高 莉，張志霞，卿人韋，馬 力

(四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610064)

由化石燃料的過度消耗而引起的溫室效應(yīng)等環(huán)境問題，促進了可再生能源——生物燃料的發(fā)展.微藻生物柴油作為一種非常有潛力代替化石能源的新型燃料[1-2]，因其具有綠色環(huán)保等優(yōu)勢，成為現(xiàn)在研究的熱點.

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)是一種生長快、油脂含量高的海洋模式硅藻[3]，且其全基因組測序[4]已經(jīng)完成，這為通過基因工程的方法改造構(gòu)建富油的轉(zhuǎn)基因微藻提供了理論依據(jù).

甘油激酶(glycerol kinase，GK)是生物體內(nèi)進行甘油攝取和代謝的關(guān)鍵酶，同時也是限速酶[5-6].GK可以催化甘油轉(zhuǎn)化為甘油-3-磷酸(G3P).自從Lin[7]首次分離并確定了GK 的主要結(jié)構(gòu)后，GK 基因的研究受到越來越多的關(guān)注.Muto 等[8]在Fistulifera solaris 中過表達(dá)了GK 基因，導(dǎo)致生物量提高，G3P 水平升高，脂質(zhì)積累量增加.同樣，Yu 等[9]也提出，在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中GUT1(編碼GK 基因)基因的過表達(dá)可以促使G3P 積累增加，最后導(dǎo)致脂質(zhì)含量增多.因此，GK 對脂質(zhì)的生物合成與調(diào)控具有重要作用[10].三角褐指藻中GK 的表達(dá)量和酶活與三角褐指藻利用甘油的速度密切相關(guān)[3].

中性油脂主要包括?；视王?TAGs)和游離脂肪酸，而微藻的中性脂質(zhì)(主要是TAGs)是能量的主要來源，現(xiàn)在通常用于生物柴油的生產(chǎn).金藻昆布多糖是硅藻細(xì)胞中主要的儲存性碳水化合物[11]，它能為細(xì)胞代謝循環(huán)提供能量，能轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌袡C化合物.細(xì)胞也可以通過對金藻昆布多糖含量的調(diào)控而調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，以提高對逆境的抵抗.

本研究以甘油激酶基因過表達(dá)藻株、干擾藻株和野生型藻株為對象，測定了轉(zhuǎn)基因藻株的生長情況、甘油激酶基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平、甘油激酶活性、脂質(zhì)含量和金藻昆布多糖含量的變化，探索過表達(dá)/干擾甘油激酶基因?qū)θ呛种冈迳L代謝的影響，旨在為通過基因工程的手段獲得產(chǎn)油率高的轉(zhuǎn)基因藻株提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

藻種：三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)來自于中國海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫，編號為MACC/B288.

載體：干擾載體PtrGKRNAi-pPhaT1、過表達(dá)載體PtrGKOE-pPhaT1，均為本實驗室構(gòu)建.其中過表達(dá)載體主要包含fcpA 啟動子、GK 基因的開放閱讀框ORF、fcpA 終止子、fcpB 啟動子、博來霉素抗性基因sh ble、硝酸還原酶終止子；干擾載體主要包含fcpA啟動子、GK 基因約430 bp 堿基正向序列、內(nèi)含子、GK 基因約430 bp 堿基反向序列、fcpA 終止子、fcpB啟動子、博來霉素抗性基因sh ble、硝酸還原酶終止子.

試劑：PCR 相關(guān)試劑，TaKaRa 公司；基因槍轉(zhuǎn)化材料，Bio-Rad 公司；RNA 抽提試劑盒，成都百菲特生物公司；其他試劑均購自成都科隆公司.

f/2 液體培養(yǎng)基：于100 mL 超純水中，添加f/2培養(yǎng)基母液各100μL，3 g 海鹽(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%)，高壓滅菌，冷卻至室溫后添加100μL 維生素母液，即為f/2 液體培養(yǎng)基.

f/2 固體培養(yǎng)基：于300 mL 超純水中，加入瓊脂粉4.8 g、海鹽9 g、f/2 培養(yǎng)基母液各300μL，高壓滅菌，冷卻至室溫后添加300μL 維生素母液，分到每個板中，凝固后封口，4 ℃保存.

