楊 梅，張 何，雷湘玲，傅 昕，王 青，周寧濤

(湖南工程學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，湖南省環(huán)境催化與廢棄物再生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 湘潭 411104)

重金屬污染指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染，主要由礦產(chǎn)開(kāi)采、污水排放和使用重金屬超標(biāo)制品等人為因素導(dǎo)致。汞(Hg)是環(huán)境中毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，具有生物富集性和生物非降解性，可導(dǎo)致汞中毒并引發(fā)尿血、尿毒癥等疾病[1-3]。二價(jià)汞離子是汞在水體中的主要存在形式[4-5]，目前傳統(tǒng)的汞離子檢測(cè)方法主要有熒光光譜法[6]、電感耦合等離子質(zhì)譜法(ICP-MS)[7]、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法(HPLC-ICP-MS)[8]、冷蒸氣原子熒光光譜法[9]、熒光猝滅法[10]等，這些方法具有較好的特異性、準(zhǔn)確性及靈敏度，但存在依賴精密儀器，操作過(guò)程復(fù)雜，成本較高等缺點(diǎn)，難以實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此建立一種靈敏度高、成本低、操作簡(jiǎn)單的汞離子傳感技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

石墨烯(Graphene)在2004 年由英國(guó)科學(xué)家Geim 等首次成功制備，是一種由 sp2雜化的單層碳原子緊密堆積組成的二維蜂窩狀碳納米材料。石墨烯及其衍生物具有優(yōu)良的光學(xué)、力學(xué)、熱學(xué)及化學(xué)性能，在熒光特性方面，石墨烯及其衍生物以環(huán)境友好、光致發(fā)光能力強(qiáng)、機(jī)械強(qiáng)度高、水溶性好、表面修飾容易等優(yōu)點(diǎn)，成為一種應(yīng)用廣泛的新型熒光物質(zhì)，在生物傳感器、環(huán)境檢測(cè)、疾病檢測(cè)、細(xì)胞成像等領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[11-13]。研究發(fā)現(xiàn)，胸腺嘧啶與汞離子之間能夠通過(guò)N—Hg鍵形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，并且該結(jié)構(gòu)中的N—Hg鍵比Watson-Crick氫鍵更穩(wěn)定[14]，因此構(gòu)建富T核酸適配體探針可以實(shí)現(xiàn)汞離子的高選擇性識(shí)別。目前基于該結(jié)構(gòu)已發(fā)展了許多汞離子檢測(cè)新技術(shù)，如熒光光度法[15]、電化學(xué)方法[16]、表面等離子體共振[17]、表面增強(qiáng)拉曼散射[18]和比色傳感器[19-20]等。

本研究以納米金(AuNPs)復(fù)合的氧化石墨烯為熒光材料，以選擇性結(jié)合Hg2+離子的巰基化單鏈富T核酸適配體(Aptamer)為分子識(shí)別探針，并基于該探針與Hg2+結(jié)合后能將氧化石墨烯的熒光猝滅的特性，構(gòu)建了一種簡(jiǎn)單、低成本、免標(biāo)記、快速的“turn-off”型石墨烯基Hg2+檢測(cè)技術(shù)，可用于自來(lái)水、湖水、河水等環(huán)境水體中汞離子的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因?yàn)樵搹?fù)合材料比石墨烯、金納米顆粒單獨(dú)存在時(shí)表面積更大，使得aptamer在AuNPs上的修飾更加容易，同時(shí)該材料還具有較大的比表面積，可顯著提高電子轉(zhuǎn)移速率[21]。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

UV-1800 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);Milli-Q Reference 超純水儀(德國(guó)默克密理博公司);pH-2602 酸度計(jì)(上海天達(dá)儀器有限公司)；手提式壓力蒸汽滅菌器(浙江新豐醫(yī)療器械有限公司);真空干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；高速離心機(jī)(艾本德生命科學(xué)公司)；熒光分光光度計(jì)(美國(guó)PE公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

石墨粉、硝酸鈉、高錳酸鉀、雙氧水、檸檬酸三鈉、氯金酸、氯化鉀、氯化鎂、二硫蘇糖醇、二氯化汞及其它金屬離子鹽均購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司。所用試劑均為分析純，使用時(shí)未經(jīng)進(jìn)一步純化，實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。aptamer 探針由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列為5'-SH-(CH)6-TTCTTTCT TCGCGTTGTTTGTT- 3'。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

