趙 靜，王振國，趙 琳

(1.武警特色醫(yī)學中心 內(nèi)分泌與血液科，天津 300162；2.武警特色醫(yī)學中心 醫(yī)研部，天津 300162；3.上海市第四人民醫(yī)院 老年醫(yī)學科，上海 200080)

隨著人們生活水平的提高，2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)已成為威脅人類健康的重要因素，而肥胖癥是T2DM發(fā)病率增高的重要因素之一[1]。T2DM的主要病理機制是胰島素抵抗，而脂肪組織是胰島素作用的重要靶器官[2]。吡格列酮(Pioglitazone，PGZ)是一種過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor-γ, PPARγ)激活劑，可以提高脂肪組織、肝臟和骨骼肌等對胰島素的敏感性，改善機體的胰島素抵抗，廣泛用于T2DM的治療[3]。本研究通過觀察吡格列酮干預后Zucker糖尿病-肥胖(Zucker diabetic fatty，ZDF)大鼠及其對照組Zucker lean (ZL)大鼠胰島素抵抗和脂肪分布變化，提高對吡格列酮治療T2DM的作用機理的認識。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及干預方法 5～6周齡ZDF大鼠和ZL大鼠各18只(動物為清潔級，購于北京維通利華實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0006)，體重(220±15 g)，分別隨機分為ZDF-吡格列酮組(ZDFPGZ)、ZDF-生理鹽水組(ZDFVE)、ZL-吡格列酮組(ZLPGZ)、ZL-生理鹽水組(ZLVE)，每組各9只。所有大鼠均用高脂飼料喂養(yǎng)于SPF級動物實驗室，每周測量動物的體重，取尾靜脈血液監(jiān)測血糖，空腹血糖超過7.0 mmol/L、ZDF組體重超過ZL組平均體重的20%即為誘導糖尿病-肥胖模型成功。8周后將符合條件的ZDF和ZL大鼠用吡格列酮和生理鹽水進行灌胃干預8周，劑量為10 mg/(kg·d)，生理鹽水10 mL/(kg·d)。干預結(jié)束后麻醉處死動物，取腹主動脈血1 mL置于肝素抗凝管中；取大鼠腎周脂肪組織，一部分置于凍存管儲存于-196℃的液氮中，另一部分置于4%的多聚甲醛溶液中固定，24 h后進行上機石蠟包埋。

1.2 主要試劑及儀器 無水葡萄糖，購自四川峨嵋山藥業(yè)股份有限公司；諾和靈精蛋白生物合成人胰島素注射液，購自江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司；鹽酸吡格列酮片，購自天北京太洋藥業(yè)股份有限公司；大鼠胰島素、膽固醇(Cholesterol, CHOL)、甘油三酯(Triglycerides, TG)和低密度脂蛋白(Low density Lipoprotein-cholesterol, LDL-C)ELISA試劑盒，購自美國RapidBio公司；RT-PCR轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自瑞士Roche公司；ABI Prism 7300 型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems 公司)；ECLIPSE 80i 熒光顯微鏡(日本尼康公司)。

1.3 大鼠血漿胰島素、血脂水平檢測及胰島素抵抗評價 將大鼠抗凝血2 500×g離心10 min，分離出血漿，通過酶聯(lián)免疫吸附測定技術(shù)(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測定大鼠血漿胰島素、CHOL、TG和LDL-C濃度。通過建立穩(wěn)態(tài)評估模型(Homeostasis model assessment, HOMA)計算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA of insulin resistance, HOMA-IR)，公式為[空腹胰島素(mU/L)×空腹血糖(mmol/L)]/22.5[4]。

1.4 MRI掃描觀察大鼠腹部脂肪分布 采用西門子Verio 3.0T磁共振儀器、大鼠專用線圈對大鼠腹部進行掃描和信號采集。應(yīng)用異氟烷、氧氣混合氣體(異氟烷濃度1.5%～2%)對大鼠進行吸入麻醉，動物呈仰臥位。掃描序列為T2WI，參數(shù)：采用快速自旋回波序列進行采集，TR時間6 000 ms，TE時間74 ms;層厚1.5 mm；掃描野(FOV)120 mm×96 mm。在后處理工作站上測量大鼠內(nèi)臟脂肪(Visceral adipose tissue, VAT)及皮下脂肪(Subcutaneous adipose tissue，SAT)面積，并計算VAT所占腹部脂肪比例，即[VAT面積 /(VAT+SAT) 面積×100%]。

