劉 蕊，董玉飛，劉乃新，吳玉梅

(1.黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院，哈爾濱 150080; 2.東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，哈爾濱 150080;3.青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院/青海省農(nóng)林科學(xué)院 土壤肥料研究所，西寧 810016;4.黑龍江大學(xué)生命學(xué)院，哈爾濱 150080)

1 引 言

甜菜(Beta vulgaris L.)是溫帶地區(qū)重要的蔗糖作物，約占全球制糖產(chǎn)量的25%[1-2]。它也是生物燃料[3], 天然色素，食用植物和動物飼料的重要來源。近年來，作為觀賞植物的甜菜在園林配置中得到越來越多的應(yīng)用。它屬于石竹目莧科，石竹目由11510種植物組成，包括仙人掌、冰植物、其他耐旱物種[4]。到目前為止，除了甜菜以外，沒有其他的石竹目植物被測序。它是一個具有18條染色體的二倍體物種，估計基因組大小為714-758 MB[4-5]。

目前，我國每年通過鑒定/認證6～10個甜菜品種，生產(chǎn)用甜菜品種多為國外雜交品種。品種登記是基于獨特性、一致性和穩(wěn)定性(DUS)的研究[6]。傳統(tǒng)的基于表型特征的甜菜品種鑒別方法存在諸多局限性。例如，需要調(diào)查的性狀太多；評價周期太長，許多表型性狀容易受到環(huán)境因素的影響；由于遺傳基礎(chǔ)狹窄，品種在外觀上非常相似[7-8]。因此，通過對形態(tài)特征的目視檢查來評估不同的甜菜品種并不容易[6]。目前通過分子標記方法是確定不同的甜菜品種的最佳方式。

植物分子標記技術(shù)在植物學(xué)研究中得到了廣泛的應(yīng)用[9]。微衛(wèi)星，或簡單序列重復(fù)(SSRs)，是在原核生物和真核生物基因組中普遍存在的1-6個核苷酸的短而重復(fù)的DNA序列[10-12]。 SSR標記廣泛用于基因連鎖圖譜的構(gòu)建[13-15],評價基因多樣性[16-17], 標記輔助育種[18-19],群體基因分析[19-21], 及進化研究[22]。 它具有許多優(yōu)勢，如共顯性、豐富和隨機分布在基因組內(nèi)、可生產(chǎn)和高度多態(tài)性[23-24]。此外，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的基因組序列已經(jīng)發(fā)表，我們只需要在包含這些序列信息的數(shù)據(jù)庫中檢索SSR兩側(cè)的保守核苷酸序列，然后根據(jù)這些保守序列設(shè)計引物[25]。該方法具有操作簡單、經(jīng)濟、可操作性強、覆蓋率高等特點，已成為SSR引物研制的主要途徑[26]。

本研究分析了甜菜基因組中SSR基因的分布，開發(fā)了SSR引物，為甜菜本身或相關(guān)物種的遺傳分析提供了有價值的標記。

2 材料和方法

2.1 基因組SSR位點的搜索

甜菜參考基因組序列以fasta格式從NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)下載。利用Perl語言環(huán)境下的misa軟件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/)搜索全基因組ssr位點。搜索參數(shù)設(shè)置如下：所搜索的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸的最小重復(fù)次數(shù)分別為6、5、5、5和5次。兩個SSR序列之間的最小間隔值為100 bp。

2.2 電子PCR引物設(shè)計

電子聚合酶鏈反應(yīng)(E-PCR)是通過計算來搜索基因組序列中的SSR位點，每一個位點都由一對引物序列和預(yù)期的PCR產(chǎn)物大小決定[27]。采用電子PCR軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/epcr/)設(shè)計甜菜基因組中模擬的PCR引物，并采用Perl腳本統(tǒng)計產(chǎn)品編號。

2.3 基因功能注釋

使用Agrigo(http://bioinfo.cau.edu.cn/agrigo/)執(zhí)行包含SSR位點的GO(基因本體)注釋，遵循系統(tǒng)默認設(shè)置。

