生根為主，芽苗在生根期間需要在培養(yǎng)室內人工控制的環(huán)境下生長，容易導致苗木根系含水量過高、芽苗木質化程度低、整體十分嬌弱，不利于苗木的移栽成活。同時，瓶內生根方式還具有育苗工序復雜、育苗周期長以及育苗成本高等問題[2-3]。因此，如何經濟有效地提高組培苗生根率、移栽成活率以及苗木品質已成為亟待解決的關鍵問題。組培苗瓶外生根是近些年得到成功應用的苗木繁育新技術[4-9]。它是組培苗瓶內快速增殖技術與瓶外扦插技術的有機結合，也是組培苗生根和馴化過程的有效重疊，可以達到提高生產效率、降低生產成本和縮短育苗周期的多重目標[4-10]。近些年，組培苗瓶外生根技術已在多種花卉、農作物、造林樹種中得到應用[4-9,11-15]。但在杉木組培苗瓶外生根方面，僅見何振革等[4]報道了以杉木種子園混系材料培養(yǎng)的組培無根繼代苗移栽技術，以及高小坤[5]以杉木優(yōu)良品種為材料經生根培養(yǎng)基誘導后進行的瓶外移栽，并側重于生根促進劑和基質種類的篩選。而以杉木無性系為材料，分析植物生長調節(jié)劑和基質類型對瓶外生根組培苗綜合質量的影響研究較少。為此，本研究以廣東省林業(yè)科學研究院選育和繁育的杉木優(yōu)良無性系組培繼代無根芽苗為材料，從生根情況、根系形態(tài)、生物量累積等角度出發(fā)，探討植物生長調節(jié)劑和基質種類及其處理方式對瓶外生根組培苗綜合質量的影響，以期為實現低成本高品質的杉木無性系工廠化育苗技術提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗地位于廣東省林業(yè)科學研究院（113°22′E，23°11′N）。屬于亞熱帶季風氣候，年平均氣溫20.4～21.9 ℃，年平均日照時數為1 820～1 960 h，年平均降雨量約1 800 mm，平均相對濕度77%。以廣東省林業(yè)科學研究院選育的杉木“TL5”號無性系為材料，利用“TL5”號無性系植株基部萌芽為組織培養(yǎng)外植體獲得無菌組培苗。選擇繼代培養(yǎng)30 d的無根芽苗在塑料大棚內進行封蓋煉苗，光源為自然散射光，溫度為25～30 ℃。封蓋煉苗15 d后，打開瓶蓋煉苗，開蓋后及時注入清水，水面高出培養(yǎng)基表面1 cm左右。開蓋煉苗1 d后，選擇長度超過3 cm、生長健壯、葉色濃綠的芽苗作為瓶外生根的材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物生長調節(jié)劑篩選試驗

試驗在塑料大棚中進行。采用正交設計L9（34）試驗（表1），試驗因子包括植物生長調節(jié)劑種類（A），即IBA、NAA、ABT1#，植物生長調節(jié)劑濃度（B），即100、200、400 mg/L和浸泡時間（C），即0.5、1.0、1.5 h，不考慮因素間的交互作用。2017年10月初，以經過煉苗處理的繼代無根芽苗為材料進行瓶外移栽。移栽前，根據試驗設置用不同植物生長調節(jié)劑組合對芽苗基部進行浸泡處理，然后移栽入帶有蓋子的育苗盒中。育苗盒長×寬×高為187 mm×145 mm×110 mm，育苗穴深5.5 cm，每盒12穴。育苗基質由40%泥炭土、20%珍珠巖和40%蛭石組成；移栽前一天，用0.2%高錳酸鉀溶液淋透育苗基質進行滅菌消毒。每穴種植1株苗木，每個處理設置3個重復，每個重復3個育苗盒，即36株苗。

