孫達(dá)權(quán)，周莉莉，石 松，薛殿婷，徐瑩瑩

(貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)又叫角蛋白，主要存在于上皮細(xì)胞中，是參與固定細(xì)胞核和維持細(xì)胞形態(tài)的重要成分[1-2]。上皮細(xì)胞中的角蛋白有20種以上的CKs亞型，其表達(dá)主要依賴于上皮細(xì)胞的分化程度和類型[3]。在肝臟中，細(xì)胞角蛋白8(CK8)和細(xì)胞角蛋白18(CK18)最為常見，它們均由中央α-螺旋桿狀結(jié)構(gòu)域與非α-螺旋N-末端頭部和C-末端尾部結(jié)構(gòu)域組成[4-5]。不同細(xì)胞角蛋白間可以形成非共價雜聚物，聚集成長絲并產(chǎn)生維持細(xì)胞完整性的細(xì)胞質(zhì)絲網(wǎng)絡(luò)[6]。在非癌性組織胚胎發(fā)育過程中，CK18不是廣泛性表達(dá)的，而是隨著上皮細(xì)胞發(fā)育的階段不同而特異性表達(dá)的，如CK18在正常腺上皮細(xì)胞、移行上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞中表達(dá)，但不在鱗狀上皮分化而來的上皮細(xì)胞中表達(dá)[7-10]。

在腫瘤診斷中，CK18作為腫瘤標(biāo)志物廣泛用于細(xì)胞癌性診斷[11]。研究表明，CK18在不同類型的腫瘤中扮演的角色各有差異。在乳腺癌或結(jié)直腸癌中，CK18與腫瘤預(yù)后較差相關(guān)[12-13]。在口腔癌和尿道移行細(xì)胞癌中，CK18表達(dá)上調(diào)與不良預(yù)后相關(guān)[14]。這些研究結(jié)果暗示在不同類型的腫瘤中，CK18功能可能各不相同，要確定CK18在某一種腫瘤中的具體作用需要對其進(jìn)行具體研究和分析。

本研究通過構(gòu)建CK18單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep G2肝癌細(xì)胞株，觀察CK18對Hep G2肝癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料 Hep G2細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫(中國)。新生牛血清購自杭州四季青(中國)。RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基、Trizol、Lipofectamine 2000購自Invitrogen(美國)。pEBFP-C1保存于本實(shí)驗(yàn)室。無內(nèi)毒素質(zhì)粒中量制備試劑盒、感受態(tài)DH5均購自北京天根生物(中國)。高保真反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒及限制性核酸內(nèi)切酶XhoI和EcoR I、T4 DNA ligase 購自大連寶生物(中國)。一抗抗體CK18和BFP、內(nèi)參抗體GAPDH、ECL顯色液、CK18 PCR引物和DNA測序由北京博邁德完成(中國)。實(shí)時無標(biāo)記細(xì)胞分析儀 (xCELLigence RTCA S16)和E-Plate L16購自艾森生物(中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) Hep G2細(xì)胞用含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Hep G2細(xì)胞總RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄合成 Hep G2細(xì)胞按60%接種至6cm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜，PBS清洗3次，用Trizol按說明書抽提細(xì)胞總RNA，紫外分光光度法測定RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA質(zhì)量。以總RNA為模板，用RT-PCR反轉(zhuǎn)錄CK18基因。

1.4 基因擴(kuò)增與重組真核表達(dá)載體構(gòu)建 以cDNA 為模板，用CK18參照序列(NM_000224)設(shè)計的CK18引物對(上游引物：5'-tCTCGAGACAGCATGAGCTTCACCACTCGCT-3'；下游引物：5'-tGAATTCGGCTTAATGCCTCAGAACTTTGGTGTC-3')經(jīng)高保真PCR擴(kuò)增獲得CK18的蛋白編碼區(qū)，擴(kuò)增條件如下：預(yù)變性(94 ℃ 2.5 min)、循環(huán)擴(kuò)增(94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 2 min；32 cycles)、穩(wěn)定(72 ℃ 7 min)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后純化，純化產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶XhoI和EcoR I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物再次回收，插入同樣雙酶切線性化的真核表達(dá)載體pEBFP-C1中，經(jīng)轉(zhuǎn)化、卡那霉素篩選培養(yǎng)、單克隆菌落擴(kuò)大培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提、雙酶切鑒定和DNA測序鑒定，獲得無任何突變的重組質(zhì)粒pEBFP-CK18。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 DNA抽提獲得無內(nèi)毒素質(zhì)粒pEBFP-CK18和對照質(zhì)粒pEBFP-C1并進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d，將肝癌細(xì)胞Hep G2均勻地鋪于六孔板中，密度為0.48×106/孔。轉(zhuǎn)染前30 min將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清的DMEM培養(yǎng)基，并按Lipofectamine 2000說明書轉(zhuǎn)染pEBFP-CK18和對照質(zhì)粒pEBFP-C1。轉(zhuǎn)染后6 h將轉(zhuǎn)染液更換為含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染后72 h在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光。