1.2.1 Hummers法制備氧化石墨烯(GO)[22-24]搭建實(shí)驗(yàn)裝置，以攪拌器為主體，放上小水盆，利用支架(鐵架臺(tái))固定250 mL三口燒瓶，調(diào)整攪拌頭與燒瓶底部的位置，以接觸而不壓住為宜，可開(kāi)啟攪拌器檢驗(yàn)效果。

低溫處理：向水盆中加入適量冰塊與水(覆蓋燒瓶1/2體積為宜)，燒瓶中加入23 mL濃硫酸并安放好溫度計(jì)，在冰水浴下冷卻至5 ℃以下，依次加入1.0 g石墨粉、0.25 g NaNO3(注意盡量不要沾在玻璃容器壁上)，在冰水浴5 ℃以下，充分?jǐn)嚢璺磻?yīng) 30 min。

低溫反應(yīng)：將準(zhǔn)備好的3.0 g KMnO4緩慢分批加入，持續(xù)至少0.5 h，并控溫10 ℃以下反應(yīng)2 h；中溫反應(yīng)：緩慢升溫至35～40 ℃(可采用水浴法)并恒溫1 h，中溫、低溫時(shí)間只能多不能少，此時(shí)溶液呈粘稠墨綠色；高溫反應(yīng)：緩慢小心加入46 mL蒸餾水，使硫酸遇水放出大量的熱，將體系溫度穩(wěn)定在98 ℃左右，若溫度計(jì)升溫較快，上升到85 ℃左右時(shí)暫停加水，等穩(wěn)定后繼續(xù)添加，防止溫度過(guò)高，解離后的石墨片層在高溫下發(fā)生聚合反應(yīng)，出現(xiàn)黑色顆粒聚集。若達(dá)不到預(yù)期溫度，用提前備好的沸水水浴或者電熱套等直接加熱，恒溫15 min(95 ℃左右亦可，溶液高溫處理后呈現(xiàn)亮黃色為佳，繼續(xù)加熱10～15 min，整個(gè)高溫階段不宜超過(guò)30 min)；冷卻10 min，達(dá)到室溫(可以用冰水冷卻)，然后加140 mL蒸餾水稀釋，以3 mL 30% H2O2洗至溶液無(wú)氣泡產(chǎn)生，混合溶液呈亮黃色。

抽濾：用5% HCl 50 mL多次洗滌，再用適量蒸餾水洗滌至黑色，然后進(jìn)行反復(fù)加水離心處理，轉(zhuǎn)速4 000 r/min，待pH值接近中性時(shí)停止離心，并收集氧化石墨于燒杯中，取出所得產(chǎn)物，于60 ℃下真空干燥過(guò)夜，即得到干燥的氧化石墨烯。

1.2.2 石墨烯-金納米顆粒復(fù)合材料的制備[25]稱量30 mg的自制GO，加入30 mL去離子水，使用超聲波細(xì)胞破碎儀超聲處理(80 W)2 h，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的GO懸浮液。在上述懸浮液中加入0.03 g的檸檬酸三鈉，攪拌并加熱至70～80 ℃，反應(yīng)10 min；30 min內(nèi)分3～5次間隔加入1%的氯金酸共5 mL，此時(shí)溶液呈現(xiàn)深紫色，繼續(xù)反應(yīng)5～10 min即可停止反應(yīng)。12 000 r/min離心15 min，離心洗滌3次后懸浮于去離子水中，得到氧化石墨烯-金納米顆粒復(fù)合材料(GO@AuNPs)。

1.2.3 巰基aptamer功能化量取30 mL石墨烯-金納米顆粒復(fù)合材料懸浮液(1 mg/mL)，超聲處理3 h(400 W，設(shè)定超聲2 s間隔3 s)后取1 mL加入100 μL 1 mmol/L的二硫蘇糖醇(DTT)和100 μL 10 μmol/L的aptamer，再用去離子水稀釋至5 mL，常溫孵育24 h；將上述反應(yīng)溶液離心(12 000 r/min，10 min)并用10 mmol/L PBS進(jìn)行多次洗滌以去除游離的DNA，最后加入5 mL 10 mmol/L PBS，獲得aptamer-GO@AuNPs懸浮液。

1.2.4 Hg2+的檢測(cè)將0.5 mL待測(cè)樣品(含不同濃度Hg2+的水溶液)和0.5 mL aptamer-GO@AuNPs懸浮液混合均勻后常溫下反應(yīng)10 min，分別測(cè)定其熒光光譜，選擇615 nm處的熒光值作為測(cè)量值，計(jì)算熒光猝滅效率(IF0-IF)/IF0，其中IF為樣品熒光測(cè)量值，IF0為Hg2+濃度為0時(shí)的熒光值。將100 nmol/L的Ag+、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Co2+、Ca2+分別加入到上述的aptamer-GO@AuNPs懸浮液中，考察該檢測(cè)系統(tǒng)的特異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