表1 L9（34）正交試驗設計方案Table 1 Test schedule for orthogonal design of L9（34）

1.2.2 基質篩選試驗

采用大田育苗方式。育苗基質包括泥炭土、珍珠巖、紅心土、蛭石，采用單形重心混料實驗設計{4,3}，對4種育苗基質進行不同比例配比組合（表2），以紅心土為對照基質（ck）。芽苗移栽前2 d，用0.2%高錳酸鉀溶液淋透育苗基質進行滅菌消毒，覆蓋薄膜備用。育苗袋長×寬為13 cm×9 cm。2017年12月初，選擇已經過煉苗的繼代無根芽苗，用清水洗凈基部殘留的培養(yǎng)基后再用100 mg/L IBA溶液浸泡芽苗基部1 h，然后扦插到試驗設置的不同基質中（表2）。試驗采用隨機區(qū)組設計，每個處理3次重復，每個重復30株芽苗。芽苗移栽后即刻淋透水，并搭建小拱棚，覆蓋薄膜。移栽后2周內，控制苗床濕度在80%～90%，溫度25～30 ℃。移栽2周后，控制苗床濕度在70%左右。移栽1個月后，如果氣溫維持在20 ℃以下時，則繼續(xù)加蓋塑料薄膜，否則除去塑料薄膜。移栽1個半月后，用MS大量元素20倍液進行葉面噴施，此后隔1個月噴施1次，連續(xù)噴施3次。此后的管護措施參照常規(guī)育苗方法進行，各處理間保持一致。

表2 不同育苗基質的成分及體積比Table 2 Types and volume ratio of media

1.3 數據采集

在芽苗移栽2個月后，調查苗木生根率，存活的苗木即統(tǒng)計為已生根的苗木。此外，對于植物生長調節(jié)劑篩選試驗，還從各處理中隨機選取3株苗木統(tǒng)計根數量。對于基質篩選試驗，則在移栽6個月和12個月時，分別從各處理中隨機選取3株苗木進行生長測定，指標包括苗高、地徑、干物質質量以及根系形態(tài)。測定根系形態(tài)參數時，需要截取苗木的完整根系，清洗干凈后利用Expression 11000XL（EPSON）進行根系掃描，再運用萬深LA-S植物根系分析系統(tǒng)獲取根體積、根表面積、根長、根直徑等參數。測定苗木干物質質量時，新鮮樣品需經105 ℃殺青30 min，然后再經70 ℃烘干至恒質量后稱量。

1.4 數據分析

試驗數據使用Excel 2010和SAS V8軟件進行統(tǒng)計分析。多重比較采用Duncan法，苗木生根率經反正弦轉換后再進行分析。苗木質量綜合評價采用隸屬函數法，計算公式如下[16]：

式中：χi為苗木某個性狀指標測定值，χmax與χmin分別為該性狀指標的最大值與最小值，當該性狀與苗木質量呈正相關時使用隸屬函數公式（1），當該性狀與苗木質量呈負相關時使用反隸屬函數公式（2）；為苗木n個性狀隸屬函數值的平均值。

2 結果與分析

2.1 不同植物生長調節(jié)劑對組培芽苗瓶外生根的影響

由正交試驗極差分析結果可知（表3），各因素對生根率和根數量的影響主次順序為植物生長調節(jié)劑濃度（B）＞植物生長調節(jié)劑種類（A）＞浸泡時間（C），表明植物生長調節(jié)劑濃度是對生根率和根數量影響最大的因素，其次是植物生長調節(jié)劑種類，浸泡時間的影響相對較小。各因素不同水平的平均值比較結果顯示，用100 mg/L IBA溶液浸泡芽苗基部1 h的處理方式將能獲得最優(yōu)的生根率和根數量。對正交試驗篩選出的因素優(yōu)組合進行驗證試驗，即用100 mg/L IBA溶液浸泡1 h的方式處理杉木無性系組培繼代芽苗然后進行瓶外生根，結果表明，平均生根率為89.56%，每株苗木的平均根數量為4.26條，說明試驗結果可靠。

表3 植物生長調節(jié)劑對杉木無性系組培芽苗瓶外生根的影響Table 3 Effect of exogenous hormone on rooting of ex vitro subculture plantlet buds of C. lanceolate clones