3 結(jié)果

3.1 甜菜SSR基因座的豐度和相對豐度

從整個基因組水平上分析，甜菜基因組中共計174218個SSR 位點，其中二核苷酸至六核苷酸重復(fù)基序的豐度即重復(fù)基序的數(shù)量分別為35496個(占 SSR 位點總數(shù)的20.37%)、55396個(31.80%)、3482 個(2.00%)、58043個(33.32%)和 21801個(12.51%)，SSR 位點相對豐度即SSR位點平均發(fā)生率為 463個/Mb，二核苷酸至六核苷酸重復(fù)基序的相對豐度分別為94.26，147.10，9.25，154.13，57.89。逐條染色體分析可知，二核苷酸至六核苷酸重復(fù)基序在染色體水上豐度的平均值分別為 3944.00,6155.11,386.89,6449.22,2422.33，最大、最小者分別為 6號(29180)和 3號染色體(13468)；二核苷酸至六核苷酸重復(fù)基序的在染色體水平上的相對豐度平均值分別為94.26,147.11,9.25,154.14,57.90，SSR 位點相對豐度最大及最小者分別為3號(506.74)和 2號染色(395.61)。二核苷酸至六核苷酸重復(fù)基序豐度最大者均為6號染色體，具體數(shù)值依次為6733，9045，604，9217，3581；三核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重讀豐度基序最小者均為3號染色體，數(shù)量分別為552、4078、4925、1551個，二核苷酸重復(fù)豐度基序最小為二號染色體425個，四核苷酸豐度基序最小為三號和四號染色體，均為277個。

表1 甜菜基因組SSR的類型，數(shù)量及分布頻率Tabl.1 Type, number, distribution frequency and abundance of SSR in Sugar beet

SSR豐度/相對豐度(每Mb總重復(fù)數(shù))。

3.2 甜菜SSR類型和頻率特征

從SSR的基序來看，甜菜基因組共包含1,596種重復(fù)基元。二至六核苷酸重復(fù)分別有8，30，89和290種。每種基序的分布并不平均。二核苷中(TA/TA)n和(AT/AT)n占的比率最高，分別占二核苷酸類型基序總數(shù)的40.59% 和33.65%。三核苷酸中，(AAT/ATT)n，(TAA/TTA)n和(ATA/TAT)n為最多，分別占了 22.51% , 18.01%和16.50%。 四核苷酸基序分布則較為均勻，分布做多的為(ATAA/TTAT)n和(AAAT/ATTT)n，分別占了7.94%和6.91%(圖1)。

圖1 全基因組中top15 SSR motif的數(shù)目Fig.1 Number of the top15 SSR motif within whole genome

3.3 SSR引物的電子PCR(e-pcr)

本研究從NCBI收集到322對已知引物(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe)，在染色體密度為1.2對/MB，且在染色體上分布并不均勻(圖3)。為了增加SSR引物在染色體上密度，我們針對新預(yù)測的SSR位點開發(fā)27,649對引物。并通過電子PCR檢驗引物的準確性。電子PCR結(jié)果顯示，多數(shù)引物(n=18,271)可以在甜菜基因組特異性擴增。甜菜基因組中能夠產(chǎn)生0、1、2、3和大于3個產(chǎn)物的SSR引物數(shù)目分別為0 (0.0%)、18271 (66.1%)、2387 (8.6%)、1033(3.7%)和5958(21.6%)對。平均每對SSR引物能夠產(chǎn)生18個電子PCR產(chǎn)物，這是由于SSR所在區(qū)域為高度重復(fù)序列。另外，有24027(86.9%)對引物產(chǎn)生了不多于10個的擴增產(chǎn)物(圖2)。

圖2 不同規(guī)模的e-PCR產(chǎn)物的平均數(shù)量Fig.2 Average number of in e-PCR products based on different scales

SSR引物中利用價值較高的是那些在基因組中的位置已知且產(chǎn)物特異的引物。甜菜基因組上設(shè)計出的27649對引物中，挑選出特異性引物18271對引物定位在甜菜基因組上，平均每Mb序列有48.52對引物。9條染色體中Chr3上引物的密度最高，為55.76對每Mb，其次是Chr4和Chr2，分別為每Mb序列50.78對和49.09對；密度最低的是Chr9上，為45.83對引物每Mb(表2，圖3)，與NCBI數(shù)據(jù)庫登入的SSR引物相比較，本研究將甜菜SSR分子標記在染色體的密度提高了37倍。

紅色：下載自NCBI引物；綠色：本研究新開發(fā)的引物圖3 引物在9條染色體上的分布Fig.3 Distribution of primer across nine chromosome

染色體編號Chromosome No.染色體長度(Mb)Chromosome length (Mb)標記數(shù)量Marker number標記密度Marker densityChr134.941,67247.85Chr240.391,98349.09Chr326.581,48255.76Chr433.021,67750.78Chr552.462,51747.98Chr660.962,96648.65Chr744.152,05546.54Chr838.801,84447.53Chr945.272,07545.83

