李 黎，吳勉華，周紅光，李沐涵，李文婷，季 漪，馬艷霞，雒慧娟

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 南京 210023）

2018年2月國(guó)家癌癥中心發(fā)布了最新一期的全國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)[1]，肝癌已經(jīng)成為我國(guó)繼肺癌、胃癌、結(jié)直腸癌之后，發(fā)病率排名第四的癌癥；死亡率居惡性腫瘤第二位。肝癌早期癥狀不明顯，一旦發(fā)現(xiàn)，大多屬于晚期，目前肝癌的治療首選手術(shù)治療（肝移植、肝切除），此外介入治療、消融治療、化療、靶向治療等方法也多為臨床應(yīng)用[2]，但復(fù)發(fā)率高，根治不徹底，治療類(lèi)型有限，存在費(fèi)用昂貴等方面的問(wèn)題仍是肝癌治療中的難題[3]。中醫(yī)藥在腫瘤治療中正發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用，主要體現(xiàn)在減輕副作用，改善患者癥狀，提高生存質(zhì)量等方面[4]。

國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授認(rèn)為腫瘤的發(fā)生主要?dú)w結(jié)于癌毒致病，正氣虧虛，肝癌的主要病理因素為濕熱瘀毒結(jié)聚，治療以清化濕熱、化瘀解毒為主，在此基礎(chǔ)上加用散結(jié)消癥之品。消癌解毒方主要有白花蛇舌草、僵蠶、蜈蚣、麥冬等藥組成，為周仲瑛教授臨床常用經(jīng)驗(yàn)方；經(jīng)臨床實(shí)踐證明，本方配合化療治療中晚期惡性腫瘤，與單純化療相比，合用組患者CD3+、CD4+及NK 活性顯著升高，證明使用消癌解毒方配合化療可顯著提高患者抗腫瘤免疫能力，使患者化療完成率顯著提高，生活質(zhì)量明顯改善[5]。H22 腫瘤細(xì)胞株屬小鼠的肝細(xì)胞瘤，1963 年由上海藥物研究所引進(jìn)，變成腹水型瘤株。H22荷瘤小鼠是將腹水型H22 肝癌細(xì)胞種與ICR小鼠腋下造成的移植瘤小鼠模型，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)H22 細(xì)胞生物特性、免疫學(xué)等方面做了深入的研究，其移植瘤模型用于腫瘤研究及藥物篩選已經(jīng)被廣泛認(rèn)可[6]。已有實(shí)驗(yàn)研究證明[7]，該方能夠通過(guò)多通路、多途徑影響H22 荷瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)，凋亡及移植小鼠的免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。本實(shí)驗(yàn)主要探討消癌解毒方對(duì)腫瘤血管生成的影響，進(jìn)一步探討其抗腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)ICR 小鼠，雄性，體質(zhì)量18±2 g。購(gòu)自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK（蘇）2015-0001；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證SYXK（蘇）2014-0001。南京市鼓樓醫(yī)院科研中心提供H22瘤株種鼠。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

白花蛇舌草、太子參、蜈蚣、僵蠶等中藥購(gòu)自安徽省亳州市中西藥有限公司，由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳皓教授鑒定，消癌解毒方共81 g，煎煮2 次，第一次煎煮前，加水8 L，浸泡飲片1 h，加熱回流提取2 h，收集提取液；提取物殘?jiān)鋮s降溫，加6 L 水，加熱回流提取2 h，收集提取液。兩次提取液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，至含生藥量2 g·L-1，-20℃保存；注射用順鉑20毫升/支(齊魯制藥有限公司)。

1.3 主要試劑

Trizol ( 美 國(guó)invitrogen，批 號(hào)：115596- 026)；Ribonuclease Inhibitor ( 美 國(guó)life technology，批 號(hào)：c10777000)；MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶（TAKARA，批號(hào)：TRT-101）；qPCR Master Mix（南京諾唯贊，批號(hào)：Q111-02/03）；VEGF 抗體、（Santa Cruze，批號(hào)：sc-7269）；TGF-β抗體（Cell Signaling Technology，批號(hào)：4），MMP2 抗體、CXCL2 抗體（Abcam，批號(hào)：ab37150、ab9777）；各引物有上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1；VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2 Elisa 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：EK0541、EK0460、EK0515、EK0542）；