2.2 不同基質對組培芽苗瓶外生根率和苗木生長的影響

由圖1a可知，移栽2個月后，不同基質配方中，移栽生根率存在顯著差異，其中12號配方的移栽生根率最高，為89.82%，比對照提高71.64%；其次是7、13、14號配方，苗木生根率為66.03%～79.91%，而2、3、6、8、11號配方生根率較低，僅為23.48%～39.21%，明顯低于對照。苗高、地徑和干物質質量3個生長指標在不同配方間存在差異，但在不同的移栽時間里，這種差異有所不同。在移栽6個月后，以5、10、11、12、13號配方苗木總體生長較好，苗高為12.93～14.57 cm。移栽12個月后，則以14號配方苗木總體表現最好，1、7號配方次之，3個配方的苗高分別為29.77、20.97、23.80 cm，分別比對照提高 81.19%、27.63%、44.86%；而 2、3、8號配方苗高生長較差，其余配方與對照差異不顯著。

圖1 不同基質配方對瓶外生根率及苗木生長的影響Fig. 1 Effect of media type on ex vitro rooting rate and growth of subculture plantlet

2.3 不同基質對瓶外生根組培苗根系形態(tài)的影響

苗木根系形態(tài)參數在不同基質配方中存在較大差異，而且在不同移栽時間里，根系形態(tài)的變化模式不同（圖2）。在移栽6個月時，苗木根系形態(tài)參數只在少數配方間存在顯著差異，其中2號和5號配方的苗木根系總體表現較好；移栽12個月后，根系形態(tài)參數在多數配方間差異明顯，總體上以1、4、7、12、14號配方中苗木根系生長較好。又以7號和14號配方最好，其總根長分別比對照提高29.41%、28.31%，總根表面積分別提高11.37%、29.16%，總根體積分別提高44.97%、97.17%；根系總體生長較差的配方為2、3、6、8號，4個根系形態(tài)參數均明顯低于對照，其余配方與對照差異不明顯。

圖1 不同基質配方對瓶外生根組培苗根系形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of media type on root morphological parameters of ex vitro rooting subculture plantlet

2.4 瓶外生根組培苗質量綜合評價

利用不同基質中杉木無性系瓶外生根組培苗的生長性狀、根系形態(tài)參數等8個性狀指標的標準化數據做主成分分析（表6）。前3個主成分累積貢獻率為91.38%，已能夠反映所有指標的絕大多數信息。第1主成分的貢獻率較大（70.91%），對應較大特征向量的評價指標為總根長、總根表面積、總根體積、苗高、地徑和總干物質質量，可統(tǒng)稱為苗木生長因子；第2主成分對應較大特征向量的評價指標為生根率，可稱為苗木存活因子；第3主成分對應較大特征向量的評價指標為平均根直徑，可稱為根系形態(tài)因子。由此可知，總根長、總根表面積、總根體積以及平均根直徑等根系形態(tài)參數是評價杉木無性系瓶外生根組培苗質量的重要形態(tài)指標，同時苗高、地徑、干物質累積量以及苗木生根率等也是不容忽視的質量指標。

表6 主成分載荷矩陣Table 6 Principal component loading matrix

依據主成分分析結果可知，8個苗木性狀指標均與杉木無性系瓶外生根組培苗的質量有密切關系。因此，取所有性狀指標隸屬函數值R（χi）的平均值（）作為不同基質配方苗木綜合質量的評價指標，平均值越大，表示苗木綜合質量越好（表7）。由表7可知，有10個配方的值優(yōu)于對照，排前5名的依次是14、7、1、12、4號配方，這些配方中均含有泥炭土、蛭石，同時均不添加或少量添加珍珠巖和紅心土，苗木綜合質量較好。值較低的配方為3、2、6、8號，這些配方中均沒有添加蛭石，而且配方中珍珠巖或紅心土的添加量較大，體積占比為0.40～0.80，苗木綜合質量相對較差。進一步分析發(fā)現，紅心土和珍珠巖體積占比均為0.27的11號配方，以及珍珠巖或紅心土體積占比為0.40的5號和10號配方，其值也較低。

