譚華東，趙淑巧，武春媛*

(1.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部儋州農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，海南 儋州 571737；3.海南省熱帶生態(tài)循環(huán)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101)

滅蠅胺(Cyromazine，Cyr)，又名環(huán)丙氨嗪，化學(xué)名為N-環(huán)丙基-1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一種三嗪類昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可誘導(dǎo)昆蟲形態(tài)發(fā)生畸變，主要用于葉菜類、菜豆類和瓜果類的美洲斑潛蠅、潛葉蠅防治。Cyr不易發(fā)生水解(pH為5～9)，可被光降解，但主要產(chǎn)物三聚氰胺被世界衛(wèi)生組織(WHO)列為2B類致癌物。在動(dòng)植物體內(nèi)，Cyr可經(jīng)脫烷基化轉(zhuǎn)化為三聚氰胺[1-2]。動(dòng)物毒理實(shí)驗(yàn)表明，Cyr及代謝產(chǎn)物的毒性具有明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系，會(huì)損害動(dòng)物健康，引起體重降低、肝腫大、血紅蛋白及血細(xì)胞數(shù)減少等問題，甚至導(dǎo)致動(dòng)物胎兒骨骼發(fā)育遲緩，存活率下降[3-4]。在果蔬種植中，Cyr的不規(guī)范、過量使用易使其殘留于果蔬中，進(jìn)而危及人體健康。因此，許多國(guó)家、國(guó)際組織制定了Cyr在農(nóng)產(chǎn)品中的最大殘留限量值(MRL)，其中我國(guó)規(guī)定Cyr在菜豆、黃瓜中的MRL分別為0.5、1.0 mg/kg，歐盟、美國(guó)和日本規(guī)定其在果蔬中的MRL為0.05～0.5 mg/kg[5-8]。

目前，Cyr的檢測(cè)方法有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-11]。但GC-MS法需進(jìn)行衍生化，檢測(cè)過程較繁瑣；HPLC、LC-MS/MS法易受基質(zhì)干擾，前處理操作要求高、費(fèi)時(shí)，需使用大型儀器，且溶劑用量大，易污染環(huán)境。因此，建立一種快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、選擇性好的Cyr檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

熒光量子點(diǎn)(QDs)因光學(xué)性質(zhì)優(yōu)異、檢測(cè)靈敏、簡(jiǎn)便，而在環(huán)境檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[12-15]。本研究基于Cyr在弱酸性條件下使CdSe/CdS量子點(diǎn)(CdSe/CdS QDs)發(fā)生熒光增強(qiáng)的特性[12,16-17]，以巰基乙酸(TGA)為穩(wěn)定劑制備CdSe/CdS QDs，以此建立了快速、靈敏檢測(cè)蔬菜中Cyr的新方法。該方法具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，實(shí)際檢測(cè)應(yīng)用中結(jié)果滿意。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

F-97 Pro熒光分光光度計(jì)(上海棱光技術(shù)有限公司)；JEM 1400EX透射電子顯微鏡(日本日立儀器公司)；UV-2600/Shimadzu UV-Vis分光光度計(jì)(日本島津儀器公司)；FiveEasy plus pH計(jì)(梅特勒-托利多(上海)有限公司)；Keezo KMS-181E加熱恒溫磁力攪拌器(精鑿科技(上海)有限公司)；JJ-2B組織搗碎勻漿機(jī)(上海諾頂儀器設(shè)備有限公司)；三口燒瓶回流裝置(四川蜀玻(集團(tuán))有限責(zé)任公司)。

甲醇(CH3OH)、醋酸(CH3COOH，HAc)、醋酸鈉(CH3COONa，NaAc)、亞硫酸鈉(Na2SO3)、硒粉(Se)、醋酸鎘(Cd(CH3COO)2·2H2O)、硫化鈉(Na2S·9H2O)、氫氧化鈉(NaOH)、巰基乙酸(C2H4O2S，TGA，>91%)購(gòu)于阿拉丁試劑公司。所用試劑為分析純及以上純度，均未經(jīng)純化直接使用；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水；所有實(shí)驗(yàn)均在室溫下完成。采用pH 5.6的HAc-NaAc緩沖溶液配制QDs溶液及Cyr標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 CdSe/CdS QDs的合成

