劉迎輝，成光宇，李雙娣，李洪禹，趙 妍，張 嬌，劉愛東

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 長春 130021；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三臨床醫(yī)院 長春 130117）

冠心病心絞痛是臨床的常見病、高發(fā)病，其發(fā)生與高血壓、高血脂、內(nèi)分泌功能低下以及年齡等因素密切相關(guān)。高脂血癥可導(dǎo)致血液粘稠，血液流變學(xué)發(fā)生改變，血小板聚集性增強，從而誘發(fā)粥樣斑塊形成，形成動脈粥樣硬化，引起心肌急劇缺血、缺氧，進而發(fā)為本病，而其證型則以血瘀證最為多見。該證型系由多種原因?qū)е卵哼\行遲緩，甚則瘀血內(nèi)阻，致血行不暢，以固定刺痛、腫塊、出血色紫暗為主要表現(xiàn)，可見于多種疾病發(fā)展過程中，其中尤以心腦血管疾病較為多見[1-3]。因此改善血液“濃、粘、凝、聚”的狀態(tài)，預(yù)防血栓形成，是防治冠心病的關(guān)鍵[4-6]。宣痹通瘀膠囊為擬研制開發(fā)的治療氣滯血瘀型冠心病心絞痛（胸痹心痛）的中藥復(fù)方新藥，是國家級名中醫(yī)、著名心血管病專家黃永生教授的經(jīng)驗方，臨床療效顯著。本文將通過實驗研究的方法觀察宣痹通瘀膠囊對實驗性大鼠血液流變學(xué)、體內(nèi)動脈血栓及體外動-靜脈旁路血栓形成的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

SPF 級Wistar 大鼠160 只，雌、雄各半(250-270 g)，購自長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司（生產(chǎn)許可證號：SCXK-(吉)2011-0004）。實驗大鼠于SPF屏障環(huán)境中喂養(yǎng)，采用大鼠專用飼料，保證大鼠食水充足及環(huán)境衛(wèi)生。動物實驗方案符合實驗動物福利倫理的相關(guān)規(guī)定（批準(zhǔn)編號：20180103）。

1.2 實驗藥物

①實驗藥物為宣痹通瘀膠囊，每粒膠囊含生藥4.03 g（批號：20141201），由長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實驗研究中心提供。宣痹通瘀膠囊按新的制備工藝進行制備，0.3 克/粒，按照藥物出膏率的30% 計算，正常人每日用藥40粒/天，按照人與大鼠體表面積核算，低、中、高劑量組分別為0.8 g·kg-1、1.6 g·kg-1、3.2 g·(kg·d)-1[7]。

②陽性對照藥為通心絡(luò)膠囊，每粒膠囊含生藥0.26 g（批號：國藥準(zhǔn)字Z19980015），生產(chǎn)企業(yè)為石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司。

1.3 主要試劑及儀器

鹽酸腎上腺素注射液（遂成藥業(yè)，批號：1507251）；烏來糖（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，批號:T20100310）；肝素鈉（上海惠世生化試劑有限公司，批號：20141105）；血液流變測試儀（北京博萊特醫(yī)藥技術(shù)有限公司，型號：BT-300）；臺式高速低溫離心機（德國賀利氏公司，型號：Biofuge Stratos）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司產(chǎn)品，型號：SQP）；交直流電子計數(shù)計重兩用秤（中國凱豐集團有限公司，型號：KF-H2）；實驗性體內(nèi)血栓形成測定儀（包頭醫(yī)學(xué)院心血管研究室產(chǎn)品，型號：BT87-3）。

2 實驗1：宣痹通瘀膠囊對血瘀模型大鼠血液流變學(xué)影響的實驗研究

2.1 實驗方法

2.1.1 動物分組及給藥

實驗大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、血瘀模型組、陽性對照藥通心絡(luò)膠囊組、宣痹通瘀膠囊高、中、低劑量組，共6組，每組10只，雌、雄各半。給藥前，將宣痹通瘀膠囊內(nèi)容物用0.5% 羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl cellulose sodium Na，CMC-Na）配制成320 g·L-1、160 g·L-1和80 g·L-1三個濃度的懸液；陽性對照藥通心絡(luò)膠囊內(nèi)容物用0.5% CMC-Na配制成24 g·L-1的懸液，給受試動物灌服。不同劑量組之間采用不同濃度、相同體積的給藥方法，灌胃體積均為10 毫升·（千克·次）-1。每天上午灌胃給藥1次，連續(xù)7 d?？瞻捉M與模型組動物給予等體積10 毫升·（千克·次）-10.5% CMC-Na懸液灌胃。

