鄧永琦，羅 會(huì)，郭晴晴，呂愛平，何小鵑，耿 耘

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 成都 610031；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京 100700；3.香港浸會(huì)大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 香港 999077）

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）慢性疾病，主要由異常的自身免疫反應(yīng)引起；炎癥反應(yīng)、髓鞘脫失和神經(jīng)膠質(zhì)增生為MS 的主要病理特征[1,2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先天免疫細(xì)胞之一，具有抗原呈遞，病原體和壞死組織吞噬，細(xì)胞因子分泌的作用[3,4]。小膠質(zhì)細(xì)胞的極化和MS 的病情發(fā)展關(guān)系密切，M1 型方向極化可使病情加重，M2型方向極化有助于恢復(fù)病情[5]。但是，目前小膠質(zhì)細(xì)胞在MS 病變不同部位不同時(shí)間點(diǎn)的極化情況尚不明確，CNS 的病變過程也缺乏動(dòng)態(tài)研究。因此，為進(jìn)一步了解MS病程中的病理學(xué)變化，本實(shí)驗(yàn)使用C57 BL/6 小鼠建立進(jìn)展型EAE 模型。對(duì)小鼠病程進(jìn)展不同時(shí)間點(diǎn)的CNS 各部位進(jìn)行檢測(cè)，觀察髓鞘脫失、炎細(xì)胞浸潤(rùn)的改變，以及M1 型、M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50 只10-12 周齡的雌性C57BL/6 小鼠，購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)技術(shù)有限公司[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0011]，于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院動(dòng)物房[動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(京)2016-0021]飼養(yǎng)，溫度：20-25℃，相對(duì)濕度：40% -60% 。

1.1.2 試劑

完全弗氏佐劑（complete Freund's adjuvant，CFA），購(gòu)自美國(guó)Chondrex公司；多肽凍干粉MOG35-55（H-Met-Glu-Val-Gly-Trp-Tyr-Arg-Ser-Pro-Phe-Ser-Arg-Val-Val-His-Leu-Tyr-Arg-Asn-Gly-Lys-OH）,購(gòu)自上海強(qiáng)耀生物科技有限公司；百日咳毒素（PTX），購(gòu)自美國(guó)List Biological Laboratories 公司；Mayer 染液，HE 染色液，Luxol Fast Blue 髓鞘染色液，購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；iNOS 抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；Arg-1抗體，免疫組化二抗（HRP,Rabbit），DAB顯色試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology 公司；TRNzol 試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，SYBR?Premix Ex TaqTM購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 EAE造模與分組

將CFA 和400 mg·mL-1的MOG35-55多肽緩沖液以1∶1體積用量，制成抗原乳劑。于Day 0日在每只麻醉后的小鼠上腹部皮下注射乳劑0.2 mL；在Day 0、Day 2日均腹腔注射PTX 200 ng，以誘導(dǎo)小鼠進(jìn)展型EAE 模型[6]。據(jù)病程發(fā)展，將小鼠分為正常組、S1 組（發(fā)病點(diǎn)）、S2組（發(fā)病初期）、S3組（發(fā)病高峰期）和S4組（慢性持續(xù)期）5個(gè)組，并依次于Day 0、Day 14、Day 18、Day 24、Day 42取材。

1.2.2 臨床評(píng)分

Day 0起每日觀察小鼠狀態(tài)，每?jī)扇赵u(píng)分一次。臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]為沒有癥狀，記為0分；尾部張力降低，記為1 分；中度后肢無力，記為2 分；共濟(jì)失調(diào)或后肢癱瘓，記為3分；四肢完全癱瘓，記為4分；垂死狀態(tài)或死亡，記為5 分。發(fā)病情況處于中間情況的則以±0.5 分計(jì)，分高于0.5即被認(rèn)為發(fā)病。

1.2.3 取材

小鼠處死后取出完整大腦、腦干和脊柱，脊柱分別取頸段、胸段和腰段，剖出脊髓。組織固定于10% 中性甲醛48 h，中性磷酸鹽緩沖液沖洗后常規(guī)脫水操作，石蠟包埋制成蠟塊切片，厚度5μm，每20μm取一張，放入烤片機(jī)60℃烤干備用。

1.2.4 LFB 染色

每只小鼠取5 張切片常規(guī)脫蠟，以95% 乙醇溶液醇化后用LFB 染液覆蓋組織，4℃孵育過夜；染色后將切片分別用95% 乙醇和純水清洗，然后依次置于分化液、70% 乙醇中至著色情況良好，將切片脫水透明后封片。顯微鏡下拍片觀察，以盲評(píng)法對(duì)髓鞘脫失情況評(píng)分[7]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無脫失，計(jì)為0 分；罕見病灶，計(jì)為1分；幾個(gè)脫髓鞘的區(qū)域，計(jì)為2分；大面積脫髓鞘，計(jì)為3分。

