高露瑤，蔡國徽，敖弟書，宋 鴻

(遵義醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，貴州 遵義 563099)

近年來用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的支架材料得到了迅速發(fā)展，一些生物聚合材料(PLLA、PLGA、PLLA-PLGA共聚物)及生物材料(膠原、藻酸鹽、瓊脂糖等)在細(xì)胞培養(yǎng)中得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。然而，理想的細(xì)胞支架材料必須有明確的組份及其適合細(xì)胞生長的孔隙率，就此而言，離子型納米自組裝短肽的成份純凈、性能穩(wěn)定、無免疫原性且降解產(chǎn)物無毒，并具有較好的生物相容性及能自組裝形成納米級纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等特點，被視為理想的細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)材料[3-5]。

目前，卵巢癌的病死率高居婦科惡性腫瘤的首位，然而對卵巢癌的發(fā)病機理至今尚不明確[6]，限制了臨床對卵巢癌的診治，因此建立能模擬體內(nèi)卵巢癌細(xì)胞生長特點的培養(yǎng)模型，將促進對卵巢癌發(fā)病機理的了解，同時也有利于臨床藥物的研發(fā)和篩選。本文擬構(gòu)建卵巢癌細(xì)胞A2780納米自組裝短肽水凝膠三維培養(yǎng)模型，為探索理想的卵巢癌體外實驗?zāi)Ｐ吞峁嶒炓罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 人卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780購自南京賽博生物科技有限公司；RADA16-I([COCH3]-RADARADARADARADA-[CONH2])由上海波泰生物科技有限公司合成；Matrigel、I型膠原(Collagen I)購自美國BD公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；DNA熒光定量檢測試劑盒、鈣黃綠素AM、鬼筆環(huán)肽、DAPI均購自美國Sigma公司；活性氧檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所；其余抗體均購自英國Abcam公司。

CO2培養(yǎng)箱(3131型，美國Thermo公司)；熒光分光光度計(3001-1913型，美國Thermo公司)；熒光倒置熒光顯微鏡(IX71型，日本Olympus公司)；透射電鏡(H-7650型，日本Hitachi公司)。

1.2 方法

1.2.1 透射電鏡的觀察 用0.01 mol/L PBS(pH=7.4)分別配制0.1 mg/mL RADA16-I、0.5 mg/mL Matrigel及0.06 mg/mL Collagen I，滴于透射電鏡專用銅格上，用1%磷鎢酸進行負(fù)染，室溫晾干后透射電鏡觀察。

1.2.2 細(xì)胞粘附試驗 參照文獻[7]包被和水化基底膜，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/mL，分別將100 μL細(xì)胞懸液接種于包被BSA、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)、RADA16-I、Collagen I和Matrigel的96孔培養(yǎng)板中，37 ℃常規(guī)培養(yǎng)1 h后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入10 μL MTT(5g/mL)試劑及100 μL培養(yǎng)液，37 ℃避光孵育4 h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO溶液，震蕩后于492 nm波長處測各孔吸收光度值，按照公式：細(xì)胞粘附率(%)=(待測細(xì)胞OD-空白OD)/(對照細(xì)胞OD-空白OD)×100%，計算粘附率。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng) 用0.25%胰酶消化獲取細(xì)胞。將細(xì)胞分別與RADA16-I、Matrigel、Collagen I混合，3種支架材料終濃度分別為5、5、1.5 mg/mL，細(xì)胞終密度為1×106/mL。接種于RADA16-I中的細(xì)胞需用10%蔗糖洗滌1次，然后與RADA16-I水溶液混合，接種于培養(yǎng)板后，立即加入培養(yǎng)液，以促進RADA16-I發(fā)生自組裝形成水凝膠，2 h后換液1次。其余兩種材料與細(xì)胞混合后，需放置37 ℃培養(yǎng)箱2 h，再加入培養(yǎng)基。所有細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2及飽和濕度常規(guī)培養(yǎng)，隔天換液。