2.1.2 血瘀證模型的復(fù)制方法

于末次給藥后1 h，除空白組外，其余各組動物均經(jīng)皮下注射鹽酸腎上腺素注射液（1 mg·kg-1體重）。2 h后，將動物放入4 ℃冰水中浸泡5 min取出。過2 h后，再次皮下注射相同劑量的鹽酸腎上腺素。

2.1.3 指標(biāo)檢測

禁食20 h 后，腹腔注射20% 烏來糖（5 mL·kg-1體重）將動物麻醉，經(jīng)腹主動脈取血3 mL，以0.1% 肝素抗凝。取其中1 mL 全血用血液流變儀檢測不同切變率的全血黏度，包括高切變率（100·s-1）、中切變率（30·s-1）、低切變率（3·s-1）；其余抗凝血液離心15 min，取血漿1 mL用血液流變儀檢測血漿黏度。

2.1.4 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，各項檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)表示，統(tǒng)計學(xué)處理方法采用單因素方差分析。

2.2 實驗結(jié)果

經(jīng)過冰水浸泡刺激再加兩次（冰水浸泡前和浸泡后）皮下注射腎上腺素后，血瘀模型組動物的全血低切黏度（3·s-1）、全血中切黏度（30·s-1）、全血高切黏度（100·s-1）和血漿黏度均明顯高于空白組（P< 0.05 或P<0.01），表現(xiàn)出血瘀證所特有的“濃、黏、凝、聚”的血液流變學(xué)特征。該血瘀證模型動物經(jīng)宣痹通瘀膠囊預(yù)防性給藥后，其中高劑量和中劑量給藥組動物的全血低切黏度（3·s-1）、中切黏度（30·s-1）、高切黏度（100·s-1）和血漿黏度均明顯低于模型組（P<0.05）；宣痹通瘀膠囊低劑量給藥組和陽性對照組動物的全血低切黏度（3·s-1）、高切黏度（100·s-1）和血漿黏度也均明顯低于血瘀模型組（P<0.05）。（表1）

3 實驗2：宣痹通瘀膠囊對大鼠體內(nèi)動脈血栓形成的影響

3.1 實驗方法

3.1.1 動物分組及給藥

實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為模型組、陽性對照藥通心絡(luò)膠囊組、宣痹通瘀膠囊高、中、低劑量組，共5組，每組10只，雌、雄各半。各組給藥的方法和劑量同實驗1（宣痹通瘀膠囊對血瘀模型大鼠血液流變學(xué)影響的實驗研究）。

3.1.2 電刺激血栓形成方法

于末次給藥后30 min，用20% 烏來糖溶液以5 mL·kg-1體重腹腔注射將動物麻醉。背位固定于鼠板上，切開頸部皮膚，剝離左側(cè)頸總動脈，在動脈近心端下放置刺激電極，在遠心端下放溫度探頭。打開儀器開關(guān)，設(shè)置電剌激參數(shù)，通過刺激電極給予2 mA直流電刺激5 min。當(dāng)儀器報警時，記錄從刺激開始至報警時間即為動物體內(nèi)動脈血栓形成所用時間（s）。

表1 宣痹通瘀膠囊對血瘀模型大鼠全血低切黏度、中切黏度、高切黏度和血漿黏度的影響

注：與空白組比較，#P<0.05；##P<0.01；與血瘀模型組比較，*P<0.05；**P<0.01。

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3.1.3 指標(biāo)檢測

觀察、比較各組動物因電刺激頸總動脈而導(dǎo)致局部動脈血栓形成的時間。

3.1.4 統(tǒng)計方法

應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差s)表示，統(tǒng)計學(xué)處理方法采用單因素方差分析。