表1 引物序列

1.2.5 HE染色

分別取每只小鼠各部位5 張切片，置于二甲苯及梯度乙醇中脫蠟，用蘇木素覆蓋組織染色10 min，用純水洗滌后，將組織用鹽酸乙醇分化，然后置于1% 伊紅中復(fù)染15 min，純水洗滌后于梯度乙醇脫水，二甲苯透明后用中性樹膠封片。在顯微鏡下拍攝組織以觀察炎癥，并通過盲評(píng)對(duì)組織炎癥進(jìn)行評(píng)分[8]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無炎癥細(xì)胞，計(jì)為0 分；少數(shù)分散的炎性細(xì)胞，計(jì)為1分；血管四周炎癥浸潤(rùn)，計(jì)為2分；在灰質(zhì)區(qū)，出現(xiàn)不完全炎性浸潤(rùn)或血管“袖套樣”浸潤(rùn)，計(jì)為3分。

1.2.6 IHC檢測(cè)

IHC檢測(cè)方法參照以下步驟進(jìn)行：烘烤切片后，脫蠟并水化，以檸檬酸緩沖液為介質(zhì)，采用高壓修復(fù)抗原；依次以3% H2O2溶液、3% BSA 溶液避光封閉1 h；再用稀釋好的一抗（iNOS，1∶1000；Arg-1，1∶1000）4℃反應(yīng)過夜，孵育二抗；用DAB 顯色，蘇木素復(fù)染；常規(guī)脫水透明后中性樹膠封片。用“Image-Pro Plus 6.0”軟件對(duì)顯微鏡200×鏡頭下所攝圖像處理，對(duì)每平方毫米的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行分析。

1.2.7 Real-Time PCR檢測(cè)

RNA 提取照TRNzol 試劑盒說明書進(jìn)行操作。測(cè)定總RNA濃度后，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。調(diào)整濃度后以cDNA為模板，配置PCR反應(yīng)體系，以內(nèi)參β-actin作為對(duì)照，引物序列（表1）。反應(yīng)條件為：首先熱變性，95℃30 s；擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)，95℃5 s，60℃退火10 s；溶解條件，95℃15 s，60 ℃1 min，95℃5 s。

圖1 進(jìn)展型EAE小鼠臨床評(píng)分

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 18.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示為平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差，采用單向Anova 分析組間差異。認(rèn)為P<0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 臨床評(píng)分

臨床評(píng)分結(jié)果（圖1），EAE 小鼠于造模后第14 天開始發(fā)病，于Day 24到達(dá)高峰期，隨后病情稍有好轉(zhuǎn)，進(jìn)入慢性持續(xù)期，臨床評(píng)分維持在3分左右。

2.2 LFB染色結(jié)果

LFB染色結(jié)果顯示正常小鼠脊髓白質(zhì)均勻呈深藍(lán)色，白質(zhì)與灰質(zhì)的界限清晰可見；在模型組中，脊髓白質(zhì)區(qū)域染色不均，出現(xiàn)白斑區(qū)域，髓鞘脫失（圖2）。隨著疾病的發(fā)展，小鼠脊髓不同部位的髓鞘脫落逐漸嚴(yán)重；同時(shí)期以腰髓段的髓鞘脫失最嚴(yán)重。

2.3 HE染色結(jié)果

圖2 進(jìn)展型EAE小鼠不同時(shí)間點(diǎn)CNS不同部位髓鞘染色結(jié)果（50×）

圖3 進(jìn)展型EAE小鼠不同時(shí)間點(diǎn)CNS不同部位HE染色結(jié)果（50×）

HE染色結(jié)果顯示，正常組小鼠CNS各部位著色均勻，組織排列正常，無炎細(xì)胞浸潤(rùn)；在各模型組中，炎細(xì)胞出現(xiàn)，并逐漸滲透至血管周圍，甚至灰質(zhì)部位出現(xiàn)血管“袖套樣”浸潤(rùn)（圖3）。在進(jìn)展型EAE 的發(fā)病過程中，小鼠CNS 各部位炎細(xì)胞浸潤(rùn)均于發(fā)病點(diǎn)出現(xiàn)，隨疾病進(jìn)展逐漸加重，于慢性持續(xù)期趨于穩(wěn)定。同一時(shí)期不同發(fā)病部位的炎細(xì)胞浸潤(rùn)程度略有差異，相對(duì)于大腦和腦干，脊髓部位的炎細(xì)胞浸潤(rùn)更為嚴(yán)重。

