郭 湘，郭一帆，黃思怡，蒲 棋，楊 康，彭 燕

（四川農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，四川 成都 610000）

紫花苜蓿(Medicago sativa)為優(yōu)良的多年生豆科飼草，具有產(chǎn)量和營養(yǎng)價值高，適口性好和適應性強等特點，素有“牧草之王”的美譽，是國內(nèi)外栽培最為廣泛的飼草之一[1]。我國北方是紫花苜蓿的主要栽培區(qū)，也是干旱和鹽堿地大量分布區(qū)。近年來，受全球氣候變暖的影響，我國季節(jié)性干旱和土壤鹽漬化程度加劇的問題日益突出[2-3]。眾多研究報道，干旱和鹽堿脅迫可導致紫花苜蓿產(chǎn)量大幅下降，干旱和鹽堿脅迫已成為嚴重制約紫花苜蓿產(chǎn)量穩(wěn)定和提高的主要限制因子[4-5]。此外，隨國內(nèi)苜蓿產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，國內(nèi)對苜蓿品種的種子需求量不斷增長，國內(nèi)的種子供給存在較大缺口，因此，生產(chǎn)中大量應用引進的國外品種十分普遍，然而，引進品種對干旱和鹽堿的耐受性如何需要在利用前進行有效評價以減少由于盲用選用而導致的生產(chǎn)損失。Al-Khatib等[6]的研究表明，紫花苜蓿萌發(fā)期和幼苗期對干旱和鹽堿脅迫較敏感，生長后期耐性增強。因此，在種子發(fā)芽期評價不同品種的抗旱耐鹽性并篩選抗性強的品種，對干旱鹽堿區(qū)合理選用適宜的栽培品種具有重要指導價值。種子萌發(fā)階段是在植物發(fā)育過程中的關鍵時期，種子萌發(fā)期的抗性強弱會直接影響之后田間播種出苗的好壞，因此對種子萌發(fā)期抗性的評價具有參考價值和實踐意義的。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

14個供試的紫花苜蓿品種別購自北京克勞沃、丹農(nóng)種子集團以及四川省涼山州畜牧研究所，品種信息如表1所列。

1.2 試驗內(nèi)容

1.2.1 PEG和NaCl處理的適宜濃度篩選

以‘涼苜一號’的種子為試材，依照國際種子檢驗規(guī)程，不同脅迫處理下萌發(fā)率的測定采用培養(yǎng)皿法。本試驗隨機選取健康的種子，用清水浸泡3 h后均勻放置在鋪設有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿種子數(shù)為50粒，然后置入智能光照培養(yǎng)箱進行發(fā)芽，溫度為20 ℃恒溫，12 h光照/12 h黑暗。設置 0 (CK)、150、200、250、300 mmol·L-1NaCl的溶液和0(CK)、15、20、25、30%的PEG-6000溶液處理種子，每個處理設6次重復，采用稱重法補充每天蒸發(fā)所失去的水分，以保持溶液濃度的恒定，第10天結束發(fā)芽試驗。

表1 供試材料Table 1 The selected material

1.2.2 供試紫花苜蓿品種在干旱和鹽脅迫下的發(fā)芽試驗

選取14個品種的健康種子，分別浸泡3 h后，采用1.2.1中篩選出的PEG和NaCl濃度處理萌發(fā)期的種子。種子發(fā)芽所處的溫度和光照條件同1.2.1，每天記錄發(fā)芽的種子數(shù)量。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對發(fā)芽指數(shù)

發(fā)芽勢(germination potential, GP)=4天內(nèi)供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%；

相對發(fā)芽勢(relative germination potential, RGP)=處理后第4天的種子發(fā)芽勢/第4天對照種子發(fā)芽勢×100%；

發(fā)芽率(germination rate, GR)=第10天供試種子發(fā)芽數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

相對發(fā)芽率(relative germination rate, RGR)=處理后第10天的種子發(fā)芽率/第10天對照種子發(fā)芽率×100%。

發(fā)芽指數(shù)(germination index, GI)=G1/N1+G2/N2+…+Gn/Nn。

式中：G1、G2、…、Gn為第1、2、…、n天的發(fā)芽數(shù)N1、N2、…、Nn為相應的發(fā)芽天數(shù)。

相對發(fā)芽指數(shù)(relative germination index, RGI)=處理濃度發(fā)芽指數(shù)/對照發(fā)芽指數(shù)。