通過(guò)Hummers法制備出氧化石墨烯(GO)，隨后以檸檬酸三鈉為還原劑，在無(wú)穩(wěn)定劑、溫和的液相反應(yīng)條件下，于氧化石墨烯表面原位還原氯金酸形成金納米顆粒，制備出氧化石墨烯負(fù)載金納米顆粒復(fù)合材料。氧化石墨烯負(fù)載的金納米顆?？梢院蚢ptamer上修飾的巰基形成強(qiáng)共價(jià)鍵(Au—S)并穩(wěn)定結(jié)合形成aptamer-GO@AuNPs。汞離子存在時(shí)，由于7個(gè)T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)的配位作用，aptamer折疊形成剛性的發(fā)夾狀雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，并使Hg2+靠近石墨烯表面(少于1 nmol/L)，電子可沿著雙鏈DNA通道從石墨烯轉(zhuǎn)移到汞離子，從而猝滅氧化石墨烯的熒光[26]。納米金的引入使得aptamer探針的修飾變得容易，同時(shí)經(jīng)過(guò)納米金修飾的氧化石墨烯比表面積更大，有利于檢測(cè)信號(hào)的進(jìn)一步放大。

圖1 基于氧化石墨烯熒光猝滅的免標(biāo)記Hg2+檢測(cè)原理示意圖Fig.1 Principle of the label-free detection of Hg2+ based on quenching of the fluorescence emission of graphene oxide

2.2 復(fù)合材料的表征

圖2A為GO薄片的AFM圖像，制備的GO薄片尺寸較為均一，長(zhǎng)度為600 nm，寬度為400 nm，高度為20 nm(圖2B)。圖2C是氧化石墨烯負(fù)載金納米顆粒的SEM圖像，從圖中可看出大量的金納米顆粒均勻地分布在氧化石墨烯薄片上，粒徑在20 nm左右，而且單層附著的金納米顆粒團(tuán)聚少，粒徑較為均勻，說(shuō)明兩者復(fù)合效果好。圖2D為氧化石墨烯與不同含量(0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)的氯金酸溶液反應(yīng)后制備的GO@AuNPs的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖,從圖可看出復(fù)合材料在540 nm 左右有較強(qiáng)的吸收峰，這與納米金溶液的紫外吸收特征峰基本相符。隨著氯金酸含量的升高，制備的GO@AuNPs復(fù)合材料在540 nm左右的吸收峰也相應(yīng)升高，說(shuō)明在石墨烯表面生長(zhǎng)了更多的納米金顆粒。

圖3 GO及其復(fù)合材料的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of GO and its composites

考察了GO、GO@AuNPs、aptamer-GO@AuNPs、aptamer-GO@AuNPs+Hg2+的熒光光譜變化情況(圖3)。從圖3可以看出，GO具有明顯的近紅外熒光，半峰寬較大(接近200 nm)；而在制備GO@AuNPs的過(guò)程中，檸檬酸三鈉的加入使得GO存在一定程度的還原，導(dǎo)致GO部分發(fā)光中心被去除(700～850 nm)，一些發(fā)光中心被保留(600～700 nm)，并出現(xiàn)了強(qiáng)的新發(fā)光中心(610 nm)，表現(xiàn)為GO@AuNPs的熒光峰半高寬變小(接近90 nm)。GO@AuNPs在修飾上aptamer探針后(aptamer-GO@AuNPs)，其熒光光譜的峰位、半峰寬無(wú)明顯變化，但熒光強(qiáng)度略有降低，可能是在修飾過(guò)程中GO@AuNPs有少量損失，或者aptamer探針修飾在復(fù)合材料的表面，對(duì)發(fā)光中心的光致發(fā)光性能產(chǎn)生了一定的影響。加入Hg2+后，aptamer-GO@AuNPs復(fù)合材料的熒光強(qiáng)度迅速下降，說(shuō)明Hg2+導(dǎo)致的發(fā)夾狀雙鏈DNA結(jié)構(gòu)能有效將電子從石墨烯傳遞到汞離子，從而猝滅了氧化石墨烯的熒光。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