1.5 HE染色測量大鼠內(nèi)臟脂肪細胞大小 取大鼠腎周脂肪蠟塊置于切片機上切片，厚度為5 μm，將石蠟切片進行HE染色，利用imageJ軟件測量大鼠VAT脂肪細胞直徑。

1.6 RT-qPCR檢測大鼠內(nèi)臟脂肪組織GLUT-4、PPAR-γ基因表達 將液氮中保存的大鼠腎周脂肪研磨至粉末，加入Trizol及三氯甲烷等提取脂肪組織總mRNA，使用Roche逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明在GeneAmp2400 PCR儀中將mMRA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。配制SYBR Green Master(ROX)反應(yīng)體系：SYBR Green Master(ROX)10 μL、cDNA模板2 μL、5 μmol/mL上游引物和下游引物各1 μL、Milli-Q超純水補足至20 μL。用RT-qPCR方法檢測大鼠脂肪組織葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-4(Glucose transporter-4，GLUT-4)、PPAR-γ基因表達水平，引物序列：β-actin，上游引物5’-AAT TAC TCC CTC TCC TA-3’，下游引物5’-ACT CAT CTA CTC CTC TTC T-3’；GLUT-4，上游引物5’-GACATTTGGCGGAGCCTAAC-3’，下游引物5’-TAACTCCAGCAGGGTGACACAG-3’；PPAR-γ，上游引物5’- CCAGAGTCTGCTG ATCTGCG -3’，下游引物5’- GCCACCTCTTTGCTCTGCTC -3’。反應(yīng)條件為95℃預變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，共40個循環(huán)。將結(jié)果用ZLVE組標準化，用2-△△CT方法計算目的基因表達水平。

1.7 腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)和胰島素耐量試驗(IPITT) 在處死動物前1周進行IPGTT和IPITT，用于評價大鼠胰島素敏感性和胰島素抵抗程度。IPGTT：扎刺大鼠尾靜脈，用血糖試紙蘸取血液測量血糖基線值，然后腹腔注射20%的D-葡萄糖溶液(1g/kg體重)并開始記錄時間，在30、60、90、120 min分別測量血糖值。IPITT：采血方法與IPGTT相同，測量基線血糖濃度后腹腔注射胰島素工作液(0.1U/kg體重)并開始記錄時間，在30、60、90、120 min分別測量血糖值。

2 結(jié)果

2.1 體重和血糖 ZDF組大鼠在高脂喂養(yǎng)1周后較ZL組血糖明顯升高(P<0.01)，并且ZDF組體重明顯大于ZL組。除1只ZDFPGZ大鼠死亡，1只ZDFVE大鼠因體重達不到超過對照組平均體重的20%標準而誘導失敗，余ZDF和ZL大鼠均符合模型要求。吡格列酮/生理鹽水干預后，2周內(nèi)ZDFPGZ組血糖下降至正常水平，ZDFVE組血糖持續(xù)升高;而ZDFPGZ組體重持續(xù)增加，ZDFVE組體重較ZDFPGZ組小(P<0.01，見圖1A、B)。

與 ZDFVE組比較，a：P< 0.01； 與 ZL組(ZLVE和ZLPGZ組)比較，b：P< 0.01；與ZDFPGZ組比較，c：P< 0.01。圖1 血糖和體重

2.2 血漿胰島素、血脂水平及HOMA-IR 造模成功后ZDF大鼠與ZL大鼠比較表現(xiàn)為明顯的高脂血癥和高胰島素血癥，ZDF大鼠TG、CHOL、胰島素水平均明顯高于ZL大鼠(P<0.01)，ZDF大鼠較ZL大鼠HOMA-IR明顯增大(P<0.01)，表現(xiàn)為嚴重的胰島素抵抗。吡格列酮干預后ZDFPGZ組大鼠TG、CHOL、LDL-C、胰島素水平及HOMA-IR較ZDFVE組均明顯降低(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，說明大鼠的高脂血癥、高胰島素血癥及胰島素抵抗明顯改善(見表1)。