1.2 方法

1.2.1 三角褐指藻的遺傳轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)基因藻株鑒定

分別將干擾載體PtrGKRNAi-pPhaT1 和過表達(dá)載體 PtrGKOE-pPhaT1 轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)DH5α中，陽性克隆進行菌液PCR 驗證和測序驗證，然后擴大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，使其濃度均達(dá)到1μg/μL.將野生型三角褐指藻接種至滅菌的f/2 液體培養(yǎng)基中，置于溫度為22 ℃、光照度為2 500 lx、光/暗周期為12 h/12 h 條件下培養(yǎng)；取指數(shù)生長期細(xì)胞約5×107個，涂布于f/2 固體培養(yǎng)基的平板中央，用PDS-1000/He System 型基因槍(Bio-Rad 公司)進行遺傳轉(zhuǎn)化，選擇壓力參數(shù)為1 350 psi(9 308.25 kPa).將轟擊過的平板正置光照度為1 500 lx 的條件下連續(xù)光照培養(yǎng)24 h，然后用f/2 培養(yǎng)液洗脫下來，均勻涂布于含有100μg/mL Zeocin 的f/2 固體培養(yǎng)基平板中，倒置光照培養(yǎng)(2 500 lx，22 ℃).約4 周后，挑取單克隆于f/2 液體培養(yǎng)基(含100μg/mL Zeocin)中，并擴大培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)基因藻株的基因組DNA，并通過PCR 鑒定，測序驗證.

過表達(dá)藻株鑒定引物為 GKOE-F：5′-TTGAC TGCAAGATCAGCTGGCCTAG-3′，GKOE-R：5′-GG CAGATTTCCGGCAATGCCGAAAG-3′.干擾藻株鑒定 引 物 為 GKRNAi-F：5′-GCGTCGACCGTGTGT GGGATCAGACTTTGGTTAAC-3′，GKRNAi-R：5′-AGGGTACTTTCTTAATCTGAAG CT-3′.

1.2.2 生長曲線繪制及生物量測定

將指數(shù)生長期的甘油激酶基因過表達(dá)藻株、干擾藻株和野生型藻株接種至100 mL f/2 液體培養(yǎng)基中，其中轉(zhuǎn)基因藻株的培養(yǎng)基中添加100μg/mL Zeocin，起始接種濃度為2×105mL-1，光照度為2 500 lx，光/暗周期為12 h/12 h.每隔24 h 取樣檢測450 nm 處的吸光度，并用血球計數(shù)板計數(shù)，繪制生長曲線，按照式(1)計算比生長速率(μ)，并比較轉(zhuǎn)基因藻株與野生型藻株的比生長速率.

式中：N0為初始的細(xì)胞A450；Nt為第t 天的細(xì)胞A450；t 為培養(yǎng)時間，d.

1.2.3 甘油激酶轉(zhuǎn)錄水平的測定

提取指數(shù)生長期藻株RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用CFX ConnectTM型實時熒光定量PCR 儀(Bio-Rad 公司)，以18S 基因為內(nèi)參基因[12]，檢測不同藻株之間甘油激酶基因的表達(dá)情況.

1.2.4 甘油激酶活性的測定

為研究甘油激酶的活性是否受甘油激酶基因轉(zhuǎn)錄水平的影響，本實驗根據(jù)經(jīng)典的Trinder 方法[13](偶聯(lián)終點比色法)改進后對甘油激酶的活性進行了檢測.其原理[3]是在溫度為22 ℃、pH 為9.5 的條件下，甘油激酶可以催化甘油，反應(yīng)生成3-磷酸甘油；3-磷酸甘油被3-磷酸甘油氧化酶氧化生成H2O2和二羥基丙酮；H2O2、4-氨基安替比林和苯酚在過氧化物酶的催化下生成粉紅色醌亞胺類化合物，該物質(zhì)在545 nm 處具有較高的吸收峰，并且在一定濃度范圍內(nèi)隨甘油激酶的濃度和活力的增加而增加.

酶活力單位(U)的定義是：每分鐘催化生成1 mmol/L H2O2所需要的酶量定義為一個酶活力單位.酶活性(U/mL)按照式(2)計算.

式中：ΔA545為樣品在545 nm 處反應(yīng)前后吸光度的變化量；t 為反應(yīng)時間，單位為 min；Vt為總體積，240μL；Vs為樣品體積，20μL；df 為樣品稀釋倍數(shù)；13.3 是指在測定條件下醌亞胺類化合物的毫摩爾消光系數(shù)；0.5 是指1 mol H2O2可以生成0.5 mol 醌亞胺類化合物；1.0 為比色皿直徑.

1.2.5 尼羅紅染色測定中性油脂含量

分別收集指數(shù)生長期的過表達(dá)藻株、干擾藻株和野生型藻株細(xì)胞各 2×106個，4 000 r/min 離心10 min，PBS 清洗藻細(xì)胞，重復(fù)3 次；然后用300μL PBS 懸浮，加入 0.1 mg/mL 尼羅紅溶液(丙酮溶解)10μL，混勻，42 ℃暗處反應(yīng)10 min；用Varioskan Flash 型全波長酶標(biāo)儀(美國Thermo 公司)在530 nm下激發(fā)，發(fā)射波長為575 nm，檢測相對熒光強度[14].