1.2.4 細(xì)胞活性觀察 取培養(yǎng)第3天的細(xì)胞-凝膠團，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min后，再用PBS洗3次，加入 0.3%Triton X-100室溫放置5 min，PBS洗3次，加入2 μmol/L的鈣黃綠素AM至完全淹沒凝膠，避光孵育45 min，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞活性。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)觀察 取培養(yǎng)第6天的細(xì)胞-凝膠團，PBS洗滌3次，用4%多聚甲醛室溫固定15 min后，再用PBS洗3次，加入 0.3%Triton X-100室溫放置5 min，PBS洗3次，加入8.3 μg/mL鬼筆環(huán)肽與細(xì)胞凝膠團室溫作用20 min，PBS洗3次，加入2.5 μg/mL DAPI室溫作用10 min，PBS漂洗3次，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.6 細(xì)胞DNA量的測定 取培養(yǎng)第3、6、9天的細(xì)胞-凝膠團，PBS洗滌后置于檸檬酸鹽緩沖液中，-80 ℃儲存。實驗前反復(fù)凍融并振蕩直至細(xì)胞完全溶解。按照試劑盒說明書操作，并以不同細(xì)胞密度所測得DNA含量制作細(xì)胞密度與DNA之間的校正曲線。

1.2.7 細(xì)胞粘附分子表達檢測 細(xì)胞培養(yǎng)至第6天，4%多聚甲醛固定細(xì)胞-凝膠團，乙醇梯度脫水后進行石蠟包埋、切片(5 μm)。切片常規(guī)脫蠟水化，3%過氧化氫室溫下孵育10 min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液微波加熱10 min，自然冷卻。2% BSA室溫封閉60 min，阻斷非特異性抗原，滴加E-cadherin(1∶500)、N-cadherin(1∶400)和Integrin-β1(1∶250)一抗工作液4℃過夜。16 h后取出，37 ℃復(fù)溫30 min，滴加HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶50)工作液，37 ℃孵育60 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，分化返藍，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片，觀察拍照。

1.2.8 ELISA檢測細(xì)胞相關(guān)因子 細(xì)胞培養(yǎng)至第4天時，無血清培養(yǎng)基漂洗1次，更換完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至第6天，收集上清，離心分裝，-20℃儲存。按照試劑說明書對細(xì)胞相關(guān)因子(VEGFA、EGF、FGF2、IGF1)進行檢測，每個樣本3個復(fù)孔。

1.2.9 細(xì)胞氧活性檢測 細(xì)胞培養(yǎng)至第8天，按照試劑盒說明書加入10 μmol/L DCFH-DA至完全淹沒凝膠，37 ℃孵育20 min，無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌3次，熒光顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果

2.1 透射電鏡表征細(xì)胞支架材料的結(jié)構(gòu)特征 透射電鏡下可見RADA16-I、Matrigel和Collagen I呈長短不一的纖維狀態(tài)，并且各纖維交錯形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與Collagen I和Matrigel相比較，RADA16-I所形成的納米纖維較長，所形成的纖維網(wǎng)架結(jié)構(gòu)也較密集(見圖1)。

圖1 透射電鏡下細(xì)胞支架材料的結(jié)構(gòu)特征觀察

2.2 細(xì)胞對不同支架基質(zhì)的粘附率 從圖2可見，細(xì)胞對RADA16-I的粘附率相似于Matrigel及Collagen I(P>0.05)，而均高于FN(P<0.05)。這說明化學(xué)合成的RADA16-Ⅰ與動物來源的基質(zhì)材料相似，也有助于細(xì)胞的粘附，為后續(xù)納米自組裝短肽水凝膠中卵巢癌細(xì)胞生物學(xué)性狀的研究奠定了基礎(chǔ)。

2.3 細(xì)胞在不同支架材料上的形態(tài)及活力觀察 細(xì)胞與支架材料混合后培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下每天觀察細(xì)胞生長情況。培養(yǎng)第1天可見細(xì)胞定植在支架材料凝膠中的不同層面上，細(xì)胞分布均勻，呈球形。培養(yǎng)第3天可見局部有小細(xì)胞團形成，并且細(xì)胞團隨培養(yǎng)時間延長而增大，在整個培養(yǎng)過程中凝膠內(nèi)細(xì)胞始終保持球形樣外觀(見圖3A)。