1.3.2 根長測定

在培養(yǎng)第10天時，每個品種選4組生長情況相近培養(yǎng)皿，每皿隨機選取10株苗，4次重復，用直尺測定每株的根長，測定結果以平均值表示[7]。

相對根長=處理后第10天種子根長/第10天對照種子根長×100%。

1.3.3 鮮重的測定

在培養(yǎng)第10天時，每個品種選4組生長情況相近培養(yǎng)皿，每皿隨機選取10株苗，4次重復，用萬分之一電子天平準確測定10株苗的鮮重，測定結果以平均值表示[8]。

1.3.4 干重測定

將測定好鮮重的10株幼苗放入105 ℃烘箱內(nèi)10 min，然后降溫到65 ℃經(jīng)過48 h烘干至恒重，再用萬分之一電子天平準確稱干重，測定結果以平均值表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)整理；用SPSS 22.0軟件對不同品種在同一脅迫處理進行單因素方差分析，并用Duncan方法對所測定數(shù)據(jù)進行多重比較；用Origin 2018作圖。

1.5 綜合評價

利用隸屬函數(shù)法對14種紫花苜蓿的抗旱以及耐鹽性進行綜合評價。模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法計算公式：Yij=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。式中：Yij為i品種的j指標的隸屬函數(shù)值；Xij為i品種的j指標的平均值；Xjmin為各品種j指標平均值的最小值；Xjmax為各品種j指標平均值的最大值；如某一個指標與種子抗性負相關，則用反隸屬函數(shù)計算抗旱以及耐鹽性隸屬函數(shù)值：Yij=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)。最后將每個品種的每個指標利用公式計算其隸屬值，再將同一指標隸屬值累加算其平均值，各項指標隸屬函數(shù)值累加求平均值。通過比較不同品種的隸屬值的總平均值，確定不同苜蓿的耐受脅迫的綜合能力，總平均值越大，抗性越強；反之，抗性越弱。

2 結果與分析

2.1 適宜的PEG和NaCl濃度的篩選結果

當PEG濃度為15%和20%時紫花苜蓿的發(fā)芽率分別為98.00%和98.40%，略高于對照(96.80%)(圖1)，但三者差異不顯著(P＞0.05)，表明低濃度PEG處理對紫花苜蓿的發(fā)芽率有一定的促進作用。當PEG濃度升高至25%時，發(fā)芽率下降為47.20%，與對照及15%和20%處理間差異顯著(P＜0.05)。PEG濃度為30%時，種子萌發(fā)受到嚴重抑制，發(fā)芽率僅有4.40%。對照和150 mmol·L-1NaCl處理下，的發(fā)芽率分別為96.80%和97.20%，差異不顯著，表明低鹽條件下度有利于紫花苜蓿種子的萌發(fā)。當NaCl濃度為 200、250、300 mmol·L-1時，紫花苜蓿的發(fā)芽率隨濃度升高而顯著下降，分別為85.20%、54.00%、8.80%。篩選的結果需要兩種脅迫對苜蓿種子發(fā)芽率影響程度接近，所以選擇250 mmol·L-1NaCl和25%PEG分別作為鹽和滲透脅迫的濃度，以測試不同紫花苜蓿品種在種子萌發(fā)期對鹽和滲透脅迫的耐受性。

圖1 ‘涼苜一號’在不同NaCl濃度和不同PEG濃度下的發(fā)芽率Figure 1 ‘Liangmu No.1’ germination rate under different NaCl concentration and different PEG concentration

2.2 干旱和鹽脅迫下不同紫花苜蓿品種的相對發(fā)芽勢

發(fā)芽勢是反映種子質(zhì)量優(yōu)劣的指標之一，它可以反映種子生活力的強弱，出苗的整齊程度，發(fā)芽勢越高，種子生活力越強，出苗整齊，增產(chǎn)潛力也越大。在鹽或干旱脅迫下，紫花苜蓿的種子萌發(fā)皆受到嚴重抑制(表2)，平均相對發(fā)芽勢由對照組的100%分別降至41.37%或43.46%。其中，鹽脅迫時，供試品種的相對發(fā)芽勢為28.63%～61.61%，‘涼苜一號’的相對發(fā)芽勢最高，為61.61%，‘巨能995’較高，為55.78%，‘巨能7’相對發(fā)芽勢最低，為28.63%，‘巨能4030’和‘巨能401’較低，分別為33.11%和33.00%。其余品種介于它們之間。干旱脅迫時，供試品種的相對發(fā)芽勢在31.44%～85.08%，相對發(fā)芽勢高于49%的有3個品種，‘巨能995’最高，為85.08%，‘莎莎’和‘法多’較高，分別為49.01%和51.30%；‘威斯頓’的相對發(fā)芽勢最低，為31.44%。以上分析結果說明在鹽脅迫下，‘涼苜一號’和‘巨能995’種子生活力強；干旱脅迫下，‘巨能995’，‘莎莎’和‘法多’種子生活力強。