3.4 基因SSR的鑒定和注釋

為了闡明開發(fā)的SSR標記所在基因的潛在功能。我們將SSR motif位置與蛋白質(zhì)編碼基因的位置進行了比較。發(fā)現(xiàn)有5,169(28.29%)引物位于蛋白質(zhì)編碼基因內(nèi)，對應(yīng)5,137個蛋白質(zhì)編碼。通過對這些基因進行GO (Gene Ontology)功能注釋分析，我們發(fā)現(xiàn)這些基因主要涉及了cellular process ，metabolic process以及response to stimulus,表明所開發(fā)的標記可能與功能基因位點連鎖。

圖4 含SSR蛋白編碼基因的功能注釋Fig.4 Functional annotation of protein-coding genes containing SSR

4 討論

4.1 甜菜全基因組SSR的分布

甜菜中相鄰兩個SSR位點的平均距離為2.21 kb，即463 SSR/Mb。在以前的研究中，擬南芥相鄰SSR位點之間的平均距離為1.4 kb[28],水稻是 3.6 kb[29], 在木荷中為1.54 kb[30]。這種差異可能是由于SSR搜索標準、數(shù)據(jù)庫大小和物種[31]、以及含有微衛(wèi)星的基因的表達豐度[32]。不同物種之間SSR主要重復(fù)類型有所差異，很多植物的SSR主要以二核苷酸、三核苷酸重復(fù)單元類型為主[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，甜菜基因組SSR重復(fù)基元類型主要以五核苷酸為主，占全部 SSR的 33.32%，其次是三核苷酸，占全部SSR的31.80%。甜菜基因組中存在大量長重復(fù)基序，表明其在生物進化與分類地位中處于相對較低的進化水平[34-35]。

本研究發(fā)現(xiàn)二核苷酸對四核苷酸堿基有一定的偏好。甜菜基因組中的二核苷酸重復(fù)基序大部分是TA/TA重復(fù)基序(40.59%)，這與前人的研究相似[36-37]。相反，由于保持熱力學(xué)穩(wěn)定性的必要性，CG重復(fù)次數(shù)顯著減少[38]。相反CG的含量很少,可能是由于較少的GC是維持熱力學(xué)穩(wěn)定必須的因素。三核苷酸重復(fù)基序(AAT/ATT)n，(TAA/TTA)n和(ATA/TAT)n為最多，分別占了 22.51% , 18.01%和16.50%。從以上分析得知，二核苷酸和三核苷酸重復(fù)基序均富含A和T，這與 Tóth 等對多種真核生物基因組 SSR 位點的研究結(jié)果相一致，可能是由于甲基化的 C 殘基轉(zhuǎn)變?yōu)?T 所致[39]。另一個原因是破壞a/t堿基對之間氫鍵的能量低于G/C堿基對之間的氫鍵，并且A/T比G/C波動更容易[40]。

4.2 甜菜全基因組SSR多態(tài)性潛力分析

迄今為止，甜菜中可用的分子標記物很少。本研究共鑒定出174218個SSR位點，頻率高，類型豐富。在新設(shè)計的27,649對引物中，18271對(66.08%)可特異性擴增。所制備的每一個SSR引物的平均電子PCR產(chǎn)物為18個，表明甜菜基因組中存在大量的SSR，具有較高的PCR效率、多態(tài)性和較好的實用性。在下一步中，我們應(yīng)該鑒定出擴增產(chǎn)物穩(wěn)定、條帶清晰、多態(tài)性高的SSR引物，這些引物對于豐富甜菜品種、加快遺傳資源利用、建立甜菜種質(zhì)評價和改良體系、重要性狀的基因挖掘和遺傳多樣性分析具有重要價值。

4.3 SSR與生物過程的關(guān)系

基因本體(GO)旨在定義已知基因在分子、細胞和有機體水平上的功能[41]。Go數(shù)據(jù)庫包括三個相對獨立的本體，分別描述cellular component, molecular function 和biological process[42-43]。本研究中，含SSR的蛋白質(zhì)編碼基因參與了甜菜的細胞過程、代謝過程、生物調(diào)控、對刺激的反應(yīng)和生物進程的調(diào)控等生物學(xué)過程。本研究為進一步研究甜菜生長發(fā)育過程中表達的重要基因以及甜菜基因的克隆和功能分析提供了標志性依據(jù)。