1.6 單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep G2肝癌細(xì)胞篩選 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后4d，用600 μg/mL G418對轉(zhuǎn)染的Hep G2進(jìn)行篩選培養(yǎng)。7 d后，將G418濃度降低至200 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)直至單克隆細(xì)胞集落形成，熒光顯微鏡下挑取單克隆細(xì)胞株并擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡 收集適量的細(xì)胞，細(xì)胞裂解并蛋白定量后，加入上樣緩沖液，沸水浴煮沸5 min，蛋白樣品冷卻離心后，上清液經(jīng)SDS-PAGE 電泳和電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上后，用5% BSA封閉PVDF膜。一抗抗體CK18按1∶2 000稀釋、BFP抗體按1∶5 000稀釋、內(nèi)參抗體GAPDH按1∶8 000稀釋，一抗抗體4 ℃孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min。HRP標(biāo)記的羊抗兔或者羊抗鼠二抗按1∶5 000稀釋，37℃孵育2 h。TBST清洗3次，每次10 min。ECL液顯色成像。

1.8 細(xì)胞增殖檢測 在E-Plate L16檢測板中加入含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液100μL。將E-Plate L16放到xCELLigence RTCA S16上自動掃描，檢查基線值，確認(rèn)孔板接觸良好。消化細(xì)胞并制成密度2×104/mL的細(xì)胞懸液，E-Plate L16中每孔接入100 μL細(xì)胞懸液。放入RTCA檢測儀中37℃培養(yǎng)120 h，以檢測時間(hour)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞指數(shù)(cell index)為縱坐標(biāo)(代表細(xì)胞數(shù)量)，檢測細(xì)胞增殖速率。

1.9 細(xì)胞劃痕-愈合實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞按90%鋪于12孔板，待細(xì)胞完全融合后，用10 μL 加樣槍頭沿直尺垂直于孔板輕輕劃“|”，PBS 輕柔清洗兩次，洗去脫落的細(xì)胞，加入無血清細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，顯微鏡下分別記錄不同時間段細(xì)胞圖片，并對圖片中細(xì)胞劃痕的寬度進(jìn)行測量和記錄，用公式{細(xì)胞遷移率(%)=(原劃痕距離-現(xiàn)劃痕距離)/原劃痕距離×100%}分別計算Hep G2肝癌細(xì)胞24 h和48 h遷移率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并用統(tǒng)計學(xué)進(jìn)行分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。樣本間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建重組真核表達(dá)載體pEBFP-CK18 如圖1A所示，重組真核表達(dá)載體pEBFP-CK18經(jīng)XhoI和EcoR I雙酶切和1%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，重組質(zhì)粒中CK18 DNA片段大小與預(yù)期一致。DNA正反測序結(jié)果顯示，pEBFP-CK18中的CK18蛋白編碼區(qū)序列無任何突變，可以與標(biāo)簽蛋白EBFP在細(xì)胞內(nèi)融合表達(dá)，其質(zhì)粒圖譜如圖1B所示。

A：Xho I和EcoR I雙酶切鑒定分析pEBFP-CK18； B：pEBFP-CK18質(zhì)粒圖譜。圖1 質(zhì)粒pEBFP-CK18圖譜及其酶切鑒定

2.2 CK18單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)外源融合蛋白BFP-CK18 肝癌細(xì)胞Hep G2穩(wěn)定性轉(zhuǎn)染pEBFP-CK18后，經(jīng)細(xì)胞篩選、單克隆挑選與擴(kuò)大培養(yǎng)后，熒光顯微鏡下細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)藍(lán)色熒光，提示單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞(St. cell)可以表達(dá)外源融合蛋白BFP-CK18，細(xì)胞形態(tài)改變(見圖2)。為進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)是否表達(dá)外源目的蛋白，對單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞進(jìn)行蛋白免疫分析，與對照細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)St. cell中高表達(dá)BFP-CK18(見圖3)，證明單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株構(gòu)建成功。

