劉士明，丁 濤，雷良玉，胡 琳，冒 靈，陳 超，郭萌萌，徐 林

(貴州省基因檢測(cè)與治療特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨貴州省生物治療人才基地暨遵義醫(yī)科大學(xué) 免疫學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

結(jié)直腸癌是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤之一，近年來(lái)，其發(fā)病率和死亡率逐年上升并呈現(xiàn)年輕化的趨勢(shì)，對(duì)人的生命健康造成重大的威脅[1-2]。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是真核生物在進(jìn)化過(guò)程中一種高度保守的機(jī)制, 它與共抑制、協(xié)同抑制、基因沉默、基因阻滯以及發(fā)育等許多重要的生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)[3-4]，也可利用其干擾腫瘤細(xì)胞中特定基因的表達(dá)，用于腫瘤發(fā)生機(jī)制的探討和基因治療策略的開(kāi)發(fā)[5-6]。Ⅰ型輔酶脫氫酶1α亞復(fù)合物4(NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 4,NDUFA4)，是由定位于人7號(hào)染色體p21.3上的NDUFA4 基因編碼的線(xiàn)粒體呼吸鏈蛋白質(zhì)，也是哺乳動(dòng)物線(xiàn)粒體細(xì)胞色素C氧化酶(COX;Complex IV)中的重要亞基，分子量約為9 kb，具有NADH脫氫酶和氧化還原酶活性，能夠?qū)㈦娮訌腘ADH轉(zhuǎn)移至呼吸鏈，參與能量代謝[7-8]。已有研究顯示NDUFA4基因的異常改變與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-10]。然而，NDUFA4在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的可能作用和機(jī)制尚未清楚。因此，本研究旨在利用RNA干擾技術(shù)(RNAi)，觀(guān)察下調(diào)NDUFA4表達(dá)對(duì)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞體外生長(zhǎng)的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究NDUFA4分子在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用提供前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株、質(zhì)粒和主要試劑：人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)生命科學(xué)院，p-Cont質(zhì)粒(P-EGFP-N1質(zhì)粒)由本實(shí)驗(yàn)室保存，NDUFA4-RNAi重組質(zhì)粒、PCR引物均購(gòu)于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；Leibovitz’s L-15 培養(yǎng)基、優(yōu)質(zhì)胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，磷酸鹽緩沖液(PBS)、1%結(jié)晶紫染液均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Cell Counting Kit-8( CCK-8) 試劑盒購(gòu)于東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；Lipofectamine3000(L3000150)試劑盒購(gòu)于賽默飛中國(guó); Trizol試劑、SYBR Premix Ex Taq、Premix Ex Taq Version2.0，以及RNAisoTMPlus均購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；兔抗NDUFA4(Ab129752)、β-Actin單克隆抗體、p-AKT、AKT一抗以及兔抗ERK1/2、p-ERK1/2一抗、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自Abcam中國(guó)；ECL試劑盒、RIPA裂解液購(gòu)于聯(lián)科生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞置于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清、三抗(青霉素和鏈霉素-兩性霉素混合液)的 Leibovitz’s L-15細(xì)胞培養(yǎng)基、37 ℃，5%CO2，100%濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)SW480細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到80%融合時(shí)，使用0.25%胰蛋白酶于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化2 min，離心收集細(xì)胞后用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。將待轉(zhuǎn)染細(xì)胞設(shè)置實(shí)驗(yàn)組別：p-Cont組和p-NDUFA4組。按照相應(yīng)密度將細(xì)胞接種于6孔板和96孔板，繼續(xù)按照上述培養(yǎng)條件培養(yǎng)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染當(dāng)天待貼壁細(xì)胞密度達(dá)到80%融合時(shí)，使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。48 h后熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染情況。