由于在GO@AuNPs復(fù)合材料的制備中，當(dāng)金納米顆粒在石墨烯表面的覆蓋率過(guò)高時(shí)，將導(dǎo)致石墨烯的熒光被直接猝滅，因此考察了不同含量(0、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%)氯金酸形成的GO@AuNPs復(fù)合材料(1 mg/mL)在600 nm處的熒光發(fā)射強(qiáng)度。發(fā)現(xiàn)隨著金納米顆粒的負(fù)載，氧化石墨烯的熒光逐漸減弱，在氯金酸含量為0.1%～1.0%時(shí)，其熒光強(qiáng)度降低較慢，隨后熒光值快速下降(圖4A)，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用1.0%氯金酸制備GO@AuNPs復(fù)合材料。

考察了aptamer-GO@AuNPs與Hg2+的孵育時(shí)間對(duì)熒光猝滅效率的影響，如圖4B所示，當(dāng)孵育時(shí)間為10 min時(shí)，其熒光猝滅效率達(dá)90%，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用10 min作為aptamer-GO@AuNPs復(fù)合材料與Hg2+的反應(yīng)時(shí)間。

2.4 Hg2+的定量檢測(cè)

在aptamer-GO@AuNPs復(fù)合材料的懸浮液中分別加入不同濃度(0、0.1、0.5、1、10、20、50、100、500 nmol/L)的Hg2+，考察了Hg2+濃度對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響。由圖5A可知，隨著Hg2+濃度的增大，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度不斷減弱，當(dāng)Hg2+濃度超過(guò)100 nmol/L時(shí)，熒光值基本保持穩(wěn)定(圖5B)。Hg2+濃度(c，nmol/L)在0.5～80 nmol/L之間與熒光猝滅效率(IF0-IF)/IF0(y)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.214+0.007c，線性相關(guān)系數(shù)r2為0.996。以空白的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差除以標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率得到本方法的檢出限為0.3 nmol/ L，遠(yuǎn)低于中國(guó)《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定的飲用水中無(wú)機(jī)Hg2+的最高允許水平(<5 nmol/L)。結(jié)果表明，該方法對(duì)Hg2+的定量分析具有較高的靈敏度和良好的線性度。

圖6 Hg2+傳感器的選擇性分析Fig.6 Selectivity of the proposed sensor towards detection of Hg2+

2.5 Hg2+檢測(cè)的選擇性

考察了8種常見(jiàn)的金屬離子(Ag+、Cd2+、Cu2+、Fe3+、Ni2+、Pb2+、Co2+、Ca2+)對(duì)體系識(shí)別Hg2+的影響。結(jié)果顯示，在其它金屬離子存在時(shí)，檢測(cè)體系的熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化(圖6)，說(shuō)明只有富T堿基的aptamer與Hg2+特異性結(jié)合后才能折疊形成剛性的發(fā)夾狀雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，并使Hg2+靠近石墨烯表面猝滅其熒光;其他金屬離子不能構(gòu)建GO的電子傳遞通道。綜上所述，由于aptamer對(duì)Hg2+的較高特異性，使得該傳感器具有優(yōu)良的選擇性。

2.6 實(shí)際樣品分析

為考察本方法用于環(huán)境水體樣品中Hg2+檢測(cè)的可行性，分別采集自來(lái)水、湘江水以及湖水樣本，進(jìn)行3個(gè)水平(1.0、10.0、50.0 nmol/L)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，樣品使用前過(guò)濾去除懸浮顆粒及雜質(zhì)。如表1所示，3種不同來(lái)源水體樣品的加標(biāo)回收率為96.0%～105%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.4%～3.2%。結(jié)果表明，本方法具有良好的準(zhǔn)確度和靈敏度，能夠滿足環(huán)境水體中 Hg2+污染檢測(cè)的要求。

表1 環(huán)境水體樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=5)Table 1 Results of spiked recoveries of environmental water samples(n=5)

3 結(jié) 論

基于Hg2+能夠猝滅aptamer功能化氧化石墨烯-金納米顆粒復(fù)合材料熒光的特性，發(fā)展了一種免標(biāo)記、快速的Hg2+傳感技術(shù)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)僅10 min，具有高的靈敏度和選擇性，抗干擾能力強(qiáng)，穩(wěn)定性好，在環(huán)境水體樣本的檢測(cè)中表現(xiàn)出良好適應(yīng)性，為環(huán)境檢測(cè)和臨床醫(yī)學(xué)診斷提供了一種實(shí)用、有效且廉價(jià)的檢測(cè)方法。