謝 青，胡巧云，鄭 瓊，林子俺*

(1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學院 藥學系，福建 福州 350002；2.福州大學 化學學院 食品安全與生物分析教育部重點實驗室，福建 福州 350116)

蛋白質(zhì)磷酸化是生物體內(nèi)最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一。研究表明，蛋白質(zhì)磷酸化的異常表達與癌癥、白血病等疾病密切相關(guān)[1]。因此，研究蛋白質(zhì)磷酸化對于一些重大疾病的早期診斷極為重要。由于磷酸化蛋白在生物樣品中豐度較低且易受到高豐度非磷酸化蛋白的干擾，以現(xiàn)有的技術(shù)手段難以對磷酸化蛋白進行直接檢測，因此亟待發(fā)展一種高效的磷酸化蛋白富集方法。目前，磷酸化蛋白的富集方法主要有固定離子親和色譜、金屬氧化物親和色譜、親水色譜、親和免疫法等[2-6]。固定金屬離子親和色譜(IMAC)[7-11]因其強特異性而備受科研工作者的青睞。相比于傳統(tǒng)的鎵、鋁、鐵等三價離子，鈦離子(Ti4+)、鋯離子(Zr4+)具有更多的磷酸化蛋白結(jié)合位點，已被廣泛應(yīng)用于磷酸化蛋白的分離富集。

點擊化學(Click chemistry)由Sharpless于2001年首次提出[12]，具有效率高、副反應(yīng)少、分離提純簡單、環(huán)境污染小等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于表面修飾、生物大分子、DNAs、生物與化學傳感器等領(lǐng)域[13-15]?！皫€-烯”反應(yīng)作為點擊化學中的一種，具有無需金屬催化、簡便高效、便捷可控、后處理方便且對水、氧不敏感等優(yōu)點，逐漸成為化合物改性和聚合物固化反應(yīng)的有效途徑[16-18]。 “一鍋法”(“one-pot”)[19-20]是一種簡便的有機合成方法，可同時進行多步反應(yīng)而無需將產(chǎn)物分離，在經(jīng)濟上和環(huán)境上較為友好，應(yīng)用廣泛。將“一鍋法”引入磷酸化蛋白分離富集材料制備，可極大地簡化合成過程?；凇皫€-烯”點擊反應(yīng)的磷酸化蛋白分離富集材料的“一鍋法”制備，目前尚未見報道。

基于此，本文結(jié)合簡便高效的“巰-烯”點擊反應(yīng)與“一鍋法”，制備了一種固載Ti4+的納米二氧化硅復(fù)合材料(SiO2-Ti4+)，在金屬離子親和色譜的基礎(chǔ)上，將其應(yīng)用于磷酸化蛋白的選擇性分離富集。該親和材料在最優(yōu)條件下對α-酪蛋白具有良好的富集效果，并成功應(yīng)用于牛奶實際樣品中磷酸化蛋白的分離富集，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450紫外可見分光光度計(日本Shimadzu公司)，Tecnai G20透射電子顯微鏡(荷蘭FEI公司)，ESCALAB250 X射線光電子能譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，Nicolet 6700傅立葉紅外光譜儀(美國Nicolet公司)，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)儀(美國Bio-Rad公司)。

四乙氧基硅烷(TEOS)、γ-巰丙基三甲氧基硅烷(γ-MPTS)、硫酸鈦、辣根過氧化物酶(HRP，Mw44 kDa，pI 7.2)、乙烯基膦酸(VPA)、α-酪蛋白(α-Casein，Mw22～25 kDa，pI 4.2～4.7)、β-酪蛋白(β-Casein，Mw24 kDa，pI 4.6～5.1)、雞蛋卵清白蛋白(OVA，Mw44.3 kDa，pI 4.6)、牛血清白蛋白(BSA，Mw66 kDa，pI 4.9)、轉(zhuǎn)鐵白蛋白(Trf，Mw80 kDa，pI 5.5)均購自Sigma公司。其余試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾純制水。