2.4 M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞變化

以iNOS 特異性標(biāo)記小鼠CNS 中M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞。IHC 結(jié)果顯示，正常組小鼠CNS 各部位有少量的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞；模型組小鼠CNS各部位均發(fā)現(xiàn)大量M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤(rùn)。在EAE 發(fā)病后的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)，M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸增加；相對(duì)大腦和腦干，脊髓部位的M1 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量更多，其中以腰髓段最多（圖4）。

2.5 M2型小膠質(zhì)細(xì)胞變化

以Arg-1 特異性標(biāo)記小鼠CNS 中M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞。IHC 結(jié)果顯示，在EAE 模型小鼠的發(fā)病過程中，CNS各部位的M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量先增加后減少，它在發(fā)病高峰時(shí)達(dá)到最大值，并在慢性持續(xù)時(shí)間內(nèi)顯著下降。從病變部位來看，脊髓中M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比多于大腦、腦干部位；在脊髓不同部位中，腰髓段M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量最多（圖5）。

圖4 進(jìn)展型EAE小鼠M1型小膠質(zhì)細(xì)胞IHC結(jié)果（200×）

2.6 Real-Time PCR結(jié)果

腰髓部位M1 型和M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白iNOS、Arg-1以及相關(guān)炎癥因子TNF-α、IL-4的轉(zhuǎn)錄水平（圖6）。相對(duì)正常組小鼠，iNOS，TNF-α的mRNA 水平隨病程進(jìn)展逐漸增加；Arg-1，IL-4 的mRNA 水平相對(duì)正常小鼠則呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，于發(fā)病高峰期出現(xiàn)最大值，在慢性持續(xù)期略有下降。

3 討論

圖5 進(jìn)展型EAE小鼠M2型小膠質(zhì)細(xì)胞IHC結(jié)果（200×）

常用的EAE 模型有多種，而MOG35-55多肽誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立的模型因病理特點(diǎn)與進(jìn)展型多發(fā)性硬化最為相似，故成為臨床最常用的模型[9]。成功建立該模型與免疫方法密切相關(guān)，而乳劑制備與免疫部位的選擇至關(guān)重要。配制乳劑時(shí)先加入CFA 再逐滴加入MOG35-55多肽緩沖液，更易乳化充分；而免疫部位通常有后肢足掌、尾部和側(cè)腹部，注射部位的不同對(duì)臨床病程、高峰期、最高臨床評(píng)分等影響不同，據(jù)實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，選擇上腹部皮下注射能更好地模擬進(jìn)展型多發(fā)性硬化的發(fā)病過程。

本實(shí)驗(yàn)研究了小鼠CNS 不同部位在疾病發(fā)展中組織病理學(xué)變化和M1、M2 型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果顯示隨疾病進(jìn)展，髓鞘脫落和炎細(xì)胞浸潤(rùn)持續(xù)惡化，腰髓段的髓鞘脫落更為嚴(yán)重，而脊髓部位的炎細(xì)胞浸潤(rùn)更嚴(yán)重。小膠質(zhì)細(xì)胞作為CNS 內(nèi)常駐的免疫細(xì)胞，受到刺激后，細(xì)胞表型發(fā)生改變，并增殖聚集在病灶部位，分泌多種細(xì)胞因子[10]。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，能特異性表達(dá)iNOS 蛋白，產(chǎn)生TNF-α，IFN-γ等促炎因子，發(fā)生神經(jīng)毒性反應(yīng)；M2型小膠質(zhì)細(xì)胞，能特異性表達(dá)Arg-1蛋白，產(chǎn)生抗炎因子如IL-4和TNF-β，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[11-13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨病情發(fā)展M1型小膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤(rùn)增加，而M2 型的浸潤(rùn)先增加后減少，兩者均在腰髓段浸潤(rùn)最多。

圖6 進(jìn)展型EAE小鼠各組腰髓Real-Time PCR結(jié)果圖

當(dāng)前對(duì)MOG35-55誘導(dǎo)的進(jìn)展型EAE 模型的研究，多集中在模型建立的方法及影響因素、發(fā)病部位的病理變化以及相關(guān)免疫細(xì)胞在病程中的動(dòng)態(tài)變化[14-16]。通過本實(shí)驗(yàn)，可對(duì)該模型CNS 不同部位組織病理學(xué)的動(dòng)態(tài)變化和兩種表型的小膠質(zhì)細(xì)胞在各發(fā)病階段的激活過程有更清楚的了解，可作為進(jìn)一步研究進(jìn)展型MS的病理機(jī)制的基礎(chǔ)依據(jù)，以期對(duì)藥物篩選以及療效評(píng)價(jià)提供參考。同時(shí)，由于MS 發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，其病變過程又與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)以及神經(jīng)毒性反應(yīng)等各方面均有密切關(guān)系，使得本實(shí)驗(yàn)對(duì)該模型的全面認(rèn)識(shí)存在一定局限性，但這也成為了今后繼續(xù)研究的方向。