李克梅，阿孜古麗·木漢買提，葛瑞云，劉學(xué)學(xué)，李寶義，熱甫卡提·雪合拉提

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

苜蓿(Medicagospp.)素有“牧草之王”美譽，具有適應(yīng)性強，產(chǎn)草量高，富含蛋白質(zhì)等特性，作為牧草在世界范圍被廣泛種植[1]，也可作為綠肥，改土肥田、保持水土、改善生態(tài)環(huán)境等[2]。目前全世界的苜蓿種植面積為3 300萬hm2，其中美國[3]約1 000萬hm2，我國[4]苜蓿約470萬hm2。我國苜蓿主產(chǎn)區(qū)為東北、華北和西北地區(qū)[5]。

隨著苜蓿種植面積的逐步增加，苜蓿病毒病的發(fā)生狀況呈加重趨勢，越來越多的病毒種類被發(fā)現(xiàn)，病毒復(fù)合侵染的現(xiàn)象普遍存在，引起的癥狀類型越來越多樣化，嚴重影響苜蓿生產(chǎn)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展[6]。苜蓿病毒病常表現(xiàn)為花葉、矮化或畸形等癥狀，使之產(chǎn)量降低，難以越冬[7]。國內(nèi)外研究報道，有多種病毒可以侵染苜蓿[8]，在阿根廷紫花苜蓿田中發(fā)現(xiàn)有菜豆卷葉病毒(bean leafroll virus, BLRV)的侵染[9]；在澳大利亞苜蓿田中發(fā)現(xiàn)有苜蓿矮化病毒(alfalfa dwarf virus, ADV)和苜蓿卷葉病毒(alfalfa leafroll virus, ALRV)的侵染[10]；在沙特阿拉伯紫花苜蓿、雜草和栽培植物中檢測到苜?；ㄈ~病毒(alfalfa mosaic virus, AMV)以及菜豆卷葉病毒[11]；在伊朗苜蓿田中檢測到有苜?；ㄈ~病毒、菜豆卷葉病毒、花生矮化病毒(peanut stunt virus, PSV)和菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus, BYMV) 4種病毒可以侵染苜蓿，檢出率分別為23.3%、12%、0.7%和0.28%[12]；在甘肅張掖地區(qū)番茄花葉病毒(tomato mosaic virus, ToMV)和苜?；ㄈ~病毒復(fù)合侵染苜蓿[13]；在新疆有菜豆黃花葉病毒和苜蓿花葉病毒侵染苜蓿的報道[14-15]。新疆是我國苜蓿種植的主要產(chǎn)區(qū)之一[16]，近年來，牧草病害課題組成員在新疆苜蓿田間發(fā)現(xiàn)大量矮化、叢枝、卷葉等癥狀的植株，發(fā)病率為20%～100%，該病害不僅引起牧草大幅度減產(chǎn)，而且極大地縮短苜蓿草地使用年限。2017-2018年，借助Si-RNA高通量測序分析，認為在此類癥狀病株中可能攜帶有菜豆卷葉病毒。因此，本研究對栽培苜蓿疑似卷葉、矮化等癥狀的病害種類的病原開展BLRV分子檢測，以明確新疆苜蓿卷葉的癥狀是否由BLRV侵染引起，從而正確認識該病害的病原種類以及分類地位，以便對該病害的防治提供理論依據(jù)[17]。

1 材料與方法

1.1 材料

待測苜蓿樣品的采集：2017年5月至2018年9月，分別在新疆北疆昌吉州的呼圖壁縣，烏魯木齊市的烏拉泊、板房溝、南山以及阿勒泰地區(qū)的布爾津、北屯、富蘊縣采集表現(xiàn)為有卷葉、皺縮、矮化等癥狀的苜蓿病株樣品，同時將采集到的健康苜蓿植株作為陰性對照，每種癥狀的病葉樣品采集兩份，一份放入4 ℃短期保存，另一份樣品保存于-80 ℃冰箱，用于RNA提取等后續(xù)試驗。

菌株和質(zhì)粒：Transl-T1感受態(tài)細胞，pEASYT1克隆載體均采購于北京全式金生物技術(shù)有限公司，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)病理研究室保存。