1.2 SiO2-Ti4+納米復(fù)合材料的制備

采用St?ber法制備二氧化硅納米粒子：首先將40 mL無水乙醇、1.28 mL濃氨水和1.6 mL二次水加入到三頸燒瓶內(nèi)混合均勻，磁力攪拌條件下加入2.4 mL TEOS和0.3 mLγ-MPTS，30 ℃水浴條件下反應(yīng)24 h。

利用“巰-烯”點擊反應(yīng)，將磷酸基修飾到硅球表面，步驟如下：向反應(yīng)完全的硅球溶液中依次加入20 mL水、100 μL VPA和質(zhì)量分數(shù)為1%的偶氮二異丁腈(AIBN)，氮吹20 min后，于75 ℃水浴條件下反應(yīng)12 h。反應(yīng)結(jié)束后，將所得納米二氧化硅復(fù)合材料離心并用二次水清洗若干次，60 ℃下真空干燥6 h。

合成SiO2-Ti4+材料：稱取50 mg納米二氧化硅復(fù)合材料溶于15 mL Ti(SO4)2水溶液(0.1 mol/L)中，反應(yīng)1 h，使磷酸根與Ti4+反應(yīng)完全。將固定上Ti4+的納米復(fù)合材料離心，并用二次水洗滌若干次，60 ℃真空干燥備用。

1.3 SiO2-Ti4+納米復(fù)合材料吸附性能考察

分別測定SiO2-Ti4+材料對不同濃度磷酸化蛋白與非磷酸化蛋白的吸附量，作等溫吸附曲線：平行稱取36份SiO2-Ti4+材料0.5 mg置于2 mL離心管中，分別加入500 μL質(zhì)量濃度為0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60 mg/mL的α-casein、β-casein、OVA、HRP、Trf、BSA溶液(蛋白溶液均用含0.2 mol/L NaCl的3-(N-嗎啉)丙磺酸(MOPS,0.01 mol/L，pH 6.0)緩沖溶液配制)，超聲使其均勻分散，室溫下吸附2 h。離心后，在波長280 nm和403 nm處測定上清液的吸光度。進行3次平行實驗，取平均值。

考察SiO2-Ti4+材料對不同蛋白在不同時間段的吸附量Q，制作吸附動力學曲線：分別稱取0.5 mg SiO2-Ti4+材料各42份，加入0.5 mg/mL的α-casein、β-casein、OVA、HRP、Trf、BSA溶液(蛋白溶液制備方法同上)各500 μL，室溫下超聲振蕩，按間隔時間段(3、15、30、45、60、90、120 min)離心取上清液，測其在280 nm和403 nm波長處的吸光度值，計算出不同蛋白在不同時間段的吸附量Q，以吸附量Q對吸附時間t作圖。

以糖蛋白HRP作為競爭蛋白進行競爭吸附實驗：稱取0.5 mg SiO2-Ti4+材料于離心管中，取質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的β-casein和0.5 mg/mL的HRP混合溶液(體積比1∶1)500 μL。室溫下超聲分散并孵育2 h后，離心取上清液，用紫外-可見分光光度計在波長280 nm和403 nm處測其吸光度值，根據(jù)溶液吸附前后蛋白質(zhì)濃度的變化，利用吸光度加合法計算吸附前后蛋白質(zhì)的濃度，得出SiO2-Ti4+材料對兩種競爭蛋白的吸附量。

1.4 樣品制備與SDS-PAGE凝膠電泳實驗

模擬蛋白質(zhì)混合樣的制備：配制β-casein(0.5 mg/mL)和 HRP(0.2 mg/mL)的混合液(體積比1∶1)5 mL，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

實際樣品制備：定量移取100 μL伊利牛奶于10 mL離心管中，用含0.2 mol/L NaCl的MOPS(0.01 mol/L，pH 6.0)緩沖溶液稀釋60倍，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

準確稱取SiO2-Ti4+材料1.0 mg和2.0 mg，分別加入500 μL的模擬蛋白質(zhì)混合樣、稀釋60倍的牛奶樣品，室溫下超聲振蕩2 h并離心，取其上清液，待SDS-PAGE凝膠電泳分析。另外，依次采用50%乙腈、1%三氟乙酸、二次水洗滌兩次，去除非特異性吸附的蛋白，然后用10%的氨水100 μL洗脫SiO2-Ti4+材料特異性吸附的磷酸化蛋白，離心并取其上清液，待SDS-PAGE凝膠電泳分析。

