李 菲，劉義偉，李祖高，張洋洋，石京山

(遵義醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，老年癡呆的主要類型，是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，早期臨床表現(xiàn)為近期記憶障礙，隨著疾病發(fā)展，呈現(xiàn)進(jìn)行性加重的認(rèn)知障礙，從而困擾著中老年人的身心健康。AD典型的病理特征包括β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)沉積、tau蛋白過度磷酸化、特定腦區(qū)神經(jīng)細(xì)胞丟失等[1]。其中，Aβ在AD的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，因而，減少腦內(nèi)Aβ沉積仍是防治AD的重要策略。

蛇床子為傘形科草本植物蛇床的果實(shí)，其主要化學(xué)成分蛇床子素(osthole，OST)具有抗炎、鎮(zhèn)靜、抗腫瘤、降血壓、抗心律失常、保護(hù)神經(jīng)元等作用[2-6]，并能夠改善動(dòng)物記憶損害[7]。為進(jìn)一步驗(yàn)證OST抗癡呆的作用及機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠觀察OST干擾后小鼠的認(rèn)知功能及行為的改變，并分析OST對(duì)AD典型病理特征Aβ的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)APP/PS1雄性轉(zhuǎn)基因小鼠16只，同齡同性別野生型(wild type，WT)小鼠8只，購于江蘇集萃藥康生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 蛇床子素(純度99.90%)購于MCE(MedChemExpress)，批號(hào)：HY-N0054；Aβ1-42、Aβ1-40、APP、ADAM10、BACE1、β-actin抗體購于Abcam公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 動(dòng)物分組 WT對(duì)照組(WT，n=8)、APP/PS1對(duì)照組(APP/PS1，n=8)、APP/PS1+OST給藥組(APP/PS1+OST，n=8)。自小鼠9月齡始每天給予OST 10 mg/kg，對(duì)照組小鼠給予同等體積的雙蒸水，每日灌胃給藥1次，連續(xù)12周。

1.3.2 筑巢行為實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行筑巢行為實(shí)驗(yàn)時(shí)，小鼠單籠操作，更換新玉米芯顆粒墊料并均勻鋪開，加入筑巢用軟紙，分別于6、12、24 h觀察動(dòng)物筑巢行為。根據(jù)課題組前期實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)對(duì)筑巢評(píng)分文獻(xiàn)[8]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行調(diào)整，本實(shí)驗(yàn)采用4分法對(duì)動(dòng)物筑巢行為進(jìn)行評(píng)價(jià)：1分，沒有可見的巢；2分，有不明顯的巢，筑巢用紙較散亂，占據(jù)空間超過籠子的1/2；3分，中等程度的巢，可見較為明顯的巢，筑巢用紙占據(jù)空間超過籠子的1/3不足1/2；4分，完整的巢，可見碗狀巢，或者筑巢用紙占據(jù)空間不超過籠子的1/3。

1.3.3 Morris水迷宮 白色圓形水盆劃分為4象限，隱藏平臺(tái)(水下2 cm)置于第三象限。前4 d行定位航行實(shí)驗(yàn)：小鼠頭向上面朝盆壁入水，記錄小鼠找到隱藏平臺(tái)的時(shí)間，若60 s內(nèi)未找到則引導(dǎo)其至平臺(tái)。使小鼠停留于平臺(tái)10 s。每只小鼠每天訓(xùn)練3次，每次從不同象限入水(除平臺(tái)所在的第三象限)，訓(xùn)練間隔1 h。第5天為空間探索：移除平臺(tái)，允許小鼠自由游泳60 s，記錄小鼠在原平臺(tái)所在象限的停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)位置的次數(shù)。最后通過系統(tǒng)記錄的相應(yīng)指標(biāo)，進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

1.3.4 形態(tài)學(xué)觀察 小鼠深度麻醉后透心灌注取腦組織進(jìn)行石蠟包埋，行冠狀面連續(xù)切成5 μm的切片，進(jìn)行Nissl染色。光學(xué)顯微鏡觀察海馬CA3及DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量；每張切片計(jì)數(shù)3個(gè)不同視野的神經(jīng)元。

1.3.5 Western blot檢測(cè) 提取小鼠海馬組織總蛋白，SDS-PAGE膠分離蛋白后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%的脫脂奶室溫封閉90 min后用Aβ1-42、Aβ1-40、APP、ADAM10、BACE1、β-actin抗體(1∶2 000)置于4 ℃冷庫孵育12 h，再用相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，經(jīng)ECL反應(yīng)，最后采用Quantity One 全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行曝光顯影，并以β-actin為內(nèi)參對(duì)目的條帶灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 OST對(duì)APP/PS1小鼠筑巢行為的影響 給藥期間每月觀察1次小鼠筑巢行為，每次觀察3個(gè)時(shí)間點(diǎn)：6、12、24 h。最后1次筑巢行為結(jié)果如圖1所示，APP/PS1小鼠與WT小鼠相比筑巢行為略微變差，給予OST灌胃后小鼠筑巢行為有所改善，可見較為完整的巢穴，但筑巢行為評(píng)分在各組小鼠間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 OST對(duì)APP/PS1小鼠筑巢行為的影響