生化試劑：10×PCR Buffer (Mg2+)、dNTPs(2.5 mmol·L-1)、Taq DNA 聚合酶(5 U·μL-1)、2 k bp DNA Marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)、cDNA第一鏈合成試劑盒、TRNzol Universal總RNA提取試劑、氨芐青霉素(Amp+)、X-gal、IPTG等生化試劑皆購于北京全式金生化生物科技有限公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 苜蓿菜豆卷葉病毒的分子檢測

1.2.1 苜蓿總RNA的提取

分別稱取0.1～0.2 g的苜蓿病樣和健康植株樣品的嫩葉，用TRNZOL universal (全式金)試劑法提取苜蓿葉片的總RNA (提取方法參見產(chǎn)品操作說明書)，并將提取的RNA置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菜豆卷葉病毒的RPCR擴增及電泳檢測

將Trucco等[9]設(shè)計的BLRV的外殼蛋白基因特異性引物序列BLRV-F/BLRV-R提交至上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如下：BLRV-F：5’-TAGGTTCCTTCGATTACAAG-3’，BLRV-R：5’-CTTCAATATTCGTCCAGTTC-3’。用全式金cDNA第一鏈合成試劑盒合成cDNA第一鏈，步驟按說明書進行，將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA放置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以合成的cDNA第一鏈為模板，BLRV-F/BLRV-R為引物進行常規(guī)RT-PCR擴增。在25 μL的RT-PCR反應(yīng)體系中，cDNA模板1 μL；Taq DNA聚合酶 0.5 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL (2.5 mmol·L-1MgCl2)； dNT Ps 1 μL (10 mmol·L-1)；上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL；ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序：94 ℃4 min，94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR產(chǎn)物，使用凝膠成像系統(tǒng)拍攝并記錄。

1.3 序列測定及分析

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物，切取特異性目的條帶，采用快速凝膠回收純化試劑盒(EasyPure Quick Gel Extraction Kit)回收、純化后，再與載體Trans1-T1(TRANS)在常溫下連接25 min，繼而進行轉(zhuǎn)化、涂板、藍白斑篩選，將篩選到的含正確插入片段的質(zhì)粒送往上海生工生物工程股份有限公司進行序列測定。運用DNAMAN8.0軟件將測序獲得的序列與GenBank中已提交的菜豆卷葉病毒代表性序列進行核苷酸序列同源性對比分析，使用MEGA7.0中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，最終將獲得的序列提交至Bankit獲得序列登錄號(MK263743.1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病株癥狀

栽培苜蓿通常第1年不表現(xiàn)癥狀，第2年春季返青后即可表現(xiàn)癥狀，相對于健康苜蓿植株，疑似病毒病的苜蓿植株矮小，枝條細弱，葉片邊緣呈皺縮或有波紋的卷曲狀，常伴有花葉或黃化斑駁，發(fā)病嚴重的甚至無法開花(圖1)。

圖1 苜蓿卷葉病毒病田間癥狀Figure 1 Symptoms of alfalfa leafroll virus disease in the field

2.2 RT-PCR檢測

對苜蓿病株樣品進行RT-PCR擴增檢測，用引物BLRV-F/BLRV-R可以擴增出大小約為1 000 bp的特異性條帶(圖2)。

圖2 BLRV RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Figure 2 RT-PCR amplification of bean leafroll virus(BLRV)

2.3 BLRV外殼基因片段序列測定及分析

提取采集的疑似卷葉病毒病的苜蓿樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物回收純化、克隆和序列測定。測序結(jié)果表明：從新疆苜蓿疑似感染BLRV的樣品中得到長955 bp的特異性片段，G+C含量為49.7%。經(jīng)序列比對，所得核苷酸序列與已報道的豆科植物上菜豆卷葉病毒(BLRV)分離物核苷酸序列同源性介于85.1%～96.5%。其中與阿根廷苜蓿BLRV分離物(KR261610.1)、美國豌豆BLRV分離物(HM439776.1)和(GQ404380.1)、澳大利亞苜蓿BLRV分離物(MF075256.1)序列同源性分別為96.5%、93.0%、92.7.%和89.2% (表1)。