表2 14個紫花苜蓿品種在干旱和鹽脅迫下的相對發(fā)芽勢Table 2 Relative germination potential of 14 Medicago sativa cultivars under drought and salt stress %

2.3 不同品種的相對發(fā)芽率

發(fā)芽率是反映種子質(zhì)量和出苗率的指標[7]，種子發(fā)芽率越高，則表明有生命活力的種子比例越高。無論鹽脅迫還是干旱脅迫，相對發(fā)芽率都呈現(xiàn)下降趨勢。在鹽脅迫下，14個苜蓿品種的相對發(fā)芽率在44.98%～75.91%，其中大部分品種的相對發(fā)芽率集中在44%～52% (表3)。相對發(fā)芽率高于60%的有3個品種，其中‘涼苜一號’最高，為75.91%；低于50%的有7個品種，‘希?！畹?，為44.98%。干旱脅迫下，相對發(fā)芽率在42.18%～86.27%，不同品種間差異較大。相對發(fā)芽率在60%以上的有7個品種，‘巨能995’相對發(fā)芽率最高，達86.27%；相對發(fā)芽率在50%以下的有3個品種，‘英斯特’相對發(fā)芽率最低，為42.18%，‘威神’和‘涼苜一號’較低，分別為45.75%和45.45%。所以從發(fā)芽率這個指標來看，在鹽脅迫下‘涼苜一號’抗鹽性表現(xiàn)突出，而干旱脅迫下‘巨能995’的抗旱能力相對其余品種尤為突出。

2.4 不同品種的發(fā)芽指數(shù)

發(fā)芽指數(shù)可以反映種子的萌發(fā)速度和整齊程度[8-9]。在脅迫情況下，各品種的發(fā)芽指數(shù)均下降(圖2)，顯著高于其余品種(P＜0.05)。在對照處理中，不同品種間的發(fā)芽指數(shù)在90%～124%。在鹽脅迫時，‘涼苜一號’的發(fā)芽指數(shù)最高，其次為‘巨能995’和‘法多’。干旱脅迫時，‘巨能995’的發(fā)芽指數(shù)最高，顯著高于其余品種(P＜0.05)，較高的還包括‘希?！汀ǘ唷?。

2.5 不同品種的相對根長

種子萌發(fā)時胚根一般是率先突破種皮，具有吸收水分和養(yǎng)分的功能，因此發(fā)達的根系是植物耐受脅迫能力的一個重要指標。在鹽脅迫下，胚根生長受到嚴重抑制(表4)，與對照相比，明顯變短，14個苜蓿品種的相對根長范圍為6.48%～14.67%，‘英斯特’相對根長最長，達到了14.67%；‘威斯頓’相對根長最短，為6.46%，這一結果也與鹽脅迫下‘威斯頓’發(fā)芽勢最低的結果一致。然而，干旱脅迫對胚根生長的抑制作用較小，其中‘莎莎’、‘希?！⑺固亍?個品種的相對根長值不僅沒有變小，反而變大(＞100%)，相對根長大于90%的有5個品種，僅‘巨能4030’的相對根長低于70%。

表3 14個紫花苜蓿品種在干旱和鹽脅迫下的相對發(fā)芽率Table 3 Relative germination rate of 14 Medicago sativa cultivars under drought and salt stress%

圖2 不同紫花苜蓿品種的發(fā)芽指數(shù)Figure 2 Germination index of different Medicago sativa varieties

表4 14個紫花苜蓿品種在干旱和鹽脅迫下的相對根長Table 4 Relative root length of 14 Medicago sativa cultivars under drought and salt stress %