檢測指標ZDFVEZDFPGZZLVEZLPGZFPTG (mmol/L)3.18±0.23b2.11±0.15a0.54±0.12c0.45±0.08c70.85<0.01CHOL (mmol/L)3.63±0.18b2.72±0.14a1.97±0.02c1.84±0.11c43.15<0.01LDL-C (mmol/L)0.62±0.04b0.40±0.03a0.44±0.010.46±0.056.81<0.01胰島素(mU/L)5.33±0.35b3.12±0.3a3.04±0.263.08±0.1810.25<0.01HOMA-IR4.54±0.35b0.89±0.93a0.93±0.080.90±0.0595.28<0.01

與ZDFVE組，a：P< 0.01; 與ZL組(ZLVE和ZLPGZ組)比較，b：P< 0.01; 與 ZDFPGZ組比較，c：P< 0.01。TG, 甘油三酯; CHOL, 膽固醇; LDL-C: 密度脂蛋白;HOMA-IR, 胰島素抵抗指數(shù)。

2.3 大鼠腹部脂肪分布情況 ZDFPGZ組大鼠腹部VAT和SAT含量百分比均高于ZDFVE組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，說明用藥后VAT和SAT均有所增加；ZDFPGZ組大鼠的VAT含量百分比低于ZDFVE組(68.26±1.03 vs. 74.11±0.79，P<0.01)，說明吡格列酮干預后雖然總脂肪量增加，但是VAT的相對含量減少，更傾向于增加SAT的含量(見表2)。

2.4 大鼠內(nèi)臟脂肪細胞大小 造模成功后，ZDF組大鼠脂肪細胞直徑明顯大于ZL組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。吡格列酮干預后，ZDFPGZ組大鼠脂肪細胞明顯大于ZDFVE組(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，說明吡格列酮可以使脂肪細胞擴增；ZLVE組與ZLPGZ組脂肪細胞直徑相比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2)。 大鼠內(nèi)臟脂肪HE染色結(jié)果見圖2。

項目ZDFVEZDFPGZZLVEZLPGZFPVAT面積(mm2)2228.00±90.40b2981.00±91.30a262.00±28.29c317.60±20.66c215.30<0.01SAT面積(mm2)778.90±43.77b1377.00±51.19a181.30±10.02c214.80±14.14c262.90<0.01 VAT含量百分比(%)74.11±0.79b68.26±1.03a58.37±1.75c59.64±0.85c40.67<0.01AC直徑(μm)115.3±2.92b 128.4±1.59a67.27±1.45c63.66±1.42c287.10<0.01

與ZDFVE組比較，a：P< 0.01; 與ZL組(ZLVE和ZLPGZ組)比較，b：P< 0.01; 與ZDFPGZ組比較，c：P< 0.01。 VAT, 內(nèi)臟脂肪組織; SAT, 皮下脂肪組織; VAT含量百分比= VAT面積/(VAT + SAT)面積×100%；AC，Adipocyte，脂肪細胞。

圖2 大鼠內(nèi)臟脂肪組織HE染色結(jié)果(×100)

2.5 大鼠內(nèi)臟脂肪GLUT-4、PPAR-γ基因表達水平 ZDF大鼠VAT中與胰島素抵抗相關(guān)的GLUT-4和PPAR-γ基因表達減少(P<0.01)；吡格列酮干預后表達量增高，GLUT-4(0.40±0.02 vs. 0.84±0.03, ZDFVEvs. ZDFPGZ,P<0.01), PPAR-γ(0.33±0.01 vs. 1.02±0.04, ZDFVEvs. ZDFPGZ,P<0.01，見圖2A、B)。

2.6 IPGTT及IPITT結(jié)果 如圖2C和D所示，IPGTT顯示ZDFVE組的血糖濃度在所有的時間點均比其他組高(P<0.01)，ZDFPGZ組胰島素敏感性明顯提高；IPITT顯示ZDFVE組的血糖濃度高于其他組(P<0.01)，ZDFPGZ組胰島素抵抗明顯改善。

與 ZDFVE組比較，a：P< 0.01; 與ZL組(ZLVE和ZLPGZ組)比較，b：P< 0.01; 與 ZDFPGZ組比較，c：P< 0.01。 A、B：各組GLUT-4、PPAR-γ基因表達量；C、D：腹腔葡萄糖耐量試驗(IPGTT)和胰島素耐量試驗(IPITT)。圖3 基因表達及IPGTT、IPITT