表7 瓶外生根組培苗性狀指標隸屬函數值Table 7 Membership function values of traits indexes of ex vitro rooting subculture plantlet

3 結論與討論

培養(yǎng)基中細胞分裂素和生長素的比例對植物材料的器官再生途徑起著關鍵的調控作用[13]。適宜濃度的生長素可以誘導芽的萌發(fā)和不定根的形成[12-14]。對不同植物的生根機理研究表明，在不定根發(fā)生過程中，有許多參與生長素合成、運輸、信號傳導等過程的基因表達量明顯增強，暗示它們可能參與調控了不定根的發(fā)生[13]。植物生長調節(jié)劑NAA、IBA以及ABT生根促進劑都屬于生長素類似物。對多個樹種的研究表明，植物生長調節(jié)劑處理對組培材料瓶外生根過程中不定根的發(fā)生起到明顯促進作用，但不同樹種或同一樹種的不同品系對不同植物生長調節(jié)劑的敏感性存在差異。對黑木相思（Acacia melanoxylon）組培繼代芽苗瓶外生根研究表明，以50 mg/L ABT溶液浸泡25 min的處理方式生根效果最好[14]。澳洲茶樹（Melaleuca alternifolia）組培繼代芽則以0.4 mg/L ABT溶液浸泡30～50 min后再蘸取相同濃度ABT溶液與滑石粉的混合勻漿后移栽生根率最高[6]。馬大雜種相思（Acacia mangium×A. auriculiformis）組培繼代芽用100 mg/L IBA溶液浸泡1 h后移栽生根率為94.67%[12]。而“歐美楊107”（Populus×euramericanacv. Neva） 用 100 mg/L IBA溶液蘸取后扦插可獲得81.67%的瓶外生根率[15]。本研究表明，杉木“TL5”號無性系組培繼代芽在100 mg/L IBA溶液中浸泡1 h后移栽可獲得最佳的瓶外生根率和根數量，但這與何振革等[4]采用種子園混系材料以及高小坤[5]采用杉木優(yōu)良品種培育的組培繼代芽苗瓶外生根結果存在差異，這可能與試驗材料和試驗方法不同有關。

育苗基質為植物根原基的萌動和根系的生長發(fā)育提供了必要環(huán)境。基質的成分和配比方式不同，其養(yǎng)分含量、物理和化學性質存在較大差異，對組培繼代芽苗瓶外生根率、根系和苗木質量有較大影響[17-20]。優(yōu)良的移栽基質具有良好的透氣性、保濕性、營養(yǎng)性、酸堿性、易得性以及經濟性等特點[7-8]，能夠滿足芽苗基部切口進行呼吸作用時對氧氣、水分及養(yǎng)分的需求[21]，并能顯著促進移栽芽苗的生長和根系形態(tài)的建成[3-10]。但不同植物種類對移栽基質的適應性不同。陳海霞等[8]研究指出，八仙花（Hydrangea macrophylla）組培無根芽苗在珍珠巖基質中生根差，但在混合基質（珍珠巖∶蛭石∶草炭土體積比為1∶1∶2）中根系和地上部分生長良好。肖玉菲等[6]對澳洲茶樹（Melaleuca alternifolia）組培無根芽苗的移栽結果則顯示，芽苗在紅心土中生根效果最好，在河沙和輕基質中生根效果較差。本研究顯示，杉木無性系組培繼代芽苗瓶外生根時，以含有泥炭土、蛭石以及不含或含少量（體積占比為0.27）珍珠巖和紅心土的14、7、1、12、4號配方苗木綜合質量較好，其中7號配方的生根率和苗木質量均較好，可作為瓶外生根的重點參考基質。而沒有添加蛭石，或者珍珠巖、紅心土所占比例超過40%的2、3、6、8號配方以及純紅心土基質的苗木綜合質量較差。表明基質中含有較多珍珠巖或紅心土時不利于杉木無性系組培繼代芽苗瓶外生根。這可能與珍珠巖質地輕、pH值高、養(yǎng)分少等特性有關[22]，而紅心土質地粘重、透水性差，當紅心土所占比例過高時，在移栽初期高濕度環(huán)境下可能使基質通氣性和透水性變差，進而影響芽苗生根和生長。此外，本研究還發(fā)現，泥炭土對杉木無性系繼代芽苗瓶外生根有利，但添加的比例應適當。在苗木移栽成活率較高且苗木質量較好的7、12、13號配方中，泥炭土的體積占比為0.46～0.60，而泥炭土占比為1.0的1號配方，雖然苗木綜合質量較好但移栽生根率僅為54.59%，暗示泥炭土所占比例過高時，可能導致基質中無機鹽濃度過大，不利于芽苗的根萌動，但泥炭土較低的pH值加上良好的保溫、保肥效果，可有效促進秋末冬初時期幼苗的生長。蛭石具有保肥、保水、透氣等多重作用，對改善基質結構、緩沖pH值的快速變化等有良好促進作用[6,8,11]，可與泥炭土一起作為杉木無性系組培繼代芽苗瓶外生根的主要移栽基質進行合理使用。值得注意的是，本研究結果與何振革等[4]、高小坤[5]的結果有差異，這可能是試驗材料、移栽季節(jié)、管護措施等不同所致。在今后的研究中將對材料類型、扦插季節(jié)、管護措施等因素進行更為深入系統(tǒng)的研究。