CdSe/CdS QDs的合成基于文獻(xiàn)[18]所述方法并進(jìn)行調(diào)整。首先，向20 mL 1.2 mol/L Na2SO3水溶液中加入0.015 mol Se粉，磁力攪拌作用下，在水浴鍋中將溶液緩慢加熱至75 ℃，充分?jǐn)嚢柚脸庶S色、透明Na2SeSO3溶液；然后，將1 mL TGA加入200 mL含有0.022 5 mol Cd2+的Cd(CH3COO)2水溶液中，通過NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值至10～11，在N2保護(hù)下迅速加入上述Na2SeSO3溶液。將溶液緩慢加熱至100 ℃，并在N2保護(hù)下回流6 h以上，隨后自然冷卻至室溫，停止N2保護(hù)，得紅色溶膠。

攪拌該紅色溶膠，并緩慢加熱至40～50 ℃。同時(shí)，緩慢、交替地分5次加入0.05 mol/mL Na2S溶液和0.02 mol/mL Cd(CH3COO)2溶液(摩爾比CdS∶CdSe=4∶1)，在N2保護(hù)下回流6 h以上；再以7 500 r/min離心5 min，將沉淀分離后，即得橙紅色CdSe/CdS QDs。

1.3 樣品處理

采用組織攪碎機(jī)將新鮮蔬菜樣品攪碎，充分混勻，于-19 ℃冰柜中冷凍保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取25 g(精確至0.01 g)樣品，置于250 mL錐形瓶中，加入50 mL CH3OH，超聲10 min后用布氏漏斗過濾，用CH3OH洗滌燒杯和布氏漏斗，同時(shí)采用30 mL CH3OH提取濾紙，合并所有提取液至平底燒瓶中，減壓濃縮至50 mL后，以HAc-NaAc緩沖溶液調(diào)至pH 5.6左右，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用水定容至100 mL，于-4 ℃冷藏備用。

1.4 Cyr的檢測(cè)條件

取5.0 μL 0.1 mol/L CdSe/CdS QDs溶液置于10 mL比色管中，加入1 mL不同濃度的蔬菜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，以HAc-NaAc緩沖溶液定容，制得濃度為5.0～120 nmol/L的蔬菜基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。對(duì)于蔬菜樣品，測(cè)定時(shí)加入1 mL “1.3”的樣品溶液于10 mL 0.5 mmol/L CdSe/CdS QDs溶液中。在室溫條件下混勻反應(yīng)8.0 min，以優(yōu)化的波長(zhǎng)測(cè)定體系的熒光強(qiáng)度。測(cè)試條件為：激發(fā)狹縫寬度為20.0 nm，發(fā)射狹縫為10.0 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為481 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍為500～750 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 CdSe/CdS QDs的光譜特性

圖1為CdSe/CdS QDs的透射電鏡(TEM)、紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)和熒光光譜。由圖1a可觀察到CdSe/CdS QDs呈近似球形，且粒徑分布較均勻，平均粒徑約為3.0 nm。由圖1b可見，CdSe/CdS QDs 的UV-Vis吸收峰位于515 nm處，依據(jù)紫外吸收光譜經(jīng)驗(yàn)公式[19]：D=(9.812 7×10-7)λ3-(1.714 7×10-3)λ2+1.006 1λ-194.84(其中D為粒徑，λ為最大紫外吸收波長(zhǎng))，計(jì)算得CdSe/CdS QDs的粒徑為2.6 nm，與TEM表征結(jié)果較吻合。由圖1c可見，激發(fā)波長(zhǎng)為481 nm時(shí)，CdSe/CdS QDs的熒光峰位于580 nm，峰形尖銳、平滑且對(duì)稱，半峰寬較窄(約為40.0 nm)，表明CdSe/CdS QDs的發(fā)光性能好，表面平滑缺陷少，且分散均勻。