3.2 實驗結(jié)果

宣痹通瘀膠囊高劑量組、中劑量組和陽性對照組動物的體內(nèi)血栓形成時間均明顯高于模型組（P<0.05）；宣痹通瘀膠囊低劑量組動物體內(nèi)血栓形成所需時間與模型組比較雖無顯著性差異，但也有一定的延長體內(nèi)動脈血栓形成的作用趨勢。表明宣痹通瘀膠囊對電刺激動脈所致的血栓形成具有明顯的抑制作用（表2）。

4 實驗3：宣痹通瘀膠囊對大鼠體外動-靜脈旁路血栓形成的影響

4.1 實驗方法

4.1.1 動物分組及給藥

實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為模型組、陽性對照藥通心絡(luò)膠囊組、宣痹通瘀膠囊高、中、低劑量組，共5組，每組10只，雌、雄各半。各組給藥的方法和劑量同實驗1。

4.1.2 血栓形成及測試方法

準(zhǔn)備內(nèi)徑1 mm，長10 cm聚乙烯管2根；內(nèi)徑2 mm，長8 cm 聚乙烯管1 根。將兩根內(nèi)徑1 mm 聚乙烯管分別套接于內(nèi)徑2 mm的聚乙烯管上，同時在粗管段上放入1根5 cm長的4號手術(shù)絲線，絲線固定端方向為動脈血流方向。于末次給藥后1 h，以20% 烏來糖按5 mL·kg-1體重腹腔注射將動物麻醉，仰位固定于鼠板上，頸部正中切口，剝離氣管、右側(cè)頸總動脈、左側(cè)頸外靜脈。先做氣管插管，以保持呼吸氣流通暢。然后分別進行血栓管插管（管內(nèi)預(yù)先充滿肝素生理鹽水）。先將一端插入靜脈，插入后從插管注射肝素5 U·kg-1。另一端插入頸動脈。開啟動脈，血流由動脈端流入頸靜脈。15 min后中斷血流，取出絲線用電子天秤稱量血栓濕重，總重量減去絲線重量即為血栓濕重。將血栓在室溫環(huán)境下放置24 h自然干燥后，稱量血栓干重。

表2 宣痹通瘀膠囊對電刺激頸總動脈所引起的大鼠體內(nèi)動脈血栓形成的影響

表2 宣痹通瘀膠囊對電刺激頸總動脈所引起的大鼠體內(nèi)動脈血栓形成的影響

注：*與模型組比較，P<0.05。

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4.1.3 指標(biāo)檢測

以各組動物在動-靜脈旁路狀態(tài)下所形成的體外血栓濕重和血栓干重為檢測指標(biāo)，分別對各組動物動脈血栓的濕重和干重進行統(tǒng)計對比。

4.1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，檢測數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)處理方法采用單因素方差分析。

4.2 結(jié)果

經(jīng)手術(shù)造成大鼠體外動-靜脈旁路血液循環(huán)路徑后，各實驗組所形成的體外血栓干重和血栓濕重明顯不同。其中，宣痹通瘀膠囊高劑量組動物形成的體外血栓濕重和血栓干重均明顯低于模型組（P<0.05）；宣痹通瘀膠囊中劑量組、低劑量組和陽性對照組動物形成的體外血栓干重均明顯低于模型組（P<0.05）。表明宣痹通瘀膠囊對大鼠動脈-靜脈旁路促發(fā)的血栓形成具有非常明顯的抑制作用（表3）。

表3 宣痹通瘀膠囊對大鼠體外動-靜脈旁路血栓形成的影響

表3 宣痹通瘀膠囊對大鼠體外動-靜脈旁路血栓形成的影響

注：與模型組比較，*P<0.05

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5 討論

在臨床上，中醫(yī)學(xué)對血瘀的發(fā)生有著成熟的理論認(rèn)知，認(rèn)為“血得溫則行，得寒則凝”，故寒凝可導(dǎo)致血瘀。此外，腎上腺素能激活α和β兩類受體，引起外周血管強烈收縮，心功能下降，心臟后負荷增加，進而出現(xiàn)血液循行障礙，出現(xiàn)全血黏度異常、血漿黏度異常等類似瘀血“濃、粘、凝、聚”狀態(tài)的病理改變。故本實驗通過“寒凝加皮下注射腎上腺激素”的復(fù)合方法建立血瘀證動物模型。這種造模方法成功率高，血瘀證血液流變學(xué)指標(biāo)的變化更為確定，具有較高的可重復(fù)性，是一個較好的造模方法[8-11]。實驗結(jié)果表明，宣痹通瘀膠囊可明顯降低血瘀模型大鼠的全血黏度和血漿黏度，對血瘀證的血液流變學(xué)特征具有明顯改善作用。