組培芽苗瓶外生根過程還受到外界環(huán)境的影響。其中溫度和濕度是兩個關鍵因素，對組培芽苗瓶外生根率和成活率影響較大[9,22]。王利民等[23]研究指出，只有在平均氣溫20～25 ℃，基質溫度15～20 ℃條件下，火鶴（Anthurium scherzrianum）和紅寶石（Philodendron enbesoeus）組培苗的根系才恢復快速生長。對草莓（Fragaria×ananassa）的研究結果也表明，光照、溫度、濕度都會對組培芽苗瓶外生根產生影響，在芽苗移栽初期，相對濕度需要保持在95%以上，適宜溫度為18～22 ℃，并以較強的散射光為光源才利于芽苗生根[9]。本研究小組總結多次移栽過程后發(fā)現，在11月至翌年2月期間，廣州市白天氣溫多為15～25 ℃，天氣涼爽，在此期間進行杉木無性系組培繼代芽苗瓶外生根效果較好。而在其他季節(jié)，尤其是夏季高溫高濕季節(jié)進行芽苗瓶外生根時，芽苗容易失水萎蔫，或者根部綿軟腐爛，難以保持芽苗活力。但瓶外生根的生根率總體還是低于瓶內生根，可能是因為所處環(huán)境復雜、多個因素不易控制所致。今后還應對芽苗瓶外生根所需的最適溫度、濕度、光照等環(huán)境條件進行更詳盡的研究。

苗木質量是苗木自身遺傳特性和對環(huán)境適應性的綜合體現。在不同生長期，苗木質量評價結果可能不同。本研究表明，過早開展杉木無性系瓶外生根組培苗質量評價可能會產生偏差，而在苗木出圃時間段內開展苗木質量評價結果更可靠。組培繼代芽苗的瓶外生根過程，是對芽苗生根和煉苗馴化過程的有效結合。該技術不僅節(jié)省了一次瓶內生根培養(yǎng)所需的無菌操作過程，還能利用瓶內培養(yǎng)過程中已被污染的芽苗為材料，只需經過簡單的滅菌處理即可進行移栽，而且不影響芽苗生根率和后期生長。由此表明，采用杉木無性系組培繼代芽苗瓶外生根育苗，可以有效簡化技術流程、縮短育苗周期、縮減育苗成本，在杉木無性系產業(yè)化擴繁中有良好應用前景。