1.4 主要儀器

超微量生化分光光度計(jì)（ScanDrop，analytikjena）；穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（DYY-8，北京六一儀器廠）；微型電泳槽（H6-1，上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠）；Realtime 實(shí) 時(shí) 定 量PCR 儀（Quant Studio 5，life technology）；酶標(biāo)儀（Tecan Spark 10M）。

表1 Realtime-PCR引物列表

2 方法

2.1 H22荷瘤小鼠移植瘤模型制備及分組

H22 荷瘤種鼠由南京鼓樓醫(yī)院贈(zèng)送，碘酒消毒腹部，抽取0.2 mL種鼠腹水接種至2只小鼠腹腔，待長(zhǎng)出腹水，每鼠抽取0.2 mL，接種至4只小鼠腹腔。無(wú)菌條件下抽取所有腹水瘤小鼠的腹水，以無(wú)菌生理鹽水稀釋?zhuān)x心，重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108ml-1，每只ICR小鼠右腋下接種0.2 mL的細(xì)胞懸液。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥方法

小鼠接種瘤細(xì)胞3 d后，開(kāi)始分組給藥，隨機(jī)分為空白組，陽(yáng)性藥（即順鉑組），治療組（即消癌解毒方低、中、高劑量組），每組10只。其中空白組每日灌胃生理鹽水，根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》換算消癌解毒方給藥劑量，陽(yáng)性藥組每日順鉑組腹腔注射（1 mg·kg-1）治療組每日灌胃低、中、高劑量消癌解毒方（10 g·kg-1、30 g·kg-1、90 g·kg-1）每天給藥1次，連續(xù)給藥10 d。

2.3 移植瘤的腫瘤抑制作用

給藥10 d后，次日處死小鼠，分別稱(chēng)取各組小鼠體質(zhì)量、各組瘤塊重量，計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率（% ）=（空白組瘤體質(zhì)量－給藥各組瘤體質(zhì)量）/空白組瘤體質(zhì)量×100% 。

2.4 全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)

每組取一個(gè)瘤體樣本，送至上海康成生物工程有限公司，做全集因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)。使用Agilent 芯片掃描儀掃描芯片信號(hào)，收集數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)根據(jù)空白組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計(jì)算各給藥組相對(duì)于空白組的fold change（實(shí)驗(yàn)組標(biāo)記信號(hào)/空白組標(biāo)記信號(hào)），其中fold change ≥2 者標(biāo)記為表達(dá)顯著上調(diào)基因，F(xiàn)old change ≤0.5為表達(dá)顯著下調(diào)基因。

表2 消癌解毒方對(duì)小鼠H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用(n=10±s)

表2 消癌解毒方對(duì)小鼠H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用(n=10±s)

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

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表3 STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2全基因芯片檢測(cè)結(jié)果

2.5 各組小鼠血清VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2因子的檢測(cè)

給藥10 d 后，次日處死小鼠，各組小鼠眼眶取血，室溫靜置2 h，3000 r ?min-1離心10 min，收集上清，每組取3個(gè)血清樣本，按照Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 各組腫瘤組織STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2基因的表達(dá)

每組隨機(jī)抽取3個(gè)瘤體樣本，稱(chēng)量瘤體重量，加入適量的TRIZOL試劑，制備RNA樣本；引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1；使用樣品的RNA 進(jìn)行cDNA 合成；制備用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的梯度稀釋DNA模板；將配置的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng).