1.2.2 Real-time PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NDUFA4 mRNA相對(duì)表達(dá)量和蛋白水平

1.2.2.1 Real-time PCR檢測(cè)NDUFA4的mRNA相對(duì)表達(dá)量同前期工作[11]。

1.2.2.2 Western blot檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NDUFA4蛋白水平 細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品的制備及BCA法定量蛋白的檢測(cè)參考文獻(xiàn)[11]。分別制備分離膠和濃縮膠；SDS-PAGE電壓80V跑濃縮膠，120V跑分離膠；上樣Marker和制備好的NDUFA4蛋白樣品；電泳1 h后采用半干法將目的蛋白NDUFA4轉(zhuǎn)至PVDF 膜；轉(zhuǎn)膜完畢后立刻把膜置于配置5% 脫脂奶粉的TBST溶液中封閉1 h；將兔抗人的內(nèi)參β-Actin、NDUFA4(稀釋比例均為1∶1 000)一抗加入含有封閉液中進(jìn)行孵育；4℃冰箱過(guò)夜；次日，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗NDUFA4，室溫下用PBST 洗膜；加入等量底物顯色液進(jìn)行蛋白曝光。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞的增殖情況 實(shí)驗(yàn)分組如1.2.1所示，并設(shè)置三個(gè)復(fù)孔。按8×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞密度達(dá)80%左右，Lipofectamine3000瞬時(shí)將NDUFA4-RNAi質(zhì)粒和p-Cont對(duì)照組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，吸附5～6 h，更換新鮮培養(yǎng)基。于轉(zhuǎn)染24、48、72、96、120 h后避光分別向每孔加入10 μL CCK-8 試劑，并置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，在酶標(biāo)儀下讀取每孔吸光度(OD450)值變化，記錄并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4 檢測(cè)人結(jié)直腸SW480細(xì)胞的克隆形成能力 0.25%胰蛋白酶將已轉(zhuǎn)染的兩組細(xì)胞消化后置于顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并以200/孔和800/孔接種于6孔板中，用于克隆形成實(shí)驗(yàn)，然后，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同前1.2.1。14 d后，當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)克隆時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS液小心漂洗2次，空氣干燥。每孔加入4%多聚甲醛固定液固定15 min，棄固定液后室溫干燥。用結(jié)晶紫染液染色，并對(duì)菌落克隆數(shù)量拍照和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞中與生長(zhǎng)相關(guān)基因的表達(dá) 細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的CDKs表達(dá)的檢測(cè)同前期工作[11]。

1.2.6 Western blot檢測(cè)SW480細(xì)胞中AKT、ERK、磷酸化AKT、磷酸化ERK蛋白的表達(dá)情況

1.2.7 免疫印跡試驗(yàn)檢測(cè)總AKT、ERK 1/2和AKT、ERK1/2磷酸化水平的變化方法同前期工作[11]。

2 結(jié)果

2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NDUFA4-RNAi后SW480細(xì)胞中NDUFA4的表達(dá)水平 我們將NDUFA4-RNAi質(zhì)粒和p-Cont質(zhì)粒體外分別轉(zhuǎn)入人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和蛋白質(zhì)印跡分別檢測(cè)兩組轉(zhuǎn)染細(xì)胞中NDUFA4的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與p-Cont組相比，p-NDUFA4組中NDUFA4的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P<0.05，見(jiàn)圖1 A、B)。

A：NDUFA4的相對(duì)表達(dá)量；B：NDUFA4的蛋白水平；**:與p-Cont組比較，P<0.01。 圖1 轉(zhuǎn)染NDUFA4-RNAi質(zhì)粒后SW480細(xì)胞NDUFA4的mRNA和蛋白表達(dá)變化

2.2 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NDUFA4-RNAi抑制SW480細(xì)胞體外生長(zhǎng) CCK8結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，轉(zhuǎn)染48 h后，p-NDUFA4組細(xì)胞的增殖速度均明顯低于p-Cont組細(xì)胞的增殖速度(P<0.05，見(jiàn)圖2)。

*:與p-Cont組比較，P<0.05。圖2 轉(zhuǎn)染NDUFA4-RNAi對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

2.3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NDUFA4-RNAi抑制SW480細(xì)胞的克隆形成能力 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在接種200細(xì)胞/孔和800細(xì)胞/孔條件下，p-NDUFA4組SW480細(xì)胞的克隆形成率較p-Cont組明顯降低(P<0.05，見(jiàn)圖3)。

*:與p-Cont組比較，P<0.05。 圖3 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NDUFA4 -RNAi對(duì)SW480細(xì)胞克隆形成的影響

2.4 下調(diào)NDUFA4抑制細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的CDKs分子的表達(dá) 結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-NDUFA4組中腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的周期蛋白依賴(lài)性激酶CDK3、CDK4的表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05，見(jiàn)圖4)。