St. cell：表達(dá)外源融合蛋白BFP-CK18的穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep G2肝癌細(xì)胞；Ctrl. cell：表達(dá)外源BFP蛋白的穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep G2肝癌細(xì)胞。圖2 單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep G2肝癌細(xì)胞呈藍(lán)色熒光

圖3 外源融合蛋白BFP-CK18在單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep G2肝癌細(xì)胞中表達(dá)

2.3 CK18抑制肝癌細(xì)胞Hep G2的細(xì)胞遷移 利用RTCA對單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep G2肝癌細(xì)胞的生長速率進(jìn)行實(shí)時檢測，發(fā)現(xiàn)高表達(dá)外源CK18蛋白的Hep G2細(xì)胞的生長速度并未發(fā)生顯著變化(見圖4A)。用劃痕-愈合實(shí)驗(yàn)對肝癌細(xì)胞遷移能力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)外源CK18后，細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，統(tǒng)計學(xué)意義差異明顯(P24h=0.003，P48h=0.007)(見圖4B、C)。

A：單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的增殖速率；B：單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞遷移率；C：單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞遷移率數(shù)據(jù)分析；**：P<0.01。圖4 單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep G2肝癌細(xì)胞的增殖和遷移

3 討論

CK18是存在于上皮組織中的多功能中間絲蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)骨架結(jié)構(gòu)的形成[1-3]。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)CK18與波形蛋白共表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)骨架蛋白之間作用增加，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞遷移[14]。另外，在約25%的非典型增生細(xì)胞和50%的食管癌細(xì)胞中均有觀察到CK18蛋白與其伴侶蛋白CK8的共同積累，而在正常的食管鱗狀上皮不存在這種現(xiàn)象，因此，CK18過度表達(dá)被認(rèn)為與惡性腫瘤相關(guān)[7, 15]。在其他惡性腫瘤如口腔癌[14]、頭頸部癌[16]和尿道移行癌[8]中也報道了類似的現(xiàn)象。與之相反的是，在一些腺癌如人乳腺癌和結(jié)直腸癌中，CK18與CK8的表達(dá)反而隨著腫瘤發(fā)展進(jìn)程而表達(dá)逐步下調(diào)[17-18]。這些矛盾的結(jié)果顯示CK18的表達(dá)與腫瘤的惡性程度因腫瘤類型不同而有所差異。

本研究中，發(fā)現(xiàn)肝癌細(xì)胞中CK18高表達(dá)不影響細(xì)胞的增殖能力，但肝癌細(xì)胞形態(tài)改變，這是因?yàn)镃K18是細(xì)胞骨架的重要組成部分，其表達(dá)、分布等變化均可使細(xì)胞形態(tài)改變[19]。同時，高表達(dá)CK18后，肝癌細(xì)胞遷移的能力增強(qiáng)，這與人肺腺癌[20]、人黑色素瘤細(xì)胞[14]和小鼠L細(xì)胞[21]的研究結(jié)論基本一致。但是，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在人乳腺癌細(xì)胞中導(dǎo)入外源CK18基因后，其腫瘤惡性程度顯著降低[22]。產(chǎn)生如此大的差異可能是因?yàn)镃K18本身與惡性轉(zhuǎn)化并不直接相關(guān)，它可能是通過其他間接方式如促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而實(shí)現(xiàn)的。也有研究表明，癌基因可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子而活化Ras信號通路，刺激CK18基因表達(dá)[23]。但這種CK18的表達(dá)變化僅反映癌細(xì)胞內(nèi)癌基因被激活的現(xiàn)象而已，與CK18直接致癌或抑癌的理論不無直接關(guān)系。盡管現(xiàn)階段對于CK18對不同腫瘤的作用已有一定的認(rèn)識，但其背后深藏的具體機(jī)制有待于繼續(xù)發(fā)掘。在本研究中，成功克隆人細(xì)胞角蛋白CK18基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體pEBFP-CK18，并利用脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和G418藥物篩選成功構(gòu)建了高表達(dá)外源蛋白CK18的單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)Hep G2肝癌細(xì)胞株，細(xì)胞形態(tài)改變，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，為下一步探索CK18促進(jìn)肝癌細(xì)胞Hep G2遷移的分子機(jī)制和信號通路奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。