2.6 不同品種的相對鮮、干重

就鮮重而言，在兩種脅迫下都受到嚴重抑制，呈現(xiàn)顯著下降的趨勢。在鹽處理下，‘莎莎’相對鮮重最低，為0.07；‘法多’相對鮮重最高，達0.47 (表5)。干旱處理時，‘梅佐’的相對鮮重高達0.57；‘涼苜一號’則低至0.28。在鹽脅迫下，‘法多’的相對干重最高，為1.22，‘梅佐’最低，為0.79，其中相對干重大于 1 還包括‘巨能 551’、‘巨能 601’、‘希?！ⅰ诡D’。在干旱脅迫下，‘巨能551’的相對干重最高，為1.47，‘巨能4030’的相對干重最低，為0.96，其中除了‘巨能4030’之外，其余品種的相對干重都大于1，說明干旱脅迫對于苜蓿幼苗積累干物質(zhì)的抑制作用較小，甚至對于干物質(zhì)的積累有促進作用。

2.7 不同品種萌發(fā)期的耐鹽性比較

采取模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法，對相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對鮮重、相對干重、相對發(fā)芽指數(shù)等指標進行隸屬函數(shù)值計算，并對不同紫花苜蓿品種的耐鹽性進行排序(表6)，‘法多’的耐鹽能力最強，均值為0.839；其次是‘涼苜一號’和‘巨能 551’，均值分別為 0.743、0.651；‘莎莎’的耐鹽能力最差，均值只有0.155，較差的為‘巨能 7’和‘梅佐’，均值分別為 0.239 和 0.248。

2.8 不同品種的抗旱性比較

采取模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法，對相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對鮮重、相對干重、相對發(fā)芽指數(shù)等指標進行隸屬函數(shù)值計算，并對不同紫花苜蓿品種的抗旱性進行排序(表7)，‘巨能995’ 對滲透脅迫的耐受性最強，均值為0.712；其次為‘希?！汀ǘ唷捣謩e為0.616和0.585；‘巨能 4030’、‘涼苜一號’、‘威神’的抗旱能力較差，均值較低，分別為0.107、0.213和0.274。

2.9 供試品種抗旱、耐鹽性的綜合評價

將計算出的各品種抗旱性和耐鹽性的隸屬函數(shù)值綜合取平均值，對紫花苜蓿品種的抗逆性進行綜合比較排序[10]。結果顯示，綜合抗性較強的品種有‘法多’、‘巨能 995’和‘巨能 551’；而‘巨能 4030’、‘威神’和‘莎莎’的綜合抗性較差 (表8)。

表5 14個紫花苜蓿品種在干旱和鹽脅迫下的相對鮮重和干重Table 5 Relative fresh and dry weight of 14 Medicago sativa cultivars under drought and salt stress

表6 14個紫花苜蓿品種萌發(fā)期耐鹽性指標隸屬值及排序Table 6 Membership value and order of salt tolerance indexes of 14 Medicago sativa cultivars during germination

表7 14個紫花苜蓿品種萌發(fā)期抗旱性指標隸屬值及排序Table 7 Membership value and order of drought resistance indexes of 14 Medicago sativa cultivars during germination

表8 14個紫花苜蓿品種抗旱、耐鹽性的綜合評價Table 8 Comprehensive evaluation of drought and salt tolerance of 14 Medicago sativa culitvars

3 討論

3.1 NaCl和PEG脅迫濃度選擇的有效性

有研究表明，在PEG模擬干旱脅迫中，因PEG分子本身不易自由通過植物細胞壁而滲入到活細胞內(nèi)，眾多研究表明，采用PEG滲透劑模擬干旱脅迫是一種經(jīng)濟、有效的方法，而且低濃度的PEG可以通過啟動種子體內(nèi)一系列保護機制，來減少種子吸脹過程中膜系統(tǒng)的損傷，從而提高植物種子發(fā)芽率[11]。李志萍等[12]對栓皮櫟(Quercus variabilis)種子進行PEG滲透脅迫，發(fā)現(xiàn)低濃度促進種子萌發(fā)。陳士超等[13]發(fā)現(xiàn)PEG濃度為20%時，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等均小于CK，但是這些指標較CK降低不顯著；當PEG濃度高于25% (包括25%)時，以上指標均顯著小于CK。宮文龍等[14]報道，低濃度NaCl處理對紫花苜蓿種子萌發(fā)有促進作用，高濃度時則嚴重抑制，其中1.2% (大于200 mmol·L-1)的NaCl濃度可有效鑒別紫花苜蓿品種的耐鹽性。本研究也獲得類似的結果，150 mmol·L-1NaCl以及15%、20% PEG處理處理時，紫花苜蓿種子的發(fā)芽率高于對照。試驗篩選的NaCl和PEG處理濃度為250 mmol·L-1和25%，與報道結論[13-14]相近，這一結果為選擇適宜的NaCl和PEG脅迫濃度以鑒定紫花苜蓿萌發(fā)期的抗旱耐鹽性提供了參考。