實驗采用5%濃縮膠與12%分離膠進行SDS-PAGE凝膠電泳實驗，上樣量均為10 μL，以考馬斯亮藍R250染色液對凝膠進行染色，使用乙醇-乙酸-水溶液(V乙醇∶V乙酸∶V水=1∶1∶8)進行脫色。

2 結(jié)果與討論

2.1 SiO2-Ti4+材料的表征

分別采用透射電鏡、紅外光譜(FT-IR)和X 射線電子能譜(XPS)對所合成的SiO2-Ti4+復(fù)合材料進行表征。如圖1所示，硅球呈現(xiàn)規(guī)整的球形結(jié)構(gòu)，粒徑均一，分散性好，用nano meaturer軟件統(tǒng)計得到的粒徑約為66 nm。

從紅外譜圖(圖2A)可以判斷，1 098、798 cm-1處為Si—O—Si的振動吸收峰，2 925 cm-1處為—CH2的伸縮振動峰。1 161 cm-1處出現(xiàn)的吸收峰為P—O的伸縮振動峰，該峰屬于乙烯基膦酸的特征吸收峰，表明乙烯基膦酸已成功地鍵合到SiO2納米粒子表面。XPS譜圖(圖2B)表明所合成材料中含有 C、O、Si和Ti 元素。P2p在133 eV處的峰較弱，可能是因為XPS測得的只是SiO2-Ti4+材料表面的元素含量。Ti和P的峰證明Ti4+成功固載于納米復(fù)合硅球的表面。

圖3 pH值對SiO2-Ti4+材料吸附性能的影響Fig.3 Effect of pH value on adsorption properties of SiO2-Ti4+ nanocomposites

2.2 SiO2-Ti4+材料的吸附性能

實驗考察了SiO2-Ti4+材料在不同pH值條件下對蛋白的吸附效果。從圖3可以看出，該材料在pH 6.0的緩沖溶液條件下對磷酸化蛋白具有最高的吸附量，且不同pH值下SiO2-Ti4+材料對β-casein的吸附量均明顯高于HRP和BSA，說明材料表面的Ti4+對磷酸化蛋白中的磷酸基團有很強的親和力。將0.5 mg SiO2-Ti4+材料加入到500 μL 含0.2 mol/L NaCl的MOPS(0.01 mol/L，pH 6.0)緩沖溶液中，再加入一系列不同濃度的蛋白質(zhì)溶液，孵育2 h。從吸附等溫線(圖4A)可以看出，復(fù)合材料對磷酸化蛋白(α-casein、β-casein和OVA)的吸附量隨著蛋白質(zhì)量濃度的增大而增大，當?shù)鞍踪|(zhì)量濃度達0.5 mg/mL時，吸附基本趨于平衡。計算可得α-casein，β-casein和OVA的最大吸附量分別為12.27、10.13、5.47 μmol/g。而在同等條件下，該材料對非磷酸化蛋白(Trf，HRP和BSA)的吸附量變化不大，在蛋白質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL時，吸附已基本達到飽和，此時Trf、HRP和BSA的吸附量分別為1.60、1.12、1.46 μmol/g。以上數(shù)據(jù)說明SiO2-Ti4+材料對磷酸化蛋白進行了選擇性的富集且吸附量較大。通過吸附動力學曲線考察了SiO2-Ti4+材料對蛋白的吸附速率。從圖4B可知，SiO2-Ti4+對蛋白均具有較快的吸附速率，但由于Ti4+與磷酸化蛋白的親和作用需一定的時間，因此在30 min左右才基本達到飽和吸附。而對于非磷酸化蛋白，主要依靠的是納米復(fù)合材料與蛋白的非特異吸附作用，因此呈現(xiàn)擴散性吸附，吸附速率快且吸附量隨時間的變化不明顯。

圖4 SiO2-Ti4+材料對蛋白的吸附等溫線(A)及吸附動力學曲線(B)Fig.4 Adsorption isotherms of protein by SiO2-Ti4+ nanocomposites(A) and kinetics of protein adsorption onto SiO2-Ti4+ nanocomposites(B)