*:與p-Cont組比較，P<0.05。 圖4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染NDUFA4-RNAi對(duì)SW480細(xì)胞中細(xì)胞生長(zhǎng)周期相關(guān)的CDKs表達(dá)的影響

2.5 抑制NDUFA4明顯下調(diào)SW480細(xì)胞p-ERK，p-AKT的蛋白水平 Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與p-Cont組相比，p-NDUFA4組中p-ERK，p-AKT的蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05,P<0.01，見(jiàn)圖 5A、B)。

與p-Cont組比較，*:P<0.05, **:P<0.01。 圖5 Western Blot檢測(cè)NDUFA4-RNAi轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞中總AKT、ERK 1/2和AKT、ERK1/2磷酸化水平的變化

3 討論

近來(lái)研究顯示，Ⅰ型輔酶脫氫酶1α亞復(fù)合物4(NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 4 ,NDUFA4)參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[9]，然而其在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的可能作用及機(jī)制鮮有研究探討。近年來(lái)，RNA干擾技術(shù)在基因功能、基因治療、遺傳性疾病的治療及腫瘤的治療方面發(fā)揮著重要的作用[12-13]。例如，羅麟潔等[14]利用RNA干擾技術(shù)可有效沉默肺腺癌A549細(xì)胞的STAT3基因，同時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，提示STAT3基因在肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的重要作用。類(lèi)似地，訾永宏等[15]也利用RNA干擾技術(shù)成功下調(diào)人結(jié)直腸癌細(xì)胞中ADP-核糖基化樣因子4C(ADP-ribosylation factor-like 4C，Arl4c)的表達(dá)，探討Arl4c基因在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用。在本研究中，我們也嘗試?yán)肦NAi技術(shù)來(lái)下調(diào)人結(jié)直腸癌細(xì)胞中NDUFA4基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞中NDUFA4的表達(dá)水平明顯降低，為后續(xù)深入探討NDUFA4在人結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要基礎(chǔ)。

有意義的是，CCK-8實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，下調(diào)NDUFA4表達(dá)后，SW480細(xì)胞的增殖能力和克隆形成能力明顯減弱，提示RNA干擾下調(diào)NDUFA4表達(dá)后，人結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)能力受到明顯抑制。為了進(jìn)一步明確下調(diào)NDUFA4對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的效應(yīng)，我們進(jìn)一步檢測(cè)了細(xì)胞中生長(zhǎng)周期相關(guān)分子CDKs 家族成員CDK3和CDK4等的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CDKs家族成員CDK3和CDK4明顯下調(diào)，提示NDUFA4抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的效應(yīng)與細(xì)胞周期變化有關(guān)。 類(lèi)似地，我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)NDUFA4可促進(jìn)人肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[11]。這些研究進(jìn)一步提示NDUFA4作為促癌基因在腫瘤發(fā)生中具有重要作用。現(xiàn)已知，AKT和ERK信號(hào)途徑與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)[16-17]。為了初步探討NDUFA4參與人結(jié)直腸癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的可能機(jī)制，我們檢測(cè)了細(xì)胞中p-AKT和 p-ERK等蛋白的表達(dá)情況，且發(fā)現(xiàn)下調(diào)NDUFA4表達(dá)后，腫瘤細(xì)胞中p-AKT和 p-ERK等蛋白的表達(dá)水平均明顯下調(diào)，提示，下調(diào)NDUFA4表達(dá)可顯著抑制人結(jié)直腸癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)，其效應(yīng)可能與相關(guān)信號(hào)途徑傳遞變化有關(guān)。然而，NDUFA4與這些相關(guān)信號(hào)途徑的確切關(guān)系仍待研究探討。

綜上所述，本研究首次利用RNAi技術(shù)下調(diào)NDUFA4表達(dá)，發(fā)現(xiàn)人結(jié)直腸癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)受到抑制，且AKT和ERK等信號(hào)途徑傳遞發(fā)生變化，為后續(xù)深入探討NDUFA4在人結(jié)直腸癌發(fā)生中的作用及機(jī)制提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，鑒于NDUFA4分子在細(xì)胞能量代謝中的重要作用，以及AKT等信號(hào)途徑與能量代謝的密切關(guān)系，因此，NDUFA4下調(diào)對(duì)人結(jié)直腸癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的確切分子機(jī)制，包括細(xì)胞能量代謝改變，仍有待后續(xù)研究探討。