1.2.6 金藻昆布多糖含量的測定

金藻昆布多糖的提取[15]：收集指數(shù)生長期的藻液1 mL，4 000 r/min 離心10 min，收集細(xì)胞；加入4 mL 0.05 mol/L 的H2SO4溶液，迅速渦旋混勻；然后于60 ℃水浴反應(yīng)10 min，并間斷混勻；離心收集上清液，沉淀中再次加入4 mL 0.05 mol/L 的H2SO4溶液；重復(fù)提取2 次合并上清液，即為粗提取液.

采用蒽酮比色法[16]測定金藻昆布多糖的含量：取1 mL 粗提取液，然后加入5 mL 蒽酮試劑，充分混勻，于沸水中煮沸10 min，取出冷卻至室溫后，檢測620 nm 處的吸光度.以620 nm 處吸光度為橫坐標(biāo)(x)，葡萄糖含量(μg/mL)為縱坐標(biāo)(y)，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(y＝122.7 x＋0.886 8，R2＝0.998)，并按照式(3)計算樣品的金藻昆布多糖含量(μg/mL).

式中：ρ 為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得的糖含量，μg/mL；3為粗提取液的稀釋倍數(shù)；V0為粗提取液總體積，mL；V1為測定用藻液體積，1 mL.

1.3 統(tǒng)計分析

本試驗數(shù)據(jù)均用GraphPad 軟件處理分析.本實驗中將野生型藻株(WT)組設(shè)置為對照組，其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01.

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因藻株的鑒定

轉(zhuǎn)基因三角褐指藻的PCR 鑒定結(jié)果如圖1 所示.為驗證目的基因/載體是否已經(jīng)成功整合到三角褐指藻的基因組中，通過克隆表達(dá)載體上的片段，采用pPhaT1 載體靠近插入片段5′端的引物和插入GK基因片段中的引物進行PCR 驗證.甘油激酶基因過表達(dá)藻株GKOE1-8 和GKOE7-1 均有一條1 000 bp左右條帶，與過表達(dá)載體的結(jié)果一致，則可說明過表達(dá)結(jié)構(gòu)已經(jīng)存在于轉(zhuǎn)基因藻株中.

圖1 轉(zhuǎn)基因三角褐指藻的鑒定Fig.1 Identification of transgenic Phaeodactylum tricornutum

干擾藻株GKRNAi3-1 和GKRNAi4-1 均有一條500 bp 左右的條帶，與干擾載體的結(jié)果一致，說明干擾載體已經(jīng)存在于轉(zhuǎn)基因藻株中，所以遺傳轉(zhuǎn)化成功，目的片段已經(jīng)整合進入三角褐指藻基因組中.

2.2 轉(zhuǎn)基因藻株生長情況分析

對三角褐指藻細(xì)胞密度與A450之間進行線性回歸分析(圖2)，得到兩者之間的線性關(guān)系式為y＝150.6 x-2.781，R2＝0.998，P＜0.01，回歸模型有意義.這說明三角褐指藻的細(xì)胞密度與藻液在A450之間呈顯著的線性相關(guān)，可以利用藻液在450 nm 處的吸光度表示三角褐指藻的生長情況.

圖2 細(xì)胞密度與A450 之間線性關(guān)系Fig.2 Linear relationship between cell concentration and A450

三角褐指藻生長曲線如圖3 所示.由圖3 可以看出，甘油激酶基因過表達(dá)藻株和干擾藻株的指數(shù)生長期與對照組(WT)一致，均為5 d.通過對比生長速率的比較(圖4)，可以看出轉(zhuǎn)基因藻株的比生長速率與野生型藻株無顯著差異，說明甘油激酶基因的過表達(dá)與干擾操作對藻株的生長情況無明顯影響.

圖3 三角褐指藻生長曲線Fig.3 Growth curves of Phaeodactylum tricornutum

圖4 三角褐指藻的比生長速率Fig.4 Comparison of specific growth rates of Phaeodactylum tricornutum

2.3 三角褐指藻甘油激酶基因轉(zhuǎn)錄水平分析

三角褐指藻甘油激酶基因相對表達(dá)量分析結(jié)果如圖5 所示.結(jié)果以GK 與18S 的比值呈現(xiàn)，對照組(WT)作為參照定為1.

圖5 三角褐指藻甘油激酶基因相對表達(dá)量分析Fig.5 Relative quantification of GK transcripts in Phaeodactylum tricornutum

由圖 5 可以看出，過表達(dá)藻株 GKOE1-8、GKOE7-1 的轉(zhuǎn)錄水平均較野生型藻株極顯著(P＜0.01)上調(diào)，分別是對照組的7.90 倍和3.19 倍，說明過表達(dá)GK 基因時，可以增強該基因的轉(zhuǎn)錄水平.而甘油激酶干擾藻株GKRNAi3-1、GKRNAi4-1 的轉(zhuǎn)錄水平均較野生型藻株顯著(P＜0.05)下調(diào)，GKRNAi3-1 的轉(zhuǎn)錄水平是對照組的 1/2，下調(diào)了 53.34%；GKRNAi4-1 的轉(zhuǎn)錄水平是對照組的 3/5，下調(diào)了42.52%，說明干擾GK 基因時，其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào).