3 討論

隨著社會發(fā)展和人們生活方式的改變，肥胖癥(BMI ≥30 kg/m2)已成為全球性的公共健康問題，肥胖癥的流行增加了T2DM、心腦血管疾病及一些代謝性疾病的發(fā)病率[1,5-6]。胰島素抵抗是T2DM的主要病理機制，研究表明，脂肪組織是機體三大胰島素靶器官(肝臟、脂肪、骨骼肌)之一，參與到肥胖相關(guān)胰島素抵抗的發(fā)生和發(fā)展中，不同位置的脂肪組組對胰島素抵抗的貢獻不同，VAT較SAT更易引起胰島素抵抗[2]。

吡格列酮屬于噻唑烷二酮(Thiazolidinedione，TZD)類胰島素增敏劑，可激活脂肪組織、骨骼肌和肝臟等胰島素靶器官的PPAR-γ，增加靶細胞對胰島素的敏感性，從而改善胰島素抵抗，廣泛應(yīng)用于T2DM的臨床治療[7-8]。PPAR-γ在脂肪細胞內(nèi)呈高表達狀態(tài)，在脂肪細胞分化、功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用，在PPAR-γ基因缺失的個體中脂肪細胞會表現(xiàn)為明顯的胰島素抵抗[9]。脂肪組織是TZD最重要的作用位點[10]，本研究吡格列酮干預后大鼠內(nèi)臟脂肪組織PPAR-γ表達量明顯升高，胰島素抵抗程度明顯改善。GLUT-4是胰島素靶器官重要的膜轉(zhuǎn)運蛋白，介導葡萄糖的跨膜轉(zhuǎn)運，脂肪細胞的GLUT-4基因表達降低會導致機體的胰島素抵抗[11-12]。Kramer D等[13]研究指出，肥胖大鼠的脂肪細胞中GLUT-4表達降低，應(yīng)用TZD類藥物可使其正常表達。本研究應(yīng)用吡格列酮后大鼠內(nèi)臟脂肪組織GLUT-4表達量明顯升高，血糖恢復至正常水平。

盡管吡格列酮治療T2DM有良好的臨床效果，但其仍有一些副作用，如：體重增加、水鈉儲留、充血性心衰及骨折等[14]。本研究中肥胖-糖尿病大鼠應(yīng)用吡格列酮后體重增加，脂肪擴增，細胞直徑增大。有學者提出“脂質(zhì)竊取”模型來解釋吡格列酮引起的體重增加，即吡格列酮通過將肝臟和骨骼肌中的沉積的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移到脂肪細胞，使脂肪細胞變成一個“良好”的脂質(zhì)存儲器官，來改善肝臟和骨骼肌的脂毒性，從而緩解機體的胰島素抵抗[15-16]。并且TZD類藥物傾向于將脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至SAT，而不是更易引起胰島素抵抗的VAT[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮干預后大鼠腹部總脂肪量增加，但SAT相對于VAT增加更加明顯，與文獻一致。因此，吡格列酮引起的體重增加和脂肪擴增可能是改善機體胰島素抵抗的作用機制之一。但是吡格列酮引起的水鈉潴留仍然是引起充血性心衰的重要危險因素，對于心衰患者應(yīng)謹慎使用[18]。

研究表明，皮下脂肪組織在胰島素抵抗中發(fā)揮的重要作用，皮下脂肪組織PPAR-γ和GLUT-4高表達，有利于增加胰島素敏感性，改善機體胰島素抵抗程度，促進肥胖相關(guān)的機體代謝綜合征的良性轉(zhuǎn)化[19]。本研究不足之處是未對皮下脂肪組織病理及胰島素抵抗相關(guān)基因進行檢測，有待于進一步深入研究。

吡格列酮作為PPAR-γ激活劑，可以改善肥胖-糖尿病大鼠的胰島素抵抗，糾正ZDF大鼠的高脂血癥、高血糖癥。以往研究認為體重增加是吡格列酮的副作用，本研究認為吡格列酮引起的體重增加可能是其作用機制之一，即吡格列酮通過脂肪組織擴增，尤其是皮下脂肪組織擴增的方式，來儲存機體過多的脂質(zhì)，從改善機體的胰島素抵抗程度。