圖2 不同支架材料對A2780細(xì)胞的粘附率

通過鈣黃綠素-AM染色了解細(xì)胞在不同支架材料中的活性，可見細(xì)胞在各支架材料中分布均勻，且活性較好(見圖3B)。鬼筆環(huán)肽/DAPI復(fù)染結(jié)果顯示，細(xì)胞在RADA16-I和Matrigel中均呈不規(guī)則球形聚集，細(xì)胞核呈無規(guī)則排列，其中RADA16-I中有部分細(xì)胞向外伸展，而在Collagen I中細(xì)胞核聚集成梭形(見圖3C)，提示細(xì)胞基質(zhì)對細(xì)胞的形態(tài)形成有一定影響。

A：培養(yǎng)第3天的細(xì)胞生長情況；B：培養(yǎng)第3天的細(xì)胞鈣黃綠素-AM染色；C：培養(yǎng)第6天的細(xì)胞鬼筆環(huán)肽/DAPI復(fù)染,×200。圖3 A2780細(xì)胞在不同細(xì)胞支架材料中顯微鏡觀察結(jié)果

2.4 細(xì)胞在不同支架材料上的增殖情況 通過測定第3、6、9天不同支架材料中培養(yǎng)細(xì)胞的DNA量，了解細(xì)胞在3種不同支架材料中的增殖情況。由圖4可見，卵巢癌細(xì)胞A2780在3種支架材料中均保持一定的生長速率，Matrigel和Collagen I中的細(xì)胞始終保持快速增殖，特別是Matrigel中細(xì)胞DNA量始終保持最高增長率，而RADA16-I中的細(xì)胞雖保持活躍增殖，但不及在Matrigel和Collagen I中增殖速度快。

圖4 A2780細(xì)胞在不同細(xì)胞支架材料中的增殖情況

2.5 不同三維體系中粘附分子表達情況 通過免疫組織化學(xué)法分析3種支架材料中細(xì)胞相關(guān)粘附分子的表達情況，研究結(jié)果顯示，細(xì)胞培養(yǎng)至第8天時，在RADA16-I中，整合素β1、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白的表達均為陽性。在3種材料中，整合素β1在Matrigel中表達最高，Collagen-I次之，RADA16-I最少(見圖5A)，而E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白在Collagen-I中表達最高，Matrigel次之，RADA16-I最少(見圖5B、C)。

A：整合素β1；B：E-鈣黏蛋白；C：N-鈣黏蛋白。圖5 A2780細(xì)胞在不同細(xì)胞支架材料中粘附分子表達情況(×200)

2.6 不同三維體系中細(xì)胞相關(guān)因子表達水平 通過ELISA法檢測3種材料中細(xì)胞相關(guān)因子(VEGFA、EGF、FGF2、IGF1)的分泌情況，結(jié)果顯示：在3種培養(yǎng)體系中，4種血管生成因子均有分泌，其中在RADA16-I三維培養(yǎng)體系中，F(xiàn)GF2的分泌水平與Matrigel和Collagen I相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖6C),但IGF1的表達水平均高于Matrigel和Collagen I(P<0.05)，EGF高于Matrigel培養(yǎng)體系(P<0.05)，而VEGFA的分泌與之相反，均低于另外兩種培養(yǎng)體系(見圖6A、B、D)。

2.7 不同細(xì)胞支架內(nèi)細(xì)胞氧活性的檢測 通過活性氧檢測支架中細(xì)胞內(nèi)氧活性情況發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)過程中RADA16-I中的細(xì)胞與Matrigel和Collagen I中的細(xì)胞氧活性近似，均顯示良好(見圖7)。此外，實驗中還發(fā)現(xiàn)隨著細(xì)胞團增大，位于支架中央的細(xì)胞氧活性逐漸減弱。