2.7 western blot法測(cè)定STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2蛋白表達(dá)

各組取3個(gè)腫瘤組織樣本，MP組織處理器破碎各腫瘤組織，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，用裂解緩沖液將各組蛋白稀釋至相同濃度，加入一定量的上樣緩沖液，并煮沸5 min，10% SDS-PAGE 凝膠電泳，電泳結(jié)束后，采用半干法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2按照說(shuō)明書(shū)1∶1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜，二抗按照說(shuō)明書(shū)1∶5000 稀釋?zhuān)覝胤跤? h，化學(xué)發(fā)光法曝光條帶，采用Image Lab進(jìn)行條帶分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0 軟件進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，各組間的數(shù)據(jù)比較采用One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 消癌解毒方對(duì)H22荷瘤小鼠移植瘤的抑制作用

與空白組比較，消癌解毒方低、中、高劑量組、順鉑組H22 荷瘤小鼠移植瘤瘤重降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示消癌解毒方灌胃給藥對(duì)H22小鼠移植瘤具有較好的抑制作用，空白組瘤體重1.187 ±0.259 g，表示腫瘤模型成功。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

4.2 全基因組芯片檢測(cè)結(jié)果

本次基因芯片共檢測(cè)41000 條基因，相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)發(fā)表在中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志[7]。對(duì)芯片檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，CXCL2、VEGF基因在消癌解毒方低劑量組為表達(dá)下調(diào)基因，MMP2、TGF-β、CXCL2基因在消癌解毒方中劑量組為表達(dá)下調(diào)基因，STAT1基因在消癌解毒方的高劑量組為表達(dá)上調(diào)基因，MMP2、CXCL2基因在消癌解毒方的高劑量組為表達(dá)下調(diào)基因，各基因的具體上調(diào)/下調(diào)結(jié)果（表3）。

4.3 各組VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2 細(xì)胞因子的檢測(cè)

與空白組比較，消癌解毒方低、中、高劑量組及順鉑組血清VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2細(xì)胞因子含量顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

4.4 各組腫瘤組織STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2基因的表達(dá)

與空白組比較，STAT1基因在消癌解毒方各劑量組及順鉑組瘤體中表達(dá)上調(diào)，VEGF、MMP2、CXCL2基因在各消癌解毒方及順鉑組組瘤體中表達(dá)下調(diào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05，P<0.01），TGF-β基因在消癌解毒方低、中劑量及順鉑組表達(dá)顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01），TGF-β在消癌解毒方高劑量組中表達(dá)降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 消癌解毒方對(duì)VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2細(xì)胞因子的影響

表5 各組目的基因表達(dá)的相對(duì)差異(n=

表5 各組目的基因表達(dá)的相對(duì)差異(n=

注：與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01。

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4.5 各組腫瘤組織STAT1、VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2蛋白的表達(dá)

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，消癌解毒方不同劑量組均可STAT1 蛋白的表達(dá)升高，VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2的蛋白表達(dá)降低，差異極顯著（P< 0.01），各組蛋白條帶及分析結(jié)果見(jiàn)圖1 及表6。

5 討論

《黃帝內(nèi)經(jīng)》中根據(jù)臨床表現(xiàn)及病因病機(jī)，將肝癌據(jù)歸為中醫(yī)“癥瘕”、“積聚”、“脅痛”等范疇，國(guó)醫(yī)大師周仲瑛教授認(rèn)為[8]，正氣虧虛為肝癌發(fā)病基礎(chǔ)，氣虛則血瘀，瘀滯日久則結(jié)與肋下，形成結(jié)塊，導(dǎo)致脅痛、胸悶等癥；在治療中周老注重標(biāo)本兼施，抗癌解毒，扶正驅(qū)邪藥物同用，臨床取得良好療效。

圖1 各組相關(guān)蛋白的表達(dá)