3.2 紫花苜蓿胚根適應鹽和干旱脅迫的策略

干旱脅迫和鹽脅迫是兩種機制不一樣的脅迫，植物耐鹽性是由多基因控制的數(shù)量性狀，因此不同植物耐鹽機理會有一定的差異性[15]，鹽脅迫主要通過影響細胞內(nèi)離子穩(wěn)定和水分平衡進而對植物生生理活動產(chǎn)生影響[16]，在PEG模擬干旱脅迫中，因PEG分子本身不易自由通過植物細胞壁而滲入到活細胞內(nèi)，且一定濃度的PEG可以通過啟動種子體內(nèi)一系列保護機制，來減少種子吸脹過程中膜系統(tǒng)的損傷，促進植株生長也從而提高植物種子發(fā)芽率[17]。馬巧利等[18]研究發(fā)現(xiàn)，等滲條件下NaCl處理的紫花苜蓿胚根較粗短，而PEG處理的胚根較細長，且NaCl比PEG對紫花苜蓿造成的傷害更大。相近地，在本研究中250 mmol·L-1鹽迫脅下，供試的紫花苜蓿胚根生長皆受到顯著抑制，相對根長僅為對照的10%左右，而干旱脅迫對胚根的抑制作用較小，14個品種中有3個品種的相對根長比對照長，5個品種大于90%。這些結果表明，紫花苜蓿種子萌發(fā)時以不同的策略應對鹽和干旱脅迫。

3.3 紫花苜蓿萌發(fā)期抗旱耐鹽性的綜合評價

植物種子發(fā)芽能力受眾多因素影響。飼草種子的發(fā)芽速度和整齊度與牧草生長和產(chǎn)量密切相關。逆境脅迫條件下有效評價種子發(fā)芽能力在生長中具有重要指導意義。已有文獻顯示，評價植物種子發(fā)芽能力的方法較多，宮文龍等[14]通過‘打分法’對不同苜蓿品種的耐鹽性進行了綜合評價，孔令琪等[19]為避免單一指標評價的片面性，用平均隸屬函數(shù)值法對17個苜蓿品種萌發(fā)特性進行了評價，車代弟等[10]通過綜合抗旱性和抗鹽性隸屬函數(shù)值取平均值對25種花卉綜合抗性進行排序作出評價。本研究中采取模糊數(shù)學隸屬函數(shù)法，對14個紫花苜蓿品種的相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長、相對鮮重、相對干重、相對發(fā)芽指數(shù)進行隸屬函數(shù)值計算和排序，再將計算出的各品種抗旱性和耐鹽性的隸屬函數(shù)值綜合取平均值，對紫花苜蓿品種的抗逆性進行綜合比較排序，以綜合評價它們對鹽和干旱脅迫的耐受性。

結果顯示，‘巨能995’的耐鹽性較好，這與馬宗琪等[1]認為‘巨能995’為較耐鹽品種的結果一致?！弈?95’和‘法多’的發(fā)芽能力在鹽脅迫或干旱脅迫中的均表現(xiàn)較好。由于抗旱性和耐鹽能力是受多因素影響的復雜數(shù)量性狀，在種子萌發(fā)期鑒定出來的抗性強的品種在苗期乃至整個生命周期是否也表現(xiàn)較強的抗性，還有待進一步研究[20-22]。此外，該研究在中性鹽脅迫下進行，而生產(chǎn)中常常是鹽堿脅迫同時出現(xiàn)，因此不同品種的耐鹽堿能力也有待深入探明。在鑒定不同品種種子抗性方面，萌發(fā)的相對指標如種子相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、相對根長等，應用廣泛，能夠反映種子抗性的強弱[23-24]。因此在本研究中，認為可以用以上相對指標作為紫花苜蓿種子萌發(fā)期抗性評價指標。

綜上所述，250 mmol·L-1的 NaCl和 25%PEG 能有效鑒定不同紫花苜蓿品種的抗旱耐鹽性強弱，供試的14個品種中，‘法多’、‘巨能995’和‘巨能551’的抗旱耐鹽性均較強?？蔀楦珊蝶}堿區(qū)紫花苜蓿品種的選用提供理論依據(jù)。