2.2 測(cè)定原理

在中性的HAc-NaAc緩沖溶液中，CdSe/CdS QDs表面的TGA小部分(為0.04%)以—OOH形式存在，大部分(99.96%)以—OO-形式存在，因此其表面的TGA帶有大量—OO-，QDs之間表面電荷產(chǎn)生的排斥作用使其能夠以穩(wěn)定的粒徑形態(tài)存在；而在弱酸性(pH 5.6)條件下，TGA因質(zhì)子化作用恢復(fù)成巰基基團(tuán)進(jìn)而破壞了Cd2+-TGA-QDs結(jié)構(gòu)，使得TGA從CdSe/CdS QDs表面脫落[20-21]。同時(shí)，CdSe/CdS QDs表面裸露增加，團(tuán)聚增多，導(dǎo)致CdSe/CdS QDs的熒光強(qiáng)度有所減弱。Wang等[22]研究表明，酸性條件下三聚氰胺可顯著增強(qiáng)CdS QDs的熒光強(qiáng)度，推測(cè)是由于三聚氰胺中的氨基可與CdS QDs表面的Cd存在配位作用，進(jìn)而占據(jù)TGA電離形成的空位，不利于CdS QDs團(tuán)聚所致。元曉云等[12]發(fā)現(xiàn)鏈霉素中的氨基也可以占據(jù)CdTe QDs上TGA脫落形成的空位，使得CdTe QDs分散，熒光顯著增強(qiáng)。Cyr的結(jié)構(gòu)中也具有氨基官能團(tuán)，使其可與CdSe/CdS QDs表面上的Cd發(fā)生配位作用，不利于CdSe/CdS QDs的團(tuán)聚，進(jìn)而能夠增強(qiáng)CdSe/CdS QDs的熒光強(qiáng)度。

2.3 CdSe/CdS QDs濃度的選擇

在體系pH 5.6條件下，考察了CdSe/CdS QDs濃度(0.01～10 mmol/L)對(duì)含50 nmol/L Cyr的蔬菜基質(zhì)匹配溶液熒光強(qiáng)度的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)CdSe/CdS QDs的濃度大于5.0 mmol/L時(shí)，溶液體系的熒光強(qiáng)度過強(qiáng)，若Cyr濃度較低(5.0～50 nmol/L)時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度變化較小，使得檢測(cè)靈敏度低；當(dāng)CdSe/CdS QDs的濃度低于0.05 mmol/L時(shí)，溶液體系的熒光強(qiáng)度較低，極少量的目標(biāo)物即可使溶液體系的熒光強(qiáng)度顯著變化，檢測(cè)靈敏度提高，但線性范圍變窄。而CdSe/CdS QDs的濃度在0.1～1.0 mmol/L范圍內(nèi)可獲得較好的靈敏度和線性范圍，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度為0.5 mmol/L時(shí)，可使線性范圍跨越2個(gè)數(shù)量級(jí)，檢出限亦達(dá)到最佳。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用0.5 mmol/L的CdSe/CdS QDs。

圖2 溶液體系pH值對(duì)Cyr增強(qiáng)CdSe/CdS QDs熒光強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of pH value in solution on fluorescence enhancement of CdSe/CdS QDs in the presence of Cyr concentration of CdSe/CdS QDs：0.5 mmol/L;concentration of Cyr：50 nmol/L;reaction time:8.0 min

2.4 pH值的影響

在CdSe/CdS QDs、Cyr的濃度分別為0.5 mmol/L、50 nmol/L條件下，考察了HAc-NaAc溶液體系pH值(3.6～8.0)對(duì)Cyr增強(qiáng)CdSe/CdS QDs熒光強(qiáng)度的影響。由圖2可知，當(dāng)體系pH≤5.0或者≥6.0時(shí)，熒光強(qiáng)度變化很??；在pH 5.2～5.6范圍時(shí)，Cyr的加入使得CdSe/CdS QDs的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，在pH 5.6時(shí)達(dá)到最大。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇pH 5.6的緩沖溶液。