2.2 OST對(duì)APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響 結(jié)果如圖2所示：定位航行試驗(yàn)中各組小鼠隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，找到平臺(tái)所需要時(shí)間逐漸縮短。訓(xùn)練至第4天，APP/PS1對(duì)照組小鼠逃避潛伏期明顯長于WT對(duì)照組小鼠(P<0.05)，給予OST后，逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05,見圖2A)。第5天的空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見圖2B)顯示，APP/PS1對(duì)照組小鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間百分比明顯低于WT對(duì)照組小鼠，給予OST則明顯改善。

A：定位航行成績；B：空間探索成績；n=8，#：P<0.05，##：P<0.01 vs WT；*：P<0.05 vs APP/PS1。圖2 OST對(duì)APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的影

2.3 OST對(duì)小鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量的影響 結(jié)果如圖3所示：WT對(duì)照組小鼠海馬CA3及DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)完好、排列緊密整齊；APP/PS1小鼠神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損壞、排列松散且紊亂；給予OST后使神經(jīng)元形態(tài)得以改善。對(duì)各組小鼠海馬CA3及DG區(qū)域存活神經(jīng)元進(jìn)行量化分析發(fā)現(xiàn)，APP/PS1小鼠存活神經(jīng)元數(shù)量明顯減少(P<0.01)，給予OST后明顯的抑制了神經(jīng)元的丟失(P<0.05)。

2.4 OST對(duì)小鼠海馬組織Aβ的影響

2.4.1 OST對(duì)小鼠海馬組織Aβ含量的影響 Western blot法檢測(cè)小鼠海馬組織中Aβ含量，結(jié)果(見圖4)顯示APP/PS1對(duì)照組小鼠海馬組織Aβ1-40及Aβ1-42含量明顯高于WT小鼠(P<0.01)，而OST則明顯降低Aβ1-40及Aβ1-42的含量(P<0.01)。

上圖：尼氏染色代表圖；下圖：海馬CA3和DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量統(tǒng)計(jì)圖；n=4，##：P<0.01 vs WT；*：P<0.05 vs APP/PS1。圖3 OST對(duì)APP/PS1小鼠海馬CA3和DG區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)量的影響

Aβ1-40和Aβ1-42蛋白的代表性條帶及其灰度值分析結(jié)果；n=4，##：P<0.01 vs WT；**：P<0.01 vs APP/PS1。圖4 OST對(duì)小鼠海馬組織Aβ含量的影響

2.4.2 OST對(duì)小鼠海馬組織Aβ產(chǎn)生的影響 Aβ主要由APP經(jīng)酶切途徑產(chǎn)生，本實(shí)驗(yàn)觀察了APP的含量及其淀粉樣剪切途徑的限速酶BACE1及非淀粉樣剪切途徑的關(guān)鍵酶ADAM10的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果(見圖5)顯示，與WT小鼠相比，APP/PS1小鼠海馬組織APP、BACE1蛋白水平明顯增加，而ADAM10卻明顯降低(P<0.01)；經(jīng)OST治療后明顯降低APP、BACE1蛋白水平，增加ADAM10的蛋白表達(dá)(P<0.01)。

APP、BACE1和ADAM10蛋白表達(dá)水平的代表性條帶及其灰度值分析結(jié)果；n=4，#：P<0.05，##：P<0.01 vs WT；*：P<0.05，**：P<0.01 vs APP/PS1。圖5 OST對(duì)小鼠海馬組織APP含量及其剪切途徑的影響