A：VEGFA；B：EGF；C：FGF2；D：IGF1。圖6 不同支架材料中細(xì)胞相關(guān)因子表達水平

圖7 A2780細(xì)胞在不同細(xì)胞支架材料中培養(yǎng)第8天的細(xì)胞內(nèi)活性氧情況(×200)

3 討論

RADA16-I是納米自組裝短肽生物合成材料中具有代表性的短肽，由極性和非極性氨基酸(精氨酸—丙氨酸—天冬氨酸—丙氨酸)交替排列組成，根據(jù)分子親水面上帶“正”電或“負(fù)”電氨基酸殘基的排列順序，電荷分布類型為+-+-。當(dāng)其溶于去離子水時，可形成極強的β片層二級結(jié)構(gòu)，加入電解質(zhì)溶液時，會導(dǎo)致自組裝快速發(fā)生，促使這些β片層結(jié)構(gòu)形成具有5～200 nm大小孔隙的含水量>99%納米級三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)。本研究在透射電鏡下可見RADA16-I在PBS溶液作用下發(fā)生自組裝，與Matrigel和Collagen Ⅰ兩種溫敏型水凝膠相比，RADA16-I的纖維較長且形成密集的網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)類似于高分子聚合物載體，允許一些小分子物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、氣體、營養(yǎng)物質(zhì)及生長因子緩慢擴散[8-10]。此外，RADA16-I成膠因受離子影響，相比溫敏型水凝膠在實驗操作上更易控制，且易塑形。

在體內(nèi)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrice, ECM)構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，支持并連接于組織，調(diào)節(jié)組織的發(fā)生和細(xì)胞的生理功能。Matrigel和Collagen Ⅰ是常用的天然生物材料，富含構(gòu)成ECM的組分，有利于腫瘤細(xì)胞的生長。RADA16-Ⅰ為化學(xué)合成材料，但是其序列設(shè)計類似于細(xì)胞膜上整合素的配體結(jié)合位點RGD多肽序列，這有利于細(xì)胞黏附。本研究顯示A2780細(xì)胞在RADA16-Ⅰ材料中活性較好，能形成細(xì)胞微球體，這種生長方式類似于卵巢癌細(xì)胞在體內(nèi)聚集形成的實體瘤，說明RADA16-Ⅰ能為A2780細(xì)胞提供類似于天然生物材料的微環(huán)境。

粘附是腫瘤細(xì)胞侵襲的始動步驟，細(xì)胞粘附分子與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及耐藥性等都有著密切的關(guān)系[11-12]。A2780細(xì)胞在RADA16-Ⅰ材料中生長時，既有較好的氧活性，又能維持細(xì)胞粘附分子(整合素β1、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白)和細(xì)胞相關(guān)因子(VEGFA、EGF、FGF2、IGF1)的分泌與表達，這說明該三維材料能較好地維持腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的穩(wěn)定，適合用于卵巢癌相關(guān)機制的研究。本研究中發(fā)現(xiàn)，在RADA16-Ⅰ材料中A2780細(xì)胞增殖較Matrigel和Collagen Ⅰ慢，分析原因可能是由于Matrigel和Collagen Ⅰ來源于動物，通常不可避免的含有殘留的生長因子或不明組分的其他雜質(zhì)，而RADA16-Ⅰ是人工合成的生物材料，其成份清楚單一，不含有任何不確定的能促進腫瘤細(xì)胞生長的生物因子，其培養(yǎng)體系更利于體外培養(yǎng)分析細(xì)胞生物學(xué)特征和腫瘤相關(guān)機制的研究。

綜上所述，納米自組裝短肽RADA16-Ⅰ在離子作用下能夠自組裝形成納米級纖維網(wǎng)絡(luò)，該支架材料適合A2780細(xì)胞體外三維培養(yǎng)研究。此外，基于自組裝短肽基本結(jié)構(gòu)單位易于設(shè)計和修改的特性，下一步還可以根據(jù)卵巢癌細(xì)胞的特征，通過改變氨基酸序列、帶電性質(zhì)及與特殊功能的配基結(jié)合等方法，為卵巢癌細(xì)胞量身打造支架材料，提供近似于體內(nèi)生長的微環(huán)境。