STAT1 是首先被發(fā)現(xiàn)的STATs 家族成員，作為潛在的轉(zhuǎn)錄因子，能夠被干擾素（IFNs）以及其他多種信號(hào)分子激活[9]，STAT1 被激活以后，主要參與細(xì)胞的增殖、凋亡，被認(rèn)為是一種抑癌基因，在腫瘤治療中，因此STAT1也被認(rèn)為是一種新的治療靶點(diǎn)[10,11]。Parkin等[12]學(xué)者研究認(rèn)為，VEGF能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化、增殖、遷移能力，增加腫瘤組織氧供應(yīng)，形成纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ/STAT1 信號(hào)激活，可以抑制VEGF的生物活性，從而抑制血管生成，同時(shí)在發(fā)展期的胰腺癌研究中發(fā)現(xiàn)，STAT1 表達(dá)的缺失可以增加VEGF的表達(dá)水平，從而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，侵襲以及轉(zhuǎn)移[13]。在血管新生早期，基底膜降解，使腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)和遷移是必要步驟，VEGF 可通過(guò)活化內(nèi)皮細(xì)胞釋放蛋白水解酶，從而促進(jìn)基質(zhì)降解，促進(jìn)腫瘤的迅速發(fā)展。同時(shí)MMPs通過(guò)激活、降解細(xì)胞外基質(zhì)，釋放更多的VEGF。VEGF 與MMPs 相互作用，迅速促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。MMP2 降解Ⅳ型膠原最主要的酶，通過(guò)降解基質(zhì)，可以釋放更多的生長(zhǎng)因子，既促進(jìn)了MMPs 的合成，也上調(diào)了VEGF 的功能[14]。TGF-β是具有生長(zhǎng)功能的多肽類(lèi)細(xì)胞因子，以多種形式參與血管生成、細(xì)胞分化及轉(zhuǎn)移等。在腫瘤組織中低濃度TGF-β作為血管生成因子促進(jìn)了腫瘤組織新生血管的形成，調(diào)節(jié)了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的旁分泌功能，促進(jìn)生成了內(nèi)皮細(xì)胞和毛細(xì)血管腔，良好的促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境[15]，同時(shí)TGF-Β可以通過(guò)多種途徑增強(qiáng)其誘導(dǎo)腫瘤血管生成的作用，因此TGF-β或許也可以成為新的腫瘤治療靶點(diǎn)[16]。CXC類(lèi)趨化因子具有促進(jìn)腫瘤血管生成的作用，包括CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、CXCL7 和CXCL8，這些趨化因子可直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)血管生成，從而介導(dǎo)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[17]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CXCL2 主要在腫瘤及感染的炎癥反應(yīng)期高表達(dá)，從而募集更多的中性粒細(xì)胞，這些中性粒細(xì)胞可以合成和釋放大量的與血管生成相關(guān)的因子，如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子等，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[18]。

表6 消癌解毒方對(duì)H22小鼠移植瘤中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

對(duì)于全基因組芯片結(jié)果的分析，主要研究了STAT1基因以及與腫瘤血管生成相關(guān)的基因的改變，并挑選了表達(dá)差異顯著的VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明消癌解毒方作用能夠上調(diào)抑癌基因STAT1及蛋白的表達(dá)，降低VEGF、MMP2、TGF-β、CXCL2基因及蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤血管生成相關(guān)的基因及蛋白的表達(dá)。中醫(yī)對(duì)腫瘤的病機(jī)認(rèn)識(shí)中，正氣虧虛是基礎(chǔ)，由此才發(fā)生痰、瘀、毒等實(shí)質(zhì)，有學(xué)者認(rèn)為癌毒邪蓄積是腫瘤血管生成的前提，正氣虛損是腫瘤血管生成的內(nèi)在因素，瘀血內(nèi)結(jié)則是其主要病理變化。因此，解毒、扶正、活血等是中醫(yī)藥調(diào)控腫瘤血管生成的重要治則，是進(jìn)一步研究中藥抗腫瘤血管生成機(jī)制的切入點(diǎn)[19]。本方中蛇舌草、山慈菇具有清熱解毒、消癰散結(jié)、化痰散結(jié)的功效；僵蠶、蜈蚣具有息風(fēng)止痙的功效，與太子參、麥冬配合有助于腫塊的消解，發(fā)揮抗腫瘤作用，由于方中發(fā)揮抑制血管生成作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚，后續(xù)本課題組將進(jìn)一步深入研究。