3 討論

本實(shí)驗(yàn)APP/PS1小鼠至12月齡時(shí)出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶功能減退、海馬神經(jīng)元數(shù)量丟失及海馬組織Aβ增多等特征。自9月齡始給予OST 10 mg/kg體重連續(xù)12周后，明顯改善了APP/PS1小鼠認(rèn)知功能的缺陷，預(yù)實(shí)驗(yàn)采用OST 5、10和20 mg/kg灌胃小鼠，發(fā)現(xiàn)OST 10和20 mg/kg時(shí)動(dòng)物的一般表現(xiàn)較為正常，考慮的老齡APP/PS1小鼠的珍貴性，本實(shí)驗(yàn)僅選用了OST 10 mg/kg這一有效量進(jìn)行OST作用的分析。給予OST后APP/PS1小鼠行為改變表現(xiàn)為Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)OST小鼠找到平臺(tái)所需的時(shí)間減少；空間探索實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示OST小鼠在原平臺(tái)所在項(xiàng)目的停留時(shí)間百分比及跨越原平臺(tái)位置的次數(shù)明顯增加，說明OST具有抗AD的作用，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。小鼠筑巢行為受多個(gè)腦區(qū)的共同調(diào)節(jié)，集體筑巢行為反映小鼠的社交行為，而個(gè)體筑巢行為反映小鼠與情景記憶相關(guān)的執(zhí)行功能及其他的非認(rèn)知功能。AD小鼠腦內(nèi)因Aβ的沉積破壞了多腦區(qū)的功能可能會(huì)出現(xiàn)筑巢行為的異常，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示12月齡APP/PS1小鼠筑巢功能評(píng)分有下降趨勢(shì)，但與同齡野生型小鼠相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。既往有研究報(bào)道[9]Tg2576小鼠(一種AD模式小鼠)個(gè)體筑巢行為至12月齡時(shí)沒有明顯的改變，但集體筑巢行為受到損傷。個(gè)體筑巢行為的影響因素比集體筑巢行為復(fù)雜，涉及小鼠的基因背景、生長及飼養(yǎng)環(huán)境、筑巢材料及實(shí)驗(yàn)方法等均會(huì)不同程度的影響小鼠的個(gè)體筑巢行為。加之本實(shí)驗(yàn)采用動(dòng)物數(shù)量的限制，每組僅8只小鼠，可能樣本量不足也是原因之一，另外本實(shí)驗(yàn)僅觀察了小鼠個(gè)體筑巢行為，這樣導(dǎo)致筑巢行為部分相關(guān)信息被掩蓋。當(dāng)然還有其他可能的關(guān)鍵因素，并未從本實(shí)驗(yàn)中獲知。

AD 腦內(nèi)呈現(xiàn)明顯的海馬組織神經(jīng)元缺失[10-11]。尼氏小體是神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi)的一種特征性結(jié)構(gòu)，當(dāng)神經(jīng)元受到損傷時(shí)，尼氏小體數(shù)量減少，形態(tài)改變，甚至溶解，Nissl染色呈藍(lán)色團(tuán)塊或顆粒狀，以此特征性觀察神經(jīng)元形態(tài)并判斷存活神經(jīng)元的數(shù)量。本結(jié)果顯示APP/PS1小鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量顯著減少且形態(tài)萎縮、排列紊亂，而OST改善了海馬神經(jīng)元的形態(tài)，存活的神經(jīng)元數(shù)量多于APP/PS1小鼠。

Aβ在細(xì)胞外異常增加并沉積成老年斑是AD的特征性病理變化[10-11]，而Aβ的產(chǎn)生主要是由APP 經(jīng)淀粉樣途徑剪切而成，其中Aβ1-42及Aβ1-40易于在腦內(nèi)聚集，引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞毒性[12]。腦內(nèi)異常增多的Aβ導(dǎo)致神經(jīng)元受損丟失，且損傷程度與Aβ含量密切相關(guān)[13]。本實(shí)驗(yàn)中，12月齡的APP/PS1小鼠與野生型小鼠相比，海馬組織Aβ1-42及Aβ1-40含量均增加，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14-15]。而OST有效地減少了APP/PS1小鼠海馬組織的Aβ負(fù)擔(dān)。APP經(jīng)淀粉樣剪切途徑的限速酶BACEI和γ-分泌酶剪切后，產(chǎn)生具有神經(jīng)毒性的Aβ。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示APP/PS1小鼠海馬組織不僅APP蛋白水平增加，BACEI蛋白表達(dá)水平也顯著增加，給予OST后，降低了APP和BACEI蛋白表達(dá)，提示OST降低Aβ的含量與減少其產(chǎn)生有關(guān)。最近報(bào)道顯示，OST明顯降低APP的蛋白水平，并認(rèn)為與OST上調(diào)miRNA-101a-3p從而導(dǎo)致APP的mRNA下降有關(guān)[16]。ADAM10屬于解聚素和金屬蛋白酶家族，具有促進(jìn)胚胎大腦發(fā)育和海馬神經(jīng)再生的作用。ADAM10剪切APP不產(chǎn)生神經(jīng)毒性的Aβ。且ADAM10蛋白表達(dá)的減少與AD密切相關(guān)，說明ADAM10在AD病理過程中起著重要的作用[15]。本實(shí)驗(yàn)APP/PS1小鼠海馬組織ADAM10蛋白表達(dá)較同月齡的野生型小鼠少，給予OST后增加了ADAM10的蛋白表達(dá)。這些結(jié)果提示OST可能通過減少APP的蛋白水平，增加APP的非淀粉樣途徑剪切，減少APP的淀粉樣途徑剪切，從而減少AD小鼠海馬組織Aβ的含量。當(dāng)然，對(duì)于AD另一特征性病理變化tau蛋白的高度磷酸化，也有報(bào)道顯示OST能夠降低AD模型小鼠腦內(nèi)tau蛋白的磷酸化水平[17]。

綜上所述，OST具有改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的作用，并對(duì)AD特征性病理改變也具有明顯的減輕作用。綜合文獻(xiàn)報(bào)道和本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示OST有望成為防治AD的候選化合物。