在活體的心血管系統(tǒng)中，流動的血液因某些因素，如血管損傷,血管內(nèi)皮受損等，引起血小板聚集和活化反應(yīng)，激活凝血系統(tǒng),導(dǎo)致促進血栓形成的多種生物活性因子同時釋放,使血液發(fā)生凝固,進而形成血栓。血栓的形成是導(dǎo)致心血管疾病的主要誘因之一。本實驗通過電刺激實驗性大鼠的頸總動脈，激活外源性凝血系統(tǒng)復(fù)制大鼠體內(nèi)血栓模型。動靜脈旁路血栓的造模方法是在動靜脈短路情況下，激活血液凝固因子和血小板，在絲線上形成的模擬病態(tài)的混合血栓。實驗結(jié)果顯示宣痹通瘀膠囊對電刺激動脈所致的大鼠體內(nèi)動脈血栓以及大鼠動脈-靜脈旁路血栓均具有明顯的抑制作用，具有降低總血栓風(fēng)險的作用[12-15]。

宣痹通瘀膠囊組方針對冠心病“虛氣留滯”的病機特點，取其“邪盛難掩本虛”之本義，治標(biāo)勿忘固本，活血與行氣相伍,行氣與補氣同施[16]。全方由六味中藥組成，包括：延胡索（酒炙）、三七、川芎、郁金、人參、冰片。其中延胡索為君藥，具有活血化瘀、行氣止痛的功效，早在《雷公炮炙論》就有“心痛欲死，速覓延胡索”的論述，是治療心血管疾病的臨床常用藥物。三七、川芎、郁金三藥共為臣藥，能夠助君藥活血行氣，化瘀止痛；方中人參具有佐助和佐制雙重功效，既可補氣生血、固護正氣，還能防止君、臣藥因克伐太過而耗傷正氣；冰片善于走散，在方中亦為佐藥[17-19]。本實驗研究所選用的對照藥物是與宣痹通瘀膠囊的功效、主治相近，藥物劑型及給藥途徑均相似的通心絡(luò)膠囊，實驗結(jié)果顯示，宣痹通瘀膠囊高劑量組對血瘀證動物模型的血液流變學(xué)及大鼠總血栓的治療效果優(yōu)于通心絡(luò)膠囊，而宣痹通瘀膠囊中劑量組的治療效果和通心絡(luò)膠囊接近，宣痹通瘀膠囊低劑量組的治療效果不及通心絡(luò)膠囊。宣痹通瘀膠囊的治療效果體現(xiàn)了一定的量效性[20]。

在前期進行的“宣痹通瘀膠囊對大鼠長期毒性試驗研究”中，發(fā)現(xiàn)在26周給藥期內(nèi)，低劑量組（0.8 g·kg-1）大鼠無毒性反應(yīng)；中劑量組（1.6 g·kg-1）少部分動物出現(xiàn)被毛蓬松、體重增長略有減緩的現(xiàn)象；高劑量組（3.2 g·kg-1）產(chǎn)生的毒性反應(yīng)為一般狀態(tài)差、體重增長減緩，停藥后，上述毒性反應(yīng)緩解消失，無延遲性毒性反應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)明確的毒性靶器官。對動物體重增長及攝食量的影響不能確定為供試品毒性反應(yīng)。故宣痹通瘀膠囊高劑量為其安全劑量且療效最佳。

本實驗從藥效學(xué)的角度驗證了通過宣痹通瘀膠囊的預(yù)防性給藥能夠降低血瘀模型大鼠的全血黏度和血漿黏度，對血栓的形成有一定抑制作用。下一步將繼續(xù)通過實驗研究驗證宣痹通瘀膠囊的治療性給藥對大鼠血液流變學(xué)及血栓形成的影響，并從分子生物學(xué)的角度進一步探討藥物的作用機制。