2.5 反應(yīng)時(shí)間的影響

在上述優(yōu)化條件下，于1.0～28 min范圍內(nèi)每隔1.0 min測(cè)定1次溶液體系的熒光強(qiáng)度變化。結(jié)果表明，體系的熒光強(qiáng)度變化值在1.0～8.0 min內(nèi)逐漸增加，8.0 min達(dá)到最大，此后隨著時(shí)間的增加基本保持不變。因此，選擇最佳反應(yīng)時(shí)間為8.0 min。

2.6 共存物質(zhì)的影響

圖3 辣椒中CdSe/CdS QDs隨Cyr濃度變化的熒光光譜圖Fig.3 Fluorescence spectra of CdSe/CdS QDs varied with concentration of Cyr in pepperconcentration of Cyr(1-6):20,40,60,80,100,110 nmol/L;pH 5.6

2.7 線性范圍與檢出限

在優(yōu)化條件下，考察了不同蔬菜基質(zhì)中CdSe/CdS QDs熒光強(qiáng)度與Cyr濃度之間的關(guān)系(見表1)。結(jié)果表明，不同蔬菜基質(zhì)中Cyr的濃度(c)均在5.0～120 nmol/L范圍內(nèi)與CdSe/CdS QDs的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)(F/F0)呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均不小于0.999 1。其中，辣椒中CdSe/CdS QDs隨Cyr濃度變化的熒光光譜圖見圖3。分別以空白基質(zhì)的3、10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，得到檢出限(LOD)、定量下限(LOQ)分別為0.8～1.4 nmol/L、2.4～4.6 nmol/L。

表1 所建方法的線性關(guān)系、檢出限與定量下限Table 1 Linear relations,detection limits and quantitation limits of the established method

2.8 方法比較

因蔬菜的基質(zhì)背景熒光峰高于600 nm，本實(shí)驗(yàn)觀察到蔬菜基質(zhì)對(duì)CdSe/CdS QDs的熒光光譜幾乎無影響(p>0.05)。相比于Cyr的其他檢測(cè)方法，本方法通過熒光探針的熒光增強(qiáng)方式對(duì)Cyr進(jìn)行選擇性識(shí)別，具有線性范圍寬、檢出限低的優(yōu)勢(shì)(見表2)。

表2 本方法與Cyr常用檢測(cè)方法的比較Table 2 Comparison of common methods with this method for determination of Cyr

*obtained by conversion for convenient comparison

2.9 回收率實(shí)驗(yàn)及實(shí)際樣品的測(cè)定

為評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度，向辣椒、豇豆、苦瓜、黃瓜和圣女果空白提取液中加入一定量的Cyr標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本方法進(jìn)行4、40、100 μg/kg 3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表3所示，Cyr的回收率為82.5%～108%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)不大于6.9%，表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

采用本方法對(duì)?？谑协偵絽^(qū)東門市場(chǎng)銷售的蔬菜及澄邁縣永靈村種植地的蔬菜各15個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)，市售的5種蔬菜中均未檢出Cyr，但在種植地采集的豇豆、辣椒中檢出Cyr，其殘留量分別為0.096～0.105、0.231～0.470 mg/kg，其中辣椒中殘留量較高，但均未超過GB 2763-2016[5]規(guī)定的MRL值。

表3 所建方法的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 Recoveries and relative standard deviations of the established method(n=3)

3 結(jié) 論

本文以TGA作為穩(wěn)定劑制備CdSe/CdS QDs，基于Cyr可增強(qiáng)CdSe/CdS QDs熒光信號(hào)的特性，建立了一種測(cè)定蔬菜中Cyr含量的熒光探針法。結(jié)果表明，Cyr的檢出限為0.8～1.4 nmol/L，定量下限為2.4～4.6 nmol/L，回收率為82.5%～108%，RSD不大于6.9%。該方法靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、選擇性好，能夠用于實(shí)際蔬菜樣品中Cyr的檢測(cè)。