2.4 系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建和分析

運用MEGA7.0軟件中鄰接法將新疆苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)外殼蛋白基因序列與GenBank中已報道的相同基因部分序列以及苜?；ㄈ~病毒[18](MF075254.1)、苜蓿矮化病毒[10](FJ15933.1)、苜蓿卷葉病毒[22](KX574859)外殼蛋白基因序列進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。經(jīng)序列比較分析，從構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可見(圖3)，新疆侵染苜蓿的菜豆卷葉病毒BLRV-XJ分離物(MK263743)與希臘菜豆卷葉病毒(KT382814.1、HE601635.1、KT382812.1)分離物進化樹關(guān)系最近，在同一進化分支上，故將其鑒定為菜豆卷葉病毒(bean leafroll virus)，同屬于黃癥病毒科(Luteoviridae)黃癥病毒屬(Luteovirus)。

表1 新疆BLRV分離物外殼蛋白基因核苷酸序列與已報道BLRV分離物同源性比較Table 1 Comparison of the homology between the nucleotide sequence of the coat protein gene of bean leafroll virus (BLRV) isolates in Xinjiang and the reported BLRV isolates

圖3 用鄰接法構(gòu)建的新疆菜豆卷葉病毒紫花苜蓿分離物外殼蛋白基因系統(tǒng)進化樹Figure 3 Neighbor-joining phylogenetic tree based on the coat protein gene of the bean leafroll virus (BLRV)isolates on alfalfa in Xinjiang

3 討論與結(jié)論

截至2015年，我國苜蓿種植面積達到470.8萬hm2[23]。新疆是我國苜蓿種植的主要產(chǎn)地之一，近幾年苜蓿病毒病的發(fā)生越發(fā)嚴重，但病原報道不多。本研究利用菜豆卷葉病毒(BLRV)特異性引物對新疆苜蓿疑似病毒病植株進行PCR檢測，擴增出長955 bp特異條帶，測序序列比對結(jié)果與菜豆卷葉病毒(BLRV)同源性較高，與Trucco等[9]報道的阿根廷侵染苜蓿的BLRV(KR261610.)同源性最高。從構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹可知，新疆侵染苜蓿的菜豆卷葉病毒BLRV(MK263743)與已知豆科植物中的菜豆卷葉病毒聚為一類。該結(jié)果證明了新疆栽培苜蓿疑似卷葉病毒病的病原為菜豆卷葉病毒(BLRV)。阿根廷、伊朗、澳大利亞曾報道菜豆卷葉病毒侵染苜蓿[9,12,18]，本研究結(jié)果首次證實該病毒在中國侵染苜蓿，豐富了苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)在中國新疆地區(qū)基因組序列信息，對今后的檢測提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。

目前，國內(nèi)苜蓿種子供應(yīng)量還有所不足，苜蓿干草也是我國進口草產(chǎn)品中的主打產(chǎn)品[24]。苜蓿種子和干草常常是病原的直接傳播來源，我國苜蓿種子進口國家有美國、澳大利亞、西班牙和加拿大等[25]。文朝慧等[26]利用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附分析結(jié)合RT-PCR方法從52份紫花苜蓿種子樣品中檢測到45份攜帶有苜?；ㄈ~病毒(AMV)、3份攜帶菜豆黃花葉病毒(BYMV)。苜蓿菜豆卷葉病毒(BLRV)很可能隨著進口苜蓿種子和苜蓿干草的引進傳入我國并引起危害，相關(guān)部門應(yīng)引起足夠重視。

病毒是一類傳染性很強的植物病原生物，通過對病毒病的檢測，可及早發(fā)現(xiàn)感病植物體內(nèi)病毒的存在，對病害的防治以及深入研究病毒的病理特點具有重要的意義。目前我國對苜蓿病毒病的研究較少，在今后的工作中還需要進一步開展檢測和防治技術(shù)研究。苜蓿病毒病對我國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展存在較大的威脅，確認不同病毒之間的聯(lián)系以及病毒復(fù)合侵染問題還需要進一步研究，為苜蓿病毒病害檢測及其防治奠定基礎(chǔ)。