為了驗證SiO2-Ti4+材料在混合溶液中對磷酸化蛋白的特異性識別性能，本實驗選擇HRP作為競爭蛋白，取1.0 mg SiO2-Ti4+材料及0.5 mg/mL蛋白質(zhì)溶液加入到1 mL含0.2 mol/L NaCl的MOPS(0.01mol/L，pH 6.0)緩沖溶液中，孵育1 h，結(jié)果如圖5A所示。從圖中可以看出，SiO2-Ti4+材料對β-casein的吸附量明顯大于HRP，說明該材料在競爭蛋白存在的條件下，仍對磷酸化蛋白具有很好的吸附效果和識別性能。

納米復(fù)合材料的重復(fù)利用也是材料性能的一個重要指標，穩(wěn)定性好的材料可以多次使用，降低成本。將SiO2-Ti4+材料經(jīng)吸附1 h、10%的氨水洗脫、重吸附，如此循環(huán)使用后，檢測其對β-casein的吸附效果，進行3次平行實驗，取平均值。由圖5B可知，經(jīng)過6個循環(huán)后，吸附量有所降低，主要的原因可能是，在實驗過程中經(jīng)離心和洗脫后，材料表面的Ti4+有輕微脫落，且在離心過程中存在著難以避免的材料損失。但總體上，材料的穩(wěn)定性良好，可重復(fù)利用。

2.3 SiO2-Ti4+材料對樣品中磷酸化蛋白的富集

通過SDS-PAGE凝膠電泳考察材料在混合溶液中對磷酸化蛋白的選擇性分離效果，采用5%濃縮膠與12%分離膠，結(jié)果如圖6A所示。

可以看出，條帶2為吸附之前的混合樣(α-casein+HRP)，條帶3為SiO2-Ti4+材料吸附后的上清液。對比可知，α-casein幾乎被SiO2-Ti4+材料完全吸附，而HRP則很少被吸附。條帶4為SiO2-Ti4+材料上洗脫下來的蛋白電泳譜圖，在通過50%乙腈和1%三氟乙酸洗脫非特異吸附的蛋白后，僅出現(xiàn)了α-casein電泳條帶，而未出現(xiàn)HRP蛋白的條帶，表明SiO2-Ti4+材料能從混合樣中選擇性地分離富集α-casein。將制得的SiO2-Ti4+材料應(yīng)用于牛奶實際樣品的分析(圖6B)，條帶2為稀釋60倍的牛奶電泳譜圖，蛋白分子量從大到小依次出現(xiàn)了α-酪蛋白(α-casein)、β-酪蛋白(β-casein)、β-乳球蛋白(β-Lg)和α-乳白蛋白(α-La)，條帶3為經(jīng)SiO2-Ti4+材料吸附后的上清液，與條帶2相比，條帶3上磷酸化蛋白α-casein和β-casein的電泳條帶基本消失，其他區(qū)域的非磷酸化蛋白無顯著變化。證實了SiO2-Ti4+材料可以選擇性地分離富集牛奶樣品中的磷酸化蛋白。條帶 4為SiO2-Ti4+材料洗脫后的電泳譜圖。與條帶 2相比，條帶4中有磷酸化蛋白α-casein和β-casein的電泳條帶，而未出現(xiàn)非磷酸化β-Lg和α-La。上述實驗結(jié)果充分表明，本實驗方法制得的SiO2-Ti4+材料對磷酸化蛋白具有良好的選擇性識別作用，可以用于復(fù)雜樣品中磷酸化蛋白的選擇性分離和富集。

3 結(jié) 論

本文結(jié)合“巰-烯”點擊反應(yīng)和“一鍋法”，成功制備了SiO2-Ti4+納米復(fù)合材料，并用于選擇性分離富集磷酸化蛋白。該材料制備過程簡單方便，條件溫和。實驗結(jié)果表明該材料具有較好的形貌特征，粒徑均一，分散性好，并且對磷酸化蛋白具有良好的吸附效果。將該材料應(yīng)用于復(fù)雜實際樣品中磷酸化蛋白的選擇性分離富集，也獲得了令人滿意的結(jié)果。該材料有望在蛋白質(zhì)組學領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用。