2.4 甘油激酶活性分析

轉(zhuǎn)基因三角褐指藻甘油激酶活性分析結(jié)果如圖6 所示.過表達(dá)藻株的酶活均高于野生型藻株的酶活，干擾藻株則均低于野生型藻株.其中過表達(dá)藻株GKOE1-8、GKOE7-1 的酶活分別是野生型藻株的5.55 倍和4.58 倍；干擾藻株GKRNAi3-1 的酶活比野生型降低了52.34%，GKRNAi4-1 比野生型降低了6.64%.結(jié)合圖4 與圖5 分析，可以發(fā)現(xiàn)甘油激酶的活性隨著該基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)而增加，下調(diào)而降低.

圖6 三角褐指藻甘油激酶活性分析Fig.6 GK activity of Phaeodactylum tricornutum

2.5 中性油脂含量分析

中性油脂包括?；视王?TAGs)和游離脂肪酸，是生物柴油生產(chǎn)的主要來源.中性油脂是由GK的催化產(chǎn)物G3P 通過Kennedy 途徑產(chǎn)生.三角褐指藻尼羅紅染色后的相對熒光強度(圖7)可以間接反映中性油脂的積累量.其中以野生型藻株的熒光值為對照組(WT)，并將其設(shè)置為1，過表達(dá)藻株的中性油脂含量顯著的增加，GKOE1-8 和GKOE7-1 的相對熒光強度分別為1.649 5 和1.184 9，較對照組增加了64.95%和 18.49%.干擾藻株 GKRNAi3-1 和GKRNAi4-1 的相對熒光強度分別為 0.731 2 和0.830 2，較對照組減少了26.88%和16.98%.這些結(jié)果表明過表達(dá)甘油激酶基因，可以促進三角褐指藻細(xì)胞內(nèi)的中性油脂積累，說明甘油激酶基因在脂質(zhì)代謝中對脂質(zhì)的積累調(diào)控起促進作用.

2.6 金藻昆布多糖含量分析

金藻昆布多糖作為三角褐指藻細(xì)胞內(nèi)碳的主要存在形式，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓，穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu).三角褐指藻的金藻昆布多糖含量分析結(jié)果見圖8.

圖7 尼羅紅染色的中性油脂的相對熒光強度Fig.7 Relative fluorescence intensity of Nile red dyed Phaeodactylum tricornutum

圖8 三角褐指藻金藻昆布多糖含量分析Fig.8 Chrysolaminaran content of Phaeodactylum tricornutum

將野生型組設(shè)置為對照組，過表達(dá)藻株的金藻昆布多糖含量較野生型藻株顯著增加，GKOE1-8 和GKOE7-1 的金藻昆布多糖分別 25.28μg/mL 和23.81μg/mL，分別較對照組增加了 50.89%和42.11%.干擾藻株的金藻昆布多糖含量則降低，GKRNAi3-1 和GKRNAi4-1 的金藻昆布多糖分別為14.08μg/mL 和14.98μg/mL，分別較對照組減少了16.99%和10.62%.這說明過表達(dá)甘油激酶基因可以促進細(xì)胞內(nèi)儲存性多糖金藻昆布多糖的積累，而干擾甘油激酶基因的表達(dá)則抑制金藻昆布多糖的積累，所以甘油激酶基因可能對金藻昆布多糖的積累調(diào)控起促進作用.

3 結(jié) 論

通過對三角褐指藻理化性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因藻株的比生長速率與野生型藻株無顯著差異，說明甘油激酶基因不是三角褐指藻生長的限制因素.過表達(dá)藻株的GK 基因轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，GK 酶活升高，中性油脂和金藻昆布多糖含量增加，說明過表達(dá)GK 基因可以增強甘油激酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)G3P的積累；G3P 被G3P ?；D(zhuǎn)移酶?；扇苎字?LPA)；再通過LPA ?；D(zhuǎn)移酶將其?；纬闪字?PA)；然后PA 被PA 磷酸水解酶去磷酸化，釋放甘油二酯；最后甘油二酯被?；a(chǎn)生甘油三酯(TAGs)，從而導(dǎo)致TAGs 含量增加.因此，三角褐指藻中，甘油激酶基因?qū)χ|(zhì)代謝起促進作用，可通過調(diào)控該基因的表達(dá)而調(diào)控油脂含量，這為通過基因工程的手段獲得產(chǎn)